Apostila de aulas práticas

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 
INSTITUTO BIOMÉDICO 
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA 
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APOSTILA 
DE 
AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
- DISCIPLINA - 
BACTERIOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ORIENTADOR DIDÁTICO: PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA 
 
Roteiros de aulas Práticas: 
 
 
ASSUNTO 1: Material utilizado nas práticas 
Técnicas e Processo de Assepsia 
Microscopia 
 
ASSUNTO 2: Meios de Cultura e Técnicas de Semeadura 
 
ASSUNTO 3: Esterilização e Desinfecção 
 
ASSUNTO 4: Diluição 
Contagem de UFC viáveis 
Obtenção de Cultura pura 
 
ASSUNTO 5: Coloração Simples 
Morfologia 
 
 
ASSUNTO 6: Coloração de Gram 
 
ASSUNTO 7: Identificação de Cocos Gram positivos 
 
ASSUNTO 8: Colimetria: Exame microbiológico da Água 
 
ASSUNTO 9: Provas Bioquímicas para Idenitifcação de Bacilos Gram 
Negativos 
 
ASSUNTO 10: Teste de Sensibilidade a Antibióticos 
 
ANEXO I 
Técnicas de Coloração 
Coloração de Gram 
Coloração de Zihel-Neelsen (BAAR) 
Técnica Para Evidenciação de Espiroquetas 
 Método de Albert-Laybourn 
 
 
 
1 
 
 
 
4 
 
8 
 
14 
 
 
 
15 
 
 
 
19 
 
23 
 
30 
 
37 
 
 
 42 
 
45 
45 
45 
48 
50 
53
 
 
APRESENTAÇÃO 
 
O aprendizado teórico e prático de microbiologia, incluindo a bacteriologia, é muito 
importante para o profissional farmacêutico. As áreas de atuação em análises clínicas, 
enzimologia, controle microbiológico de medicamentos e alimentos, entre outras, 
exigem um profundo conhecimento desta disciplina. 
Muitas vezes os alunos não percebem a importância da bacteriologia, pois como o curso 
é ministrado durante o ciclo básico, há uma grande distância entre o curso de 
bacteriologia e as demais disciplinas nela embasadas durante o curso de graduação. Ao 
chegarem ao ciclo profissional percebem o quão fundamental ela é para o entendimento 
de outras disciplinas, assim como, para seu futuro profissional. 
A presente apostila resulta do processo de atualização e aperfeiçoamento da apostila de 
aulas práticas de bacteriologia para o curso de Farmácia. A apostila contém explicações 
teóricas e práticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e 
didática. No final de cada assunto o aluno poderá tirar as suas conclusões da prática 
executada. Sempre que possível procurou-se utilizar esquemas, gravuras e ilustrações 
que facilitassem a compreensão do assunto. 
Cada assunto apresenta uma introdução contendo a teoria do tema abordado, assim 
como a sua aplicação e importância no exercício da profissão, objetivando o melhor 
entendimento do tema, dos materiais a serem utilizados, da execução e dos resultados 
obtidos. 
Finalmente procurou-se acentuar a importância e aplicação de cada prática no contexto 
das atividades de um farmacêutico de modo a estimular o aprendizado. 
 
 1 
 
ASSUNTO 1: 
- Material utilizado nas práticas de Bacteriologia. 
- Técnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia. 
- Microscopia. 
 
INTRODUÇÃO: 
 
TÉCNICA E PROCESSO DE ASSEPSIA 
 
 É importante ter claro os procedimentos que se deve adotar na manipulação 
segura dos meios, culturas bacterianas, etc, de modo a evitar qualquer tipo de 
contaminação. Tais procedimentos são denominados genericamente de técnicas de 
assepsia e incluem: 
 
 Ä fazer a desinfecção da área de trabalho e a antissepsia das mãos sempre antes e 
depois de trabalhar (1); 
 
 Ä trabalhar sempre na área de segurança (aproximadamente 10cm) em volta da 
chama do bico de Bunsen (2); 
 
 Ä esterilizar adequadamente alças e agulhas de inoculação antes e depois do seu 
uso, evitando a criação de aerossóis, para isso aquecendo sempre da base para a 
ponta (3); 
 
 Ä flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculações (4). 
 
 
 
 
BACTÉRIAS NO AMBIENTE 
 
A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na 
água, no ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). A manipulação 
e conservação incorretas de medicamentos são fatores predisponentes à sua 
contaminação por microrganismos. Dentre estes podem estar presentes microrganismos 
patogênicos ou microrganismos deterioradores. 
 
Fundamentação Teórica 
A presença de bactérias é uma constante nos mais variados ambientes. Freqüentemente 
tais bactérias não estão associadas a nenhum prejuízo. A microbiota intestinal 
desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas infecções; existem 
 
 2 
 
estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das defesas 
imunológicas. Ao mesmo tempo que desenvolve atividades benéficas a microbiota pode 
ser responsável por uma série de doenças oportunistas que podem ser relacionadas, por 
exemplo, ao uso constante de drogas imunossupressoras, antibióticos e internações em 
UTI. 
Muitas infecções causadas por bactérias são adquiridas por contato direto ou veiculadas 
por alimentos. Ao contrário do que se pensava antigamente, a disseminação de bactérias 
patogências pelo ar e poeira não ocorre com grande freqüência, pois de um modo geral, 
não sobrevivem por longos períodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de 
transmissão podem ser de grande importância em determinadas situações. No caso de 
bactérias esporuladas a transmissão aérea é mais importante. No ambiente hospitalar 
deve ser feito o controle microbiano frequentemente para evitar contaminações. Os 
alimentos são uma importante via de transmissão de doenças bacterianas como a 
shigelose, salmonellose, cólera e várias outras. O farmacêutico deve estar atento 
sempre. 
 
OBJETIVOS: 
 
1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratório de 
Microbiologia. 
2- Executar técnicas de preparo de material e montagem para esterilização. 
3- Treinar técnicas de distribuição asséptica. 
4- Evidenciar a existência de bactérias no ar, roupas, etc. 
5- Explanação sobre o microscópio. 
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de constatar a presença de 
bactérias no ambiente; compreender a importância dos critérios básicos de higiene no 
ambiente hospitalar e, na produção e manipulação de medicamentos, visando evitar a 
contaminação dos mesmos por bactérias ambientais; 
 
MATERIAL: 
 
- Vidrarias. 
- Outros materiais de uso em um laboratório de Microbiologia. 
- Água peptonada. 
- Placas de Petri com Agar simples. 
- Pipetas e tubos de ensaio estéreis. 
- Papel, barbante, algodão cardado, gaze. 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR: 
 
a. Apresentação da vidraria e outros objetos de uso freqüente nos laboratórios de 
Microbiologia. 
b. Demonstração, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos 
microbiológicos. 
c. Cada grupo de alunos treinar, com água peptonada, as técnicas de distribuição 
asséptica, usando pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mínimo 48 
horas. 
 
 
 3 
 
d. Abrir as placas de Agar simples (1 por grupo), fora da área de segurança, deixando 
cada uma por 5’, 10’, 15’ e 20’, fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 
37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
e. Evidenciar bactérias da pele, roupa, bancada em meio Agar simples. 
Inocular em cada quadrante, respectivamente: 
- a impressão do dedo polegar 
- um “carimbo” do tecido do jaleco 
- alguns fios de cabelo 
- um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho 
Incubar a 37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido 
 
 
 
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______________________________________________________________________ 
5 min 10 min 15 min 20 min 
 1.º 
 DEDO 
 2.º 
JALECO 
 3.º 
BANCADA 
 4.º 
CABELO 
 
 4 
 
ASSUNTO 2: 
- Meios de Cultura 
- Técnicas de Semeadura 
 
INTRODUÇÃO: 
 
 O estudo das bactérias necessita normalmente do seu prévio isolamento e 
identificação. Para tanto diversos meios de cultura são utilizados. Define-se meio de 
cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrogênio, sais 
minerais e água, que propiciam o crescimento in vitro de bactérias. A maioria das 
bactérias cresce em meios de cultura. Exceções são as riquétsias e clamídias que por 
serem parasitas intracelulares obrigatórios só se desenvolvem in vitro em meios 
celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema 
pallidum. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de 
semeadura. Toda a manipulação de culturas bacterianas, meios e instrumental 
necessário deve ser feita seguindo-se procedimentos básicos de assepsia e antissepsia, 
visando evitar qualquer tipo de contaminação. 
 
MEIOS DE CULTURA 
 
Para uma melhor compreensão das diversas finalidades e usos dos meios de cultura, 
apresentamos a seguir uma breve classificação dos mesmos: 
 
A) Quanto à composição: 
A.1) Naturais – são aqueles de origem vegetal (um pedaço de batata, pão, frutas) 
ou animal (gema de ovo). 
A.2) Artificiais – são aqueles constituídos de substâncias químicas podendo ser 
definidos ou indefinidos (complexos). 
 Ä Definidos: é sabido toda a sua composição. 
 Ä Indefinidos ou Complexos: é desconhecido por si. Sabe-se apenas 
aproximadamente. Os meios utilizados na rotina são complexos. 
 
B) Quanto ao seu estado físico: 
Ä Líquido – são os caldos, desprovidos de agar. 
Ä Semi-sólido – são aqueles que apresentam em sua composição até 1% de agar. 
Ä Sólido – são aqueles que apresentam em sua composição 1,5 a 2,5% de agar. 
 
C) Quanto à finalidade e características: 
ÄSimples – contém apenas componentes básicos para o crescimento de uma 
bactéria. 
Ä Enriquecido – meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a 
bactéria pela adição de substâncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro,, 
leite. De uso freqüente para bactérias de difícil crescimento (fastidiosas). 
Ä De enriquecimento – meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactérias 
acompanhantes e permitir o crescimento da bactéria alvo que pretende-se 
posteriormente isolar aumentando assim a proporção desta em relação às demais. 
Por ser um meio líquido não destina-se ao isolamento da bactéria. 
 
 5 
 
Ä Seletivo – contêm substâncias seletivas que inibem o crescimento de certas 
bactérias e permitem o crescimento de outras. São meios sólidos e têm como 
objetivo isolar culturas puras. 
Ä Indicadores – meios que permitem a diferenciação visual do crescimento 
bacteriano facilitando a sua identificação. Freqüentemente os meios seletivos são 
também indicadorese todos os meios utilizados na confirmação bioqumica dos 
isolamentos são indicadores. A indicação mais freqüente é a alteração de cor do 
meio por mudança no pH do mesmo, podendo ainda ser a produção de gás, 
precipitação de componentes do meio por atividade proteolítica e lipolítica, etc... 
Ä Estoque – são meios normalmente semi-sólidos com a finalidade de preservar 
uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizações no laboratório. 
 
TÉCNICAS DE SEMEADURA MAIS EMPREGADAS NA ROTINA 
 
I- Semeadura em meios sólidos 
 
A. Meio Inclinado 
 
· Em estria sinuosa: semear com alça de platina, em ziguezague, partindo da base para a 
extremidade da superfície inclinada do meio 
Este tipo de semeadura permite a obtenção de melhor massa de microorganismos. 
 
· Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a 
extremidade da superfície inclinada do meio, ou em profundidade e superfície. 
Este tipo de semeadura é utilizada em provas bioquímicas para identificação bacteriana. 
 
B. Meios em pé (camada alta) 
 
· Em picada: com agulha de platina fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no 
centro do meio de cultura. 
Este tipo de semeadura é bastante utilizado para conservação de bactérias no 
meio de cultura e quando o meio utilizado é semi-sólido, esta semeadura é utilizada para 
a verificação da motilidade. 
 
 
 
C. Em Placa de Petri: 
 
C.1. Em superfície: 
 · Estrias múltiplas ou esgotamento: fazer o inoculo em um ponto da superfície 
do meio, flambar a alça, deixar esfriar e daí semear em ziguezague em toda a superfície 
do meio. 
 
 6 
 
Este tipo de semeadura é empregado para o isolamento bacteriano, obtenção de 
u.f.c. isoladas. Denomina-se técnica se esgotamento. 
 
 
 · Por distensão: com pipeta, colocar no centro da superfície do meio 0,1 mL da 
suspensão e espalhar uniformemente com swab ou alça de Drigalski. Com swab, 
obteremos crescimento confluente e com alça de Drigalski, utilizamos para contagem. 
 Utiliza-se este tipo de inoculação para realização de determinados testes, como 
por exemplo, o antibiograma. 
 
C.2. Em profundidade ou disseminação: 
 · Pour plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspensão bacteriana. 
Adicionar 10 mL do meio fundido em tubo de ensaio e resfriado a 45-50º C. 
Homogeneizar com movimentos giratórios da placa sobre uma superfície plana. 
 Utilizado, para isolamento, contagem e identificação bacteriana, conforme o 
meio de cultura utilizado. 
 
 D. Repique por pescaria: colônia em placa de Petri retirada através de uma 
agulha para um meio de cultura líquido ou sólido 
 Método empregado para isolamento bacteriano. 
 
 II. Semeadura em meios líquidos 
 
· Procedimento para remover microorganismos da cultura em meio líquido2: 
 
 
 7 
 
· Procedimento para inocular em caldo simples: 
 
· Difusão: com alça de platina ou pipeta, introduzir o inoculo ( ³ 0,1 mL) na massa 
do meio. Este tipo de semeadura é empregada para obtenção do crescimento 
bacteriano. É um repique normal. 
 
OBJETIVOS: 
 
1- Explanação sobre os principais meios de culturaempregados em laboratórios de 
Microbiologia 
2- Identificação das técnicas de semeadura mais empregadas na rotina 
bacteriológica 
3- Cultivo de bactérias com finalidade de obtenção de cultura pura, ou seja, uma 
população onde todas as bactérias se originam de uma única célula bacteriana. 
 
MATERIAL: 
 
- tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-sólido. 
- Placas de Petri com Agar simples. 
- Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri). 
- Alça e agulha de platina. 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR: 
 
Definir meio de cultura, cultivo e condições necessárias ao crescimento de 
microorganismos (pH, pressão osmótica, temperatura de incubação, etc.). 
Classificação dos meios de cultura quanto a origem, estado físico, força seletiva. 
Seqüência da preparação dos meios. 
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______________________________________________________________________ 
______________________________________________________________________ 
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ASSUNTO 3: 
- Esterilização e Desinfecção 
- Ação dos Agentes Físicos e Químicos sobre as Bactérias 
 
INTRODUÇÃO: 
 
As taxas de crescimento e morte microbianas são fortemente influenciadas 
por vários fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma série de 
procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir 
a multiplicação de microrganismos existentes em um determinado equipamento, 
ambiente, em alimentos ou em superfícies vivas. É de extrema importância 
apresentando inúmeras aplicações práticas na área médica e de alimentos. A 
conservação de medicamentos envolve sempre o uso de uma ou mais técnicas 
empregadas no controle microbiano. 
 
Fundamentação Teórica 
 
É importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiológico: 
A) Desinfecção – significa redução do número de microrganismos em superfícies 
inanimadas (ambiente ou materiais) e conseqüente eliminação de sua 
potencialidade infecciosa. 
B) Sanitização – mesmo significado de desinfecção, porém utilizado rotineiramente em 
indústria de alimentos. 
C) Antissepsia – significa redução do número de microrganismos em tecidos vivos. 
D) Esterilização – destruição ou remoção completa dos microrganismos em ambientes 
ou materiais. 
E) Assepsia – significa ausência de microrganismos / as técnicas assépticas representam 
uma série de cuidados que previnem a contaminação. 
 
O controle de microrganismos pode ser feito por agentes físicos ou químicos. 
 
1 – Controle Microbiano por Agentes Físicos 
· Calor 
 É o método mais empregado para destruição de microrganismos por ser barato, 
eficaz e prático. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a 
destruição das formas esporuladas de bactérias, mais resistentes. Pode ser utilizado 
na forma de calor seco ou calor úmido em função da presença de água. O primeiro 
mata as bactérias por oxidação protéica, enquanto o segundo por desnaturação 
protéica. Além disso, o calor úmido é um método de maior eficiência devido à água 
ser um melhor condutor de calor do que o ar. 
 
Ä Calor seco: na ausência de água 
- Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo, é um tipo de 
esterilização. 
- Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180o C por 1 - 
2 horas, é um tipo de esterilização, porém não é qualquer material que pode ser 
submetido a esse tratamento. Utilizado principalmente para vidraria e metais 
(instrumentos cirúrgicos p. ex.) 
- Incineração: é a queima total de um material, método utilizado com materiais 
descartáveis, principalmente aqueles materiais hospitalares. 
 
 9 
 
 
 Ä Calor úmido: na presença de água (ou vapor d’água) 
- < 100o C: pasteurização (método desinfetante). Muito utilizado para alimentos e 
bebidas. A pasteurização rápida do leite emprega uma temperatura em torno de 72o C 
por 15 a 20 segundos, seguida de resfriamento rápido. A pasteurização consegue 
eliminar cerca de 99,5% de microrganismos, aqueles esporulados são termoresistentes, 
conseguindo resistir a esse tratamento. 
Alimentos pasteurizados – leite, sucos industriais. 
- = 100o C: é a fervura (método desinfetante). O alimento é submetido a uma 
temperatura igual a 100o C por até 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas 
bacterianas mas não destrói completamente as formas esporuladas. 
- > 100o C: é a autoclavação (método esterilizante). Os materiais e alimentos são 
submetidos a uma temperatura em torno de 121o C por 15-30 minutos, um tempo e 
temperatura bem inferiores àqueles empregados em calor seco. Isso é possível pelo 
emprego de alta pressão interna (1 ATM) na autoclave. A autoclave é similar a uma 
panela de pressão. 
 
· Ultravioleta (radiação não ionizante) 
Ä Possui uma atividade máxima num comprimento de onda de 260nm, 
geralmente são desinfetantes e usados em ambientes. 
- Limitação: não tem poder de penetração, tudo que estiver embalado ou protegido 
por vidro não é desinfetado, após umas 200 horas de uso da lämpada sua eficiência é 
diminuída. 
- Por que mata? ela penetra nos microrganismos e são captadas pelos seus 
cromossomos, causando mutação letal por serem absorvidos diretamente. 
 
· Radiação Gama (radiação ionizante) 
Ä É um método de esterilização, mais energético que as radiações UV com menor 
comprimento de onda e desequilibra quimicamente as células irradiadas, todos os 
seus componentes químicos podem ser alterados. Muito utilizado para esterilização 
de produtos hospitalares descartáveis em uso crescente em indústrias de alimentos 
(esterilização superficial). 
 
· Filtração 
Ä Clarificantes: são os filtros domésticos, retém as impurezas grosseiras, são 
desinfetantes. 
Ä Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1mm podendo reter inclusive 
alguns vírus. 
 
· Outros: 
Ä Pressão Osmótica (Salga); Dessecação (prod. Alimentícios em pó, liofilização); 
uso de baixas temperaturas (refrigeração, congelamento) 
 
2 – Controle Microbiano por Agentes Químicos 
 
· Fenóis e derivados: é um desinfetante fraco, porém utilizado como um 
desinfetante de referência para ser comparado com outros produtos. Um 
coeficiente maior que 1 indica que o produto é mais ativo que o fenol. 
® Atuação: fenóis/cresóis – desnaturam proteínas. 
 
 10 
 
OBS: Dos cresóis o mais importante é a creolina, utilizada para pisos e sanitários. O 
hexaclorofeno é muito usado na antissepsia cirúrgica. 
 
· Álcool Etílico: possui vários mecanismos de ação, sendo relativamente eficiente, 
são solventes de lipídios (ação detergente), são desidratantes (retiram a água das 
células) e desnaturam proteínas. O álcool etílico pode ser usado como desinfetante 
ou anti-séptico. O álcool absoluto (não hidratado) é fraco germicida. Um álcool 
parcialmente hidratado (60- 70%) é mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de 
penetração e conseqüente desnaturação protéica mais rápida. 
 
 
· Cloro / Iodo (Halogênios) 
- O Cloro é desinfetante de águas, alimentos e pisos. Mecanismo de ação é oxidante. 
 
Cl2 + H2O ® HCl + HClO 
 
Ácido hipocloroso instável, espontaneamente forma mais HCl e oxigênio nascente, isso 
que matará os microorganismos. 
 
- O mecanismo de ação do Iodo é a sua combinação irreversível com proteínas através 
da interação com aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, levando à 
desnaturação das mesmas. É um dos anti-sépticos mais utilizados na prática cirúrgica. 
 
· Detergentes catiônicos (agentes de superfície):alteram a permeabilidade de 
membrana ( ex: compostos quaternários de amônioÞ cloreto de benzalcônio). 
Mais ativo contra Gram negativos 
 
· Sais de Metais Pesados: 
- Mercúrio (Hg): anti-séptico . Em desuso pelo risco de intoxicação por absorção. 
- Sulfato de Cobre (CuSO4): desinfetante para águas de recreação. 
- Nitrato de Prata (AgNO3): anti-séptico, é altamente eficiente contra gonococos, que 
causam oftalmia em recém-nascidos e gonorréia em adultos com vida sexual ativa. 
® Atuação: afinidade por proteínas, inativando enzimas, por isso é importante não 
ingeri-los. 
Uso tópico apenas. 
 
· Ácidos orgânicos e inorgânicos: 
Freqüentemente usados na conservação de alimentos. Exs.: ácidos acético, lático, 
benzóico. 
 
· Álcalis: 
 Hidróxido de Sódio (NaOH)= presente nos sabões conferindo a estes a sua relativa ação 
anti-séptica. 
 Outros: KOH, Ca(OH)2 
 
· Corantes Básicos: mais eficientes contra Gram positivos. Ex.: Cristal Violeta, 
Azul de Metileno. 
 
 
 
 
 11 
 
· Oxidantes e Redutores 
 - Oxidantes: oxidam componentes celulares levando à morte das células. Ex.: 
Ozônio (O3), água oxigenada (H2O2), permanganato de potássio, peróxido de zinco. 
Usados como anti-sépticos. 
- Redutores: reduzem compostos celulares levando à morte das células. 
 ÞAldeídos e derivados: 
 Formaldeído/ formalina: muito irritante / São usados para desinfectar paredes e 
pisos. 
 Glutaraldeído: mais ativo e menos tóxico que o formaldeído; esporocida após 6 
horas de contato) 
 ÞÓxido de Etileno (gás): é um agente alquilante inativando proteínas e ácido 
nucléico. Usado em um recipiente fechado que recebe todo material a ser utilizado 
(contém algumas ampolas de óxido de etileno – líquido), à temperatura de 52o C, este 
líquido torna-se gasoso, assim, seus vapores são esterilizantes. Usado para esterilização 
de materiais de borracha ou plástico. 
A célula microbiana está em equilíbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilíbrio, 
matando a célula. 
 
· Antimicrobianos: ao contrário dos anteriores possuem ação seletiva contra 
microrganismos por isso não serão discutidos neste assunto. 
 
OBJETIVOS: 
 
- Verificar a eficiência de agentes químicos e físicos sobre as bactérias. 
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de conceituar e diferenciar 
os termos utilizados no controle microbiológico; descrever os agentes físicos e químicos 
utilizados no controle microbiano; entender o funcionamento de autoclaves e fornos de 
esterilização, diferenciando calor úmido de calor seco; compreender as diferenças 
encontradas na destruição de microrganismos esporulados e não esporulados frente à 
ação do calor; compreender as diferenças encontradas na ação dos diferentes métodos 
de antissepsia utilizados. 
 
MATERIAL: 
 
- Placas de Petri com agar simples ou caldo simples 
- Culturas de E. coli e Bacillus sp 
- Soluções antissépticas 
- Gaze 
- Tripé, tela de amianto e panela 
 
EXECUÇÃO: 
 
A – Agentes Químicos: observação da ação de antissépticos sobre bactérias a 
microbiota da pele. 
a) Numa placa de agar simples dividida em 4 quadrantes fazer a semeadura do 1º 
quadrante utilizando a ponta do polegar (fazer a impressão digital suavemente para não 
ferir a camada do meio de cultura); 
b) Um segundo aluno lava seu polegar com sabão e água por 1 minuto, seca com 
gaze estéril e inocula o segundo quadrante fazendo a impressão do dedo; 
 
 12 
 
c) Um terceiro aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 1º 
antisséptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no 
terceiro quadrante; 
d) Um quarto aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 2º 
antisséptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no 
quarto quadrante. 
- Incubar a placa a 37º C por 24 horas e analisar o crescimento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
B – Agentes Físicos: calor 
a) Numa placa de agar simples dividida e marcada em 8 partes semear as culturas 
bacterianas de E. coli e Bacillus sp. no espaço respectivo ao tempo T0 ; 
b) Colocar as culturas em banho-maria fervente e reinocular os quadrantes T5, T10, 
T20 após 5, 10 e 20 minutos de tratamento térmico, respectivamente. 
- Incubar a placa a 37o C por 24 horas e analisar o crescimento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C – Atividade de Diferentes Agentes Químicos sobre bactérias in vitro (opcional, 
pois a metodologia é idêntica ao teste de sensibilidade a antimicrobianos) 
a) Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma 
placa de Petri com agar simples; 
b) Assepticamente, com pinça, embeber discos de papel de filtro com diferentes 
agentes químicos; 
c) Colocar os discos eqüidistantes na placa semeada; 
- Incubar a 37º C por 24 horas e analisar os dados obtidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1.º DEDO 2.º DEDO 
+ SABÃO 
4.º DEDO + 
ANTIS. 2 
3.º DEDO + 
ANTIS. 1 
- - 
 t0 
 t10 
 t5 
 t20 
E B 
A B 
C D 
 
 13 
 
Importância da Aula de Controle Microbiano 
 
Esta aula é de extrema importância para a área farmacêutica, pois a contaminação 
microbiana de medicamentos e cosméticos podem causar alterações das suas 
características sensoriais, tornando-os impróprios para o uso; e promover a degradação 
de componentes da formulação, podendo comprometer a sua eficácia e segurança ou 
causar danos à saúde, dependendo do tipo do microrganismo presente, da via de 
administração utilizada e do estado de saúde do usuário do produto. Os 
microrganismos, de maneira geral, exigem condições favoráveis para seu crescimento, o 
que torna algumas matérias-primas livres de contaminação ou, pelo contrário, muito 
susceptíveis. Estas últimas podem tornar-se substrato para o crescimento microbiano, 
uma vez que podem ser utilizadas como fonte de carboidratos, proteínas, aminoácidos, 
vitaminas, sais orgânicos, água, entre outros. Além disso, muitos microrganismos 
requerem íons metálicos como coenzimas, os quais podem estar presentes nos insumos 
como impurezas2. 
 
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 14 
 
ASSUNTO 4: 
- Diluição 
- Contagem de u.f.c.viáveis 
- Obtenção de Cultura Pura 
 
OBJETIVOS: 
 
1. Metodologia de Diluições 
2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viáveis 
3. Contagem de u.f.c. viáveis 
4. Obtenção de cultura pura 
 
MATERIAL: 
 
- Tubos com 9mL de salina 
- Placas de Petri com Agar simples 
- Alças de Drigalski 
- Cubas com álcool 70º 
- Agar inclinado 
- Caldo simples 
- Cultura bacteriana em caldo 
- Pipetas de 1mL 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR: 
 
a. Diluição 
 A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL em 9mL de salina, homogeneizar, retirar 
1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... Obtendo assim, as diluições 1/10, 
1/100, 1/1000... 
 
b. De cada diluição inocular 0,1mL, em duplicata, na superfície do meio de Agar 
simples. Semear por distensão com alça de Drigalski. Incubar a 37ºC por 24 horas. 
 
c. Contagem da u.f.c. com diluição nº placa 1 + nº placa 2 aplicar na fórmula: 
 2 
 
® u.f.c. = nº encontrado x diluição x inoculo 
 
d. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples. 
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ASSUNTO 5: 
- Coloração Simples 
- Morfologia 
 
INTRODUÇÃO: 
 
Torna-se necessário fixar e corar as bactérias para o estudo exato da sua morfologia e 
citologia. Com efeito, a pequenez dos detalhes estruturais, a falta de contraste natural 
destes detalhes e o movimento das bactérias aliado à sua grande refringência, tornam 
impossível o estudo morfológico exato destes organismos nos simples exames a fresco. 
A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano e a sua colagem às lâminas, 
com o mínimo de deformação, quer dizer, imobilização dos microrganismos e das 
estruturas celulares. São agentes fixadores o calor, atuando em escala moderada, os 
vapores de ácido ósmico, o formol, o éter, os sais de mercúrio, etc. 
Os corantes são substâncias dotadas de cor própria e que uma vez dissolvidas 
comunicam essa cor às estruturas com as quais são postas em contacto. 
 Os corantes usados em Bacteriologia são produtos artificiais ou sintéticos. 
Os corantes sintéticos, são compostos orgânicos de estrutura complexa em que 
um ou mais anéis benzênicos se encontram ligados a um grupo auxócromo e outro 
cromóforo. 
 a. A função do grupo cromóforo é conferir ao composto a cor. 
 b. A função do grupo auxócromo é permitir a dissociação iónica do corante, 
tornando-o apto a formar sais e a reagir quimicamente com os tecidos, células e 
estruturas celulares. 
 Os corantes da Bacteriologia são sais e podem ser classificados em corantes 
ácidos e básicos. 
 Os corantes básicos são corantes de eleição da Bacteriologia uma vez que as 
bactérias, possuem carga elétrica negativa. Deste modo, a afinidade eletroquímica torna 
possível a fixação do radical corado sobre as estruturas celulares das bactérias, o que 
não sucede com os corantes ácidos cujo radical corado é eletronegativo. 
 Os mordentes são substâncias que reforçam a ação dos corantes, são 
principalmente usados como mordentes em Bacteriologia, o ácido tânico, o ácido 
crómico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor, os alcalis; estas substâncias 
aumentam a energia de fixação das cores sobre as estruturas celulares. 
 
Classificação esquemática das técnicas de coloração 
1. Colorações simples ou monocromáticas - em que actua apenas um soluto corante. 
2. Colorações duplas ou policromáticas - em que actuam sucessivamente dois solutos 
corantes. 
 
Destas duplas colorações há duas que são de interesse fundamental em Bacteriologia 
Médica, a coloração de Gram e a coloração de Ziehl-Neelsen3. 
 
OBJETIVOS: 
 
1. Identificação dos vários tipos de corantes de acordo com os diversos métodos de 
coloração empregados em Bacteriologia. 
2. Preparação de esfregaços partindo de meio líquido e de meio sólido. 
3. Fixação de esfregaço por meios físicos e químicos. 
 
 16 
 
4.Coloração simples - a coloração de microrganismo com uma única solução de 
corante3. Ex: azul de metileno ou fucsina. 
5. Observar formas e arranjos bacterianos através de preparações fixadas e coradas. 
 
MATERIAL: 
 
- Azul de metileno ou fucsina 
- Solução salina 
- Lâminas 
- Culturas em meios líquido e sólido 
- Alça e agulha de platina 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR: 
 
1. Introdução da técnica sobre corantes, sua classificação (naturais, artificiais, básicos e 
neutros) e quanto ao veículo. Técnicas de coloração simples, duplas e mistas. 
2. Preparo de esfregaços e fixação por meios físicos e químicos. 
 
a) Preparo das lâminas 
As lâminas novas oferecem maior garantia para a confecção de boas preparações 
coradas, não obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo 
de limpeza e esterilização dessas lâminas implica numa série de medidas que 
passaremos a enumerar: lavar com água e sabão, mergulhar em solução detergente e 
deixar em ebulição por cerca de 1 a 2 horas, lavar novamente em água corrente, escorrer 
e rinsar com água destilada, escorrer e secar. As lâminas devem ser colocadas em 
frascos fechados contendo álcool. 
 
As preparações coradas são feitas em 3 tempos: 
1º esfregaço 
2º fixação 
3º coloração 
 
b) Esfregaço 
- Tirar do frasco uma lâmina esterilizada e enxugar bem 
- Flambar, rapidamente, nos dois lados da lâmina 
- Flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar próximo à chama 
- Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mão esquerda e com os dedos médio e 
anular da mão direita remover o tampão de algodão da boca do tubo 
-Flambar a boca do tubo de cultura 
- A alça de platina, segura entre o polegar e o indicador da mão direita, será introduzida 
no interior do tubo até tocar no meio de cultura 
- Flambar novamente a boca do tubo 
- Fechar o tubo com o tampão de algodão e colocá-lo na estante 
- Tomar a lâmina com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma gotícula 
(uma ´alçada``) da suspensão bacteriana 
- Com movimentos de rotação da alça de platina, o material deve ser bem espalhado a 
fim de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme 
- Deixar secar ao ar e marcar com lápis dermatográfico do lado oposto onde se situa a 
preparação 
 
 
 17 
 
Em se tratando de material de cultura em meio sólido, deve ser observado o seguinte: 
- Depositar uma pequena gota de água destilada ou solução fisiológica estéril no centro 
da lâmina 
- Tocar a colônia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na 
gotícula d`água, de forma a obter um esfregaço fino e uniforme 
 
c) Fixação do material 
A fixação evita que o material se desprenda no decurso das manipulações posteriores. 
Pode ser feita por: 
 
# Agentes Físicos (calor) – consisteem passar a lâmina, com a face onde se acha o 
esfregaço para cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente 
 
# Agentes Químicos – utiliza-se uma substância química como álcool metílico, álcool 
etílico, álcool-acetona, éter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os 
esfregaços dessecados durante alguns minutos (2 a 10 minutos). 
O fixador pode ser posto sobre o esfregaço convenientemente protegido contra a 
evaporação rápida, ou então o preparado será mergulhado no fixador contido em 
recipientes apropriados. 
· Procedimento para preparação do esfregaço e fixação.2 
 
 
 18 
 
3. Coloração Simples , Método fixado e corado 
a. Preparo do esfregaço 
b. Fixação 
c. Coloração 
 Cobrir o esfregaço com a solução de azul de metileno ou fucsina diluída durante 5 
minutos . Lavar, secar com papel de filtro e observar com objetiva de imersão. 
 
 
 
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 19 
 
ASSUNTO 6: 
- Coloração de Gram 
 
INTRODUÇÃO: 
 
O método de coloração de Gram é o mais utilizado em Bacteriologia e permite a 
diferenciação da maioria das bactérias em 2 grupos pelas diferenças marcantes na 
parede celular que apresentam. Baseado nessas diferenças de parede celular os corantes 
utilizados coram as bactérias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em 
vermelho. 
O método de Gram é utilizado na maioria das infecções bacterianas, permitindo 
o diagnóstico de algumas delas com bastante segurança. Porém não se aplica para 
micoplasmas, bactérias desprovidas de parede, micobactérias pela presença de muitos 
lipídios insolúveis na parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco 
permeável aos corantes. 
 
Fundamentação Teórica 
A coloração pelo método de Gram é chamada de coloração diferencial porque 
são utilizados dois corantes e as bactérias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso 
é possível devido à composição da parede celular das mesmas. 
Essas bactérias podem ser aeróbias, anaeróbias facultativas e anaeróbias. 
Possuem a forma de cocos, bacilos ou víbrios (bacilos encurvados). Muitas são 
patogênicas e outras, membros da microbiota normal do corpo humano. 
A maioria dos cocos é Gram-positiva com exceção dos gêneros Neisseria e 
Veillonella que são os únicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem-
se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus 
e Clostridium; os demais bacilos são Gram-negativos (a maioria); os víbrios são Gram-
negativos. 
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) 
das bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de 
bactérias de material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação 
completa de uma bactéria sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da 
mesma. 
O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, 
sendo que as G+ possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as 
G-, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada 
composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o 
processo de coloração, o tratamento com álcool (ou ácool-acetona) extrai os lipídeos, 
daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das G-. 
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- são descoradas. 
A parede celular das bactérias G+, em virtude de sua composição diferente, torna-se 
desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é 
reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. 
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os 
dois grupos de bactérias. Nas bactérias G+, o complexo CV-I é retido na parede após o 
tratamento pelo álcool, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos 
poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. Os poros da 
parede das bactérias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do 
tratamento pelo álcool, possibilitando a extração do complexo CV-I. 
 
 20 
 
Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com álcool, as bactérias G- devido à 
pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em 
pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo 
corado extraído pelo álcool que deixa as células descoradas. 
 
OBJETIVOS: 
 
1. Observar e interpretar o mecanismo de reação de Gram como um método de 
coloração diferencial. 
2. Discutir as várias etapas da metodologia e a importância taxonômica do método na 
Bacteriologia. 
 
MATERIAL: 
 
- Lâminas. 
- Culturas em meios líquido e sólido. 
- Alça e agulha de platina. 
- Cristal violeta. 
- Lugol. 
- Álcool etílico. 
- Fucsina de Ziehl. 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
COLORAÇÃO DE GRAM (MÉTODO CLÁSSICO) 
 
a. Preparar um esfregaço fino, secar a temperatura ambiente e fixar pelo calor. 
b. Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante) durante 1 
minuto. 
c. Esgotar a lâmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto. 
d. Inclinar a lâmina 45° e lavar em água corrente. 
e. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com álcool 95° GL (diferenciador). 
f. Lavar e depois cobrir a preparaçãocom solução diluída de fucsina de Ziehl (contra-
corante) (15 a 30 segundos). 
g. Lavar e secar entre duas fitas de papel de filtro, delicadamente. 
h. Colocar uma gota de óleo de cedro no centro do esfregaço. 
i. Observar com a objetiva de imersão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Vi Lulu Ali A Fumar Algo 
 Cristal Lugol Álcool Água Fucsina Água 
 Violeta 
 
 
 21 
 
· Procedimento para coloração de Gram5. 
 
 
Notas: 
 
1. O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco. 
2. O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal 
violeta poderá aparecer como artefato. 
3. O descoramento para mais ou para menos é resultante de incorreta diferenciação pelo 
álcool. 
4. A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. 
Em culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-
negativas. Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem 
causar danos à membrana da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade dos 
solventes. Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da 
célula. 
 
 22 
 
5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da 
cultura, uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas 
bacterianas conhecidas como G+ (Staphylococcus aureus) e G- (Escherichia coli) como 
controle. 
 
Interpretação: Bactérias G+ coradas em roxo. 
 Bactérias G- coradas em vermelho 
 
· Fotomicrografia representativa da coloração de Gram2. 
 
 
 
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 23 
 
ASSUNTO 7: 
- Cocos Gram-positivos 
 
INTRODUÇÃO: 
 
Identificação das bactérias de importância médica 
à material de colheita: secreções, líquidos biológicos e outros 
 
Cocos Gram positivos: 
Dentre as duas famílias conhecidas (Microcacceae e Streptococcaceae), trataremos dos 
gêneros e das espécies de interesse à patogênese das infecções. 
 
I. Staphylococcus 
 
Os estafilococos são cocos Gram-positivos, catalase positiva, que tendem a 
formar agrupamentos semelhantes a cachos de uva, devido aos seus arranjos irregulares. 
São bactérias anaeróbias facultativas de fácil crescimento. São amplamente distribuídos 
na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves 
(encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe). 
De todas as espécies existentes, se destacam em patologias humanas o 
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus e 
Staphylococcus haemolyticus. 
Staphylococcus aureus representa a espécie que está geralmente envolvida em 
infecções humanas (de origem comunitária e hospitalar) e apresenta uma freqüência de 
30 a 40% de portadores na população. Causam diferentes doenças supurativas tais 
como: furúnculo, impetigo, osteomielite, abcessos de tecidos, pneumonia, meningite, 
artrite purulenta, etc. Algumas amostras (S. aureus) produzem uma “enterotoxina” que 
provoca um quadro agudo de intoxicação alimentar, enquanto outros (S. aureus e S. 
saprophyticcus) causam infecções do trato urinário. São membros normais da 
microbiota anfibiôntica da pele e membranas mucosas. 
A colheita do material deve ser realizada com o máximo de assepsia: swab de 
nasofaringe, fezes, urina. Em se tratando de sangue, este deverá ser colhido com 
heparina, ou ser desfibrinado, nunca utilizar citrato de sódio, pois o sódio inibe G+, 
principalmente em pH próximo a 6. 
São inibidos pela presença de corantes do tipo Azul de Metileno e Violeta de 
Genciana. Crescem em meio de Agar Simples, Agar Sangue e Chapman. Suas 
colônias são redondas, elevadas, opacas e de coloração amarelo-dourado a branco. 
Cresce em presença de altas concentrações de NaCl, sendo este um fator de estimulação 
da produção da enzima coagulase. 
O meio Chapman é seletivo, porque contém 7,5% de NaCl; é indicador porque 
possui manitol e o indicador Vermelho de Fenol, as UFCs fermentadoras do manitol 
apresentam-se com coloração amarelas após 24 – 48 horas de incubação a 37ºC. Após o 
crescimento de colônias típicas fazemos a coloração de Gram para observarmos a 
presença de cocos Gram + dispostos em grupos (cachos) ou isolados. 
Diferenciamos o gênero Staphylococcus do gênero Streptococcus através da prova 
da catalase. A diferenciação das espécies do gênero se dá através das provas de 
fermentação do manitol, da coagulase, da DNAse, da sensibilidade a novobiocina e da 
redução de nitratos. 
 
 
 
 24 
 
Provas bioquímicas 
 
- Prova da Catalase: 
A prova da catalase se destina a verificação da presença da enzima catalase. A 
prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de 
cultura, exceto meios com sangue pois este possui catalase, levando a resultados falso-
positivos. 
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio com formação 
de água e oxigênio molecular. A verificação da produção dessa enzima por determinada 
bactéria pode ser feita adicionando-se peróxido de hidrogênio (H2O2 a 30%) a cultura 
em meio sólido ou líquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Na 
ausência de catalase, não há decomposição do peróxido. 
Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de 
um crescimento em agar-sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma 
gota de peróxido em uma área do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre 
uma colônia a ser testada. Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais 
rápido e intenso sobre a colônia. 
 
- Fermentação do Manitol: 
O manitol é um açúcar que alguns microorganismos são capazes de utilizar como 
fonte de energia através da fermentação. A prova se baseia na alteração do pH do meio, 
graças a produção de ácidos durante o processo de fermentação. Essa mudança de pH 
pode ser observada pela viragem de cor do meio devido a presença do indicador de pH 
Vermelho de Fenol. A prova pode ser realizada em meios de cultura líquidos ou sólidos. 
Após a semeadura, o meio deve ser incubado a 37ºC por 18 – 24 horas. 
 
Interpretação: 
à positivo: amarelo 
à negativo: não há alteração da cor- Prova da coagulase: 
 A coagulase estafilocócica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e 
coagulase livre. 
A coagulase ligada, presente na parede da célula bacteriana, converte o 
fibrinogênio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulação, e 
pode ser detectado em teste direto em lâmina, utilizando-se da suspensão de 
Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos 
circulares e observando-se a formação de coágulo no tempo de 1-2 minutos. Pode-se 
tornar mais sensível o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre quanto a 
ligada, sendo a prova de escolha. 
A coagulase livre é produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o 
fator de coagulação do plasma, CRF, formando uma substância semelhante, mas não 
idêntica, à trombina, que converte fibrinogênio em fibrina. Para o teste, utiliza-se 
plasma citratado humano ou de coelho, estéril, diluído em solução salina na proporção 
de 1:5. a reação ocorre volume a volume a 37ºC. 
Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica 
quando o microorganismo é crescido e meio contendo alta concentração de NaCl. Desta 
forma, aconselha-se a utilização de colônias para a prova, crescidas em Agar Manita 
(Agar Manitol Salgado) contendo NaCl e Vermelho de Fenol. Este procedimento 
aumentaria a sensibilidade do teste. 
 
 25 
 
A prova consiste da semeadura de uma alçada do microorganismo em estudo em 
tubo contendo o plasma diluído e incubação a 37ºC. A menor coagulação é considerada 
positiva. Devem ser feitas leituras periódicas a cada 1-2 horas, por até 24 horas, pois 
algumas espécies produzem fibrinogênio, que dissolve o coágulo formado. 
Aconselha-se também utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. 
aureus. 
 
- Prova da DNAse: 
Alguns microorganismos são capazes de utilizar o DNA presente no meio como 
fonte de energia, através da produção da enzima DNAse. 
No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de 
semadura) central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37ºC por 24 horas e 
adicionar ao meio HCl 1N e aguardar a turvação do meio. 
Lembrando que o DNA é material protéico e que o HCl, como ácido, tem poder 
desnaturante sobre as proteínas, a turvação do meio é apenas a precipitação do DNA 
desnaturado. Se a bactéria produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor terá sido 
degradado, então ao adicionar o HCL não haverá turvação nesta área. Portanto, se 
houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o resultado é positivo. 
 
- Sensibilidade a Novobiocina: 
Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton 
com swab, para obtenção de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina 
(5mg/ml). Incubar a 37ºC por 24 horas. As bactérias resistentes não apresentarão halo de 
inibição, enquanto as sensíveis sim. 
 
Interpretação das provas bioquímicas 
 
Provas bioquímicas S. aureus S. epidermidis S. sapophyticus 
Catalase + + + 
Fermentação do manitol + - - 
Coagulase +/- - - 
DNAse + - - 
Sensibilidade a novobicina R S R 
Redução de nitratos + - 
 
II. Streptococcus 
 
Os estreptococos são cocos Gram-positivos, catalase negativo, que tendem a formar 
agrupamentos em cadeia. Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados 
principalmente na orofaringe), apesar disso, muitos deles são responsáveis por uma 
variedade de manifestações clínicas, sendo considerados importantes agentes 
infecciosos tanto para o homem quanto para os animais. A maioria necessita de meios 
enriquecidos, geralmente pela adição de sangue para o crescimento. 
O sistema de nomenclatura é baseado principalmente em características 
hemolíticas, de acordo com o tipo de hemólise observada em meios contendo sangue 
(existindo também outros testes para a classificação). Nesse sentido verificam-se três 
tipos de hemólise: alfa, beta e gama. 
O gênero apresenta espécies de interesse médico como: Streptococcus 
viridans, Streptococcus beta hemolíticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. 
agalactiae) e Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um 
 
 26 
 
gênero separado e possuem características peculiares. Apresentam-se em forma de 
cadeia ou em pares, e são Gram positivos. 
Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou 
de enriquecimento. O meio de seletivo específico para estreptococos mais usado é o 
caldo Hitchens-Pike, seletivo por apresentar azida sódica e cristal violeta. Um meio 
alternativo para enriquecimento é o caldo tioglicolato de sódio, adequado para o 
crescimento de bactérias, inclusive aquelas microaerófilas e anaeróbias. O meio clássico 
de isolamento de estreptococos é o agar sangue aonde pode-se observar o perfil 
hemolítico dos mesmos. 
Os Streptococcus foram descritos em 1874 por Billroth, causando exsudato 
purulento em lesões de erisiplela e em feridas infectadas. Em seguida, foram isolados do 
sangue de pacientes em estado febril, e da garganta de crianças com escarlatina. 
Em 1903, Schottmuller propôs que os estreptococos fossem classificados 
conforme a capacidade de lisar hemácias “in vitro”. Em 1919, Brown chamou de a, b e 
g as lises observadas nas hemácias em placas de Agar sangue. 
Os estreptococos a hemolíticos apresentam zonas de hemólise parciais, com 
hemácias integras na parte mais interna (junto à colônia) e hemólise maior na parte mais 
externa. Frequentemente aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise 
(devido a alteração da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana), que 
originou a qualificação “estreptococos do grupo esverdecente” ou Streptococcus 
viridans. O Streptococcus pneumoniae apresentam hemólise a e colônia puntiforme 
com aprofundamento no ápice da colônia (parecendo um pequeno vulcão) 
Os estreptococos b hemolíticos produzem uma zona de hemólise total,, não se 
observando hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x). O 
Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas: O e S a hemolisina O é 
destruída pela ação do oxigênio atmosférico, e, portanto, só demonstrada em colônias 
crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S é estável ao oxigênio do ar 
e produz hemólise mesmo nas colônias crescidas na superfície do meio de cultura. 
Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessária a 
semeadura do microorganismo pela técnica do pour-plate. 
Os estreptococos g são anemolíticos, ou seja, não produzem hemólise 
nomeio. Muitas das espécies saprófitas são deste grupo. 
As colônias de estreptococos isoladas em agar sangue são puntiformes (< 1mm 
de diâmetro), transparentes à luz transmitida e peroladas à luz refletida. Os 
estreptococos são negativos na prova de catalase o que os diferencia dos estafilococos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 27 
 
Na identificação de estreptococos além do perfil hemolítico, a determinação 
do Grupo Lancefield (carboidrato antigênico de parede) é importante. No entanto, em 
função do custo desta investigação outras provas auxiliares são realizadas para a 
identificação das principais espécies. O esquema abaixo apresenta estas provas: 
 
 
 
 
Cultura (“pour plate”) 
 
Fazer uma suspensão do material colhido em um tubo contendo 1 ml de solução 
fisiológica estéril e adicionar a uma placa de Petri estéril. Juntar o Agar Sangue fundido 
e resfriado e promover a difusão do inóculo no meio através de movimentos circulares. 
Incubar a 37ºC por 18 horas em atmosfera de microaerofilia ara melhor rendimento, ou 
jarra com vela. 
 
Leitura: Observação do tipo de hemólise em Agar Sangue. 
 
· Beta hemólise produzida por Streptococcus viridans em Agar Sangue4. 
 
 
Provas bioquímicas 
 
- Prova da optoquina: 
Colocar um disco de optoquinana superfície do Agar Sangue (pode-se incluir no 
antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colônias ao redor do disco de 
optoquina (2 cm de diâmetro), trata-se de teste positivo. 
 
 28 
 
 
- Bile solubilidade: 
 A prova é realizada conforme esquema que se segue: 
à a 1,0 ml de cultura em calo, adicionar uma gota de vermelho de fenol; 
à acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rósea); 
à adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sódio ou bílis; 
à incubar juntamente com o tubo sem bílis a 37ºC por 3 horas. 
 
* clareamento: positivo 
* inalterado: negativo 
- Bacitracina: 
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfície do 
meio de cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no 
antibiograma) e incubar a 37ºC por 24 horas em microaerofilia. 
 
* Grupo A: sensível a bacitracina 
* demais grupos: resistentes 
 
- Crescimento a 56ºC: 
Para evitar dúvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), 
submeter a cultura a um aquecimento a 56ºC por 30 minutos. Somente os enterococos 
resistem a este tratamento. 
 
- Crescimento em Agar Chapman: 
Os enterococos toleram altas concentrações de NaCl, como acontecem com 
Staphylococcus. 
 
- Crescimento em Agar EMB: 
Os enterococos suportam a presença de corantes, como o azul de metileno 
 
OBJETIVOS: 
 
1. Isolamento de bactérias das vias aéreas superiores. 
2. Identificação bioquímica através da interpretação do metabolismo microbiano. 
 
MATERIAL: 
- cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis 
1a aula: swabs estéreis, tubo com solução salina, Agar Chapman, Meio de 
Tioglicolato (ou de Hitchens-Pike). 
2a aula: Agar sangue, Caldo simples ou BHI, Agar inclinado, Agar DNAse, 
dessecador com vela. 
3a aula: reativo para catalase (H2O2), reativo para DNAse (HCl 1N), reativo 
para coagulase (plasma sangüíneo), tubo controle positivo, lâminas e 
conjunto de coloração de Gram. 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
1º DIA: 
 
a. inocular swab de orofaringe em Caldo Hitchens-Pike ou Tioglicolato. 
 
 29 
 
b. inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela técnica de esgotamento. 
c. Incubar a 37°C por 24 horas. 
 
2º DIA: 
 
a. semear material do crescimento em Tioglicolato em placa de Agar Sangue, pela 
técnica de esgotamento e incubar em microaerofilia pela técnica da vela. 
b. inocular a UFC típica de Staphylococcus nas provas bioquímicas (catalase, 
coagulase e DNAse) 
c. realizar a coloração de Gram 
 
3º DIA: 
 
a. leitura e interpretação da placa de Agar Sangue, caracterizar a presença de 
colônias típicas de Streptococcus e seu eventual padrão hemolítico no meio de 
Agar Sangue. 
d. leitura e interpretação das provas bioquímicas, usando os reativos próprios. 
 
Importância da Aula: 
 É de suma importância para o profissional farmacêutico o conhecimento dos 
cocos Gram positivos, pois eles são responsáveis por diversas infecções humanas. 
Staphylococcus aureus (o + importante representante) causa abcessos, 
endocardites e osteomielites, intoxicação alimentar e síndrome do choque tóxico. S. 
epidermidis pode causar endocardites e S. saprophyticus causa infecções do trato 
urinário. 
Os estreptococos produzem uma grande variedade de infecções como faringite e 
infecções celulares à septicemia (Streptococcus agalactiae causa infecção urinária em 
gestantes). Tb podem causar desordens imunológicas como febre reumática e 
glomerulonefrite aguda (causada por Streptococcus pyogenes). 
 
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ASSUNTO 8: 
- Colimetria. 
 
INTRODUÇÃO 
A água é elemento fundamental para a sobrevivência humana. Sua grande 
utilização no abastecimento público, na recreação, na industria, no uso domestico atesta 
essa importância vital. 
 As águas para abastecimento podem ser poluídas por servir de reservatório para 
espécies microbianas patogênicas e permitir a sobrevivência das mesmas, e é 
reconhecida desde os primórdios da civilização. Várias doenças podem ser veiculadas 
pela água, tais como cólera, febre tifóide, disenterias, leptospirose, tuberculose, hepatite, 
poliomielite, doenças parasitárias e fúngicas. Essas doenças são resultantes da ingestão 
de água e alimentos contaminados ou do emprego de água poluída pela irrigação, pesca, 
lazer, piscicultura, cultura de marisco. 
 Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitário, o esgoto 
doméstico é um dos principais responsáveis pela poluição das águas, estimulando o 
crescimento de microrganismo. A assimilação destes contaminantes orgânicos 
biodegradáveis é realizada com o concurso de bactérias presentes, por meio de um 
processo, que consome o oxigênio dissolvido na água dos rios ou reservatórios. Quando 
a carga de matéria orgânica biodegradável presente na água, e o OD (Oxigênio 
Dissolvido), que mede a concentração de oxigênio disperso na água (Soares, 1999). 
 Além dos esgotos domésticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial 
urbano contribuem grandemente na poluição dos corpos d’água. Os efluentes industriais 
contem grandes números ou metais pesados. O escoamento superficial urbano contém 
todos os poluentes que se depositam na superfície do solo na ausência de chuvas, como 
lixo e matéria orgânica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros são arrastos quando 
da estação chuvosa para os cursos d’água superficiais, constituindo-se numa outra fonte 
de poluição (Soares, 1999). 
 Os microrganismos dotados de potencial patogênico chegam às extensões 
hídricas procedentes das excreções intestinais do homem e de outros animais. Embora já 
existam métodos desenvolvidos para a detecção de vários organismos patogênicos de 
veiculação hídrica, os mesmos não são aplicáveis na rotina devido ao alto custo e 
necessidade de pessoal especializado (CETESB, 1993). 
Uma alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de 
organismo não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de 
sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrência de contaminação fecal, 
evidenciando o risco da presença de patógenos. Fezes humanas contém de 20-30 % de 
resíduos alimentares não digeridos, sendo o restante constituído de água e bactérias. NO 
indivíduo saudável essas bactérias constituem os habitantes normais do intestinos onde 
a Escherichia coli é a representante característica. O número desses microrganismos 
pode atingir XXXXcélulas/gde fezes. Assim a presença da Escherichia coli em 
alimentos e água é indicativo de contaminação fecal e possibilidade de presença de 
patógenos entéricos. 
Microrganismos indicadores de poluição de água são utilizados para monitorar, 
classificar e restringir o uso das águas. Um indicador ideal deveria preencher os 
seguintes critérios: 1. Ser aplicável a todo tipo de água; 2. Estar presente 
simultaneamente com os microrganismos patogênicos, com um tempo de sobrevivência 
igual àquele patógeno entérico mais resistente; 3. Não se reproduzir em águas 
contaminadas, para não resultar em valores aumentados ( HAGLER E MENDONÇA-
HAGLER, 1998 ). 
 
 31 
 
Não se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismo que atenda 
a todos esses requisitos, mas há vários que se aproximam das exigências referidas e que 
são muito úteis. 
As bactérias empregadas como indicadores de poluição fecal em águas são: os 
coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. 
Contagens de Salmonella e de bactérias do gênero Bifidobactérias têm sido propostas. O 
Indicador microbiológico mais empregado é o grupo dos coliformes. Este e outros 
indicadores de poluição orientam a margem de segurança sanitária de água potável, da 
água utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestíveis. 
A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda para águas recreacionais 
um máximo de 100 coliformes fecais por 100ml de água. 
 
COLETA DE AMOSTRAS 
 
A coleta de amostras para exame microbilógico deve ser feita em garrafas 
esterilizada que tenham sofrido tratamento prévio de limpeza e rinsagem com água 
destilada. 
 → Água clorada: adiciona-se 0,1 ml de tiossulfato de sódio 10% para cada 
250ml de água para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com 
propriedades desinfetantes entre o período da coleta e o momento da inoculação, 
impedindo que continue com propriedades desinfectantes entre o período da coleta e o 
momento da inoculação. 
 →Água com alto teor de cobre e zinco: coleta na presença de um agente 
quelante, de forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais ( 0,3 ml de EDTA a 
15%, ph = 6,5para cada 120mL de água ). 
 
 Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espaço livre na garrafa 
(cerca de 2,5 cm) para facilitar a homogeneização antes da inoculação. As garrafas 
devem ser mantidas vedadas até o momento da coleta da amostra e devem ser tomados 
todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar contaminações 
secundárias. 
 
 *PONTO DE COLETA 
 
1. Água da torneira 
 
a. Abrir a torneira e deixar correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a água na 
acumulada nas tubulações. 
b. Com algodão embebido em álcool, passar na abertura e internamente e em seguida 
flambar. 
c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos. 
d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a água. Introduzir água no frasco até cerca de 
três quartos do seu volume. 
e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratório. 
 
2. Poços e Cisternas 
a. Preparação do frasco – amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um 
barbante para facilitar a descida no poço. 
b. Descer o frasco dentro do poço sem permitir que o mesmo toque nos lados. 
c. Submergir o frasco completamente na água. 
 
 32 
 
d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da água para criar um 
espaço de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente. 
 
3. Rios, Lagoas e Mares 
 
a. Coleta da amostra de água de rios e lagoas – nestes casos deve-se mergulhar o frasco 
até uma profundidade de 20cm, com abertura voltada em direção contrária a corrente, a 
fim de evitar a contaminação da água com as mãos. 
b. Coleta da água do mar – a coleta deve ser feita na região onde as pessoas costumam 
banhar-se, que corresponde à profundidade aproximadamente de 1,0 m, que é a região 
das praias mais utilizada para a recreação de contato primário, na maré baixa e 24 horas 
sem chuvas. 
 
ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DA AMOSTRA PARA O 
LABORATORIO 
 
 O ideal é a análise iniciar-se até 1 hora após a coleta. Caso isto seja impossível, a 
amostra deve ser transportada sob refrigeração. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10 
graus Celsius no prazo máximo de até 30 horas após a coleta. 
Amostras presumivelmente poluídas têm de ser inoculadas no máximo após 6 
horas da coleta. 
Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculação, a mesma deve ser mantida em 
geladeira (cerca de 5 graus Celsius). 
 
EXAMES BACTERIOLÓGICOS DA ÀGUA 
 
O exame bacteriológico da água é feito através de dois processos: Contagem de 
bactérias heterotróficas viáveis na água e determinação ou estimativa do número de 
bactérias coliformes. 
A metodologia padrão empregada no exame bacteriológico da água, para medida 
do grupo coliforme, inclui dois procedimentos: a técnica dos tubos múltiplos e a técnica 
da membrana filtrante (“Standard Methods for the Examination of Water and 
Wastewater” -APHA, 1980). 
 
A. Determinação de coliformes pela técnica dos tubos múltiplos – 
NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) 
 
A técnica do número mais provável consiste no exame de uma série de tubos 
onde foram inoculados volumes diferentes de amostra. 
O valor obtido resulta da consulta da tabela que foram estimuladas com base em 
fórmulas de probabilidade. Considerações teóricas e determinações repetidas em grande 
escala indicam que este tipo de técnica tende a fornecer valores mais elevados do que o 
número real. As disparidades tendem a diminuir quando se adota séries com maior 
número de tubos em cada diluição. Portanto, a sensibilidade do teste depende do 
número de tubos adotados. 
Existem várias tabelas de NMP e a escolha da série a ser adotada é função das 
características microbiológicas da amostra. 
 
 
 33 
 
Tabelas de NMP/100 ml de amostra: 
 
a. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP 16 
 
b. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP > ou = 240 
1 X 1 ml 
1 X 0,1 ml 
 
 3) 3 X 10 ml ----- 3 > NMP > ou = 2400 
 3 X 1 ml 
 3 X 0,1 ml 
 
 4) 1 X 50 ml ------ 1 > NMP > ou = 240 
 5 X 10 ml 
 5 X 1 ml 
 
 5) 5 X 10 ml ----- 2 > NMP > ou = 2400 
 5 X 1 
 5 X 0,1 ml 
 
 6) 5 X 50ml ----- 1 > NMP > ou = 240 
 
 →OBS: nos tubos onde o inoculo é de 10 ou 50 ml, usar concentração dupla do 
meio e volume igual ao inoculo. 
TABELA DOS PADRÕES MICROBIOLÓGICOS DE PROBABILIDADE 
VIGENTES 
 
 TUBOS POSITIVOS POR: Nmp PARA 100 ml 
 10 ml 1 ml 0,1 ml 3 tubos 
 0 0 0 < 3 
 0 0 1 3 
 0 1 0 3 
 0 2 0 6 
 1 0 0 4 
 1 0 1 7 
 1 1 0 7 
 1 1 1 11 
 1 2 0 11 
 2 0 0 9 
 2 0 1 14 
 2 1 0 15 
 2 1 1 20 
 2 2 0 21 
 2 2 1 28 
 2 3 0 30 
 3 0 0