Biossinalização - Bioquímica

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Biossinalização
Definições prévias:
Hormônios são substâncias produzidas nas células especializadas das glândulas endócrinas, lançadas na corrente sanguínea, e que produzem efeitos específicos nas células alvo.
As células alvo reagem aos hormônios através de receptores, que são proteínas localizadas na membrana plasmática ou no interior da célula (citossol ou núcleo). 
Quimicamente os hormônios têm estruturas muito variáveis: aminoácidos e derivados, polipeptídeos, proteínas simples, glicoproteínas, esteróides, prostaglandinas, eicosanóides, etc. 
sinalização neuronal
- muito rápida
- muito específica
- transmitida pelos neurônios
- atividades motoras ou secretórias
sinalização endócrina
- mais lenta
- especificidade menor
- transmitida pela circulação
- principalmente atividades metabólicas
classificação das comunicações hormonais
a) sinal autócrino: a comunicação é de uma célula com ela mesma. Ex: interleucina 2, uma proteína que estimula a proliferação das células T
b) sinal parácrino: a comunicação é de uma célula com a sua vizinha. Ex: prostaglandinas
c) sinal endócrino: a comunicação é dada por células produtoras de hormônio. Ex: moléculas de hormônio sendo lançadas na corrente sanguínea por células endócrinas, para atuarem em suas células-alvo
características da transdução do sinal hormonal
a) especificidade: a molécula-sinal encaixa o sitio de ligação no seu receptor complementar – outro sinal não encaixa
b) amplificação: quando enzimas ativam enzimas, o numero de moléculas afetadas aumenta geometricamente em uma cascata de enzimas
c) dessensibilização: a ativação do receptor dispara um circuito por retroalimentação que fecha o receptor ou o remove da superfície celular
d) integração: quando dois sinais tem efeitos opostos sobre uma carcteristica metabólica, tal como a concentração de um segundo mensageiro X, ou o potencial de membrana Vm, a resultante de regulação resulta da entrada integrada nos dois receptores
Receptores
- reconhecimento e ligação de uma substância particular complementaridade entre a estrutura da molécula e do receptor
- influência sobre processos biológicos específicos: quebra de lipídeos, glicogênio, etc.
- as moléculas que interagem com os receptores (R) recebem o nome genérico de ligantes (L)
- Os receptores são tipicamente proteínas, geralmente glicoproteínas. Estão localizados nas membranas (receptores de membrana) ou dispersos no citosol ou núcleo 
tipos de receptores 
1. ligados a membranas (proteínas transmembrana) 
a) vinculados a canais iônicos: sinalização sináptica entre células excitáveis eletricamente abertura ou fechamento de canal iônico
b) vinculados às proteínas G: proteína-alvo GTP-ligante (proteína G) enzima mensageiro secundário ação específica
c) vinculados a enzimas: funcionam como enzimas ou estão diretamente associados a enzimas (proteína-quinases) 
2. não ligados a membranas 
- livres no citossol ou núcleo; receptores dos hormônios esteróides 
Os seis tipos gerais de transdutores de sinal 
- receptor associado a proteína G: esse tipo de receptor é ilustrado pelo sistema receptor β-adrenérgico, que detecta adrenalina.
- receptor tirosina-quinases: receptores de membrana plasmática que também são enzimas. Quando um desses receptores é ativado pelo seu ligante extracelular, ele catalisa a fosforilação de diversas proteínas citosólicas ou da membrana plasmática. O receptor da insulina é um exemplo.
- receptor guanilil-ciclase: também são receptores da membrana plasmática com um domínio enzimático citoplasmático. O segundo mensageiro para esses receptores (GMPc), ativa uma proteína quinase citosólica que fosforila proteínas celulares, alterando suas atividades. 
- canais iônicos com portões na membrana plasmática: abrem e fecham em resposta à interação com ligantes químicos ou alterações no potencial de membrana. O canal iônico do receptor de acetilcolina é um exemplo. 
- receptores de adesão: interagem com componentes macromoleculares da matriz extracelular (como o colágeno) e transmitem instruções para o sistema do citoesqueleto sobre migração ou adesão à matriz. As integrinas ilustram esse tipo de mecanismo de transdução.
- receptores nucleares: receptores de esteroides que interagem com ligantes específicos (como o hormônio estrogênio) e alteram a taxa na qual genes específicos são transcritos e traduzidos em proteínas celulares. 
OBS: O gatilho de cada sistema é diferente, mas as características gerais da transdução de sinal são comuns a todos: 
- um sinal interage com o receptor;
- o receptor ativado interage com a maquinaria celular, produzindo um segundo sinal ou uma alteração na atividade de uma proteína celular;
- a atividade metabólica da célula-alvo sofre uma modificação;
- e, finalmente, o evento de transdução termina.
diferença entre afinidade e atividade
- afinidade reflete-se na energia livre do processo de formação do complexo ligante-receptor (LR)
- quanto maior a afinidade, menor a faixa de concentração na qual há formação significativa do complexo ligante-receptor
- atividade refere-se ao efeito biológico
- não há, na maioria das vezes, proporção direta entre o grau de saturação do receptor (afinidade) e a atividade biológica (amplificação do sinal)
receptores e resposta biológica
- agonistas completos (plenos): ligantes que causam resposta biológica máxima quando ocupam todos os receptores.
- agonistas parciais: ligantes que causam resposta biológica sub-máxima apesar de ocuparem todos os receptores.
- antagonistas: ligantes sem resposta biológica.
1. receptores vinculados às proteínas G
Proteína-alvo GTP-ligante (proteína G) enzima mensageiro secundário ação específica
A Gs, o protótipo de proteínas da família G que atuam em biossinalização é heterotrimérica, com estrutura de subunidades αβγ, possuindo atividade GTPásica. 
O receptor ocupado pelo ligante causa a substituição do GDP ligado à Gs por GTP, ativando a Gs. Em geral, a subunidade Gsα se liga a uma enzima que sintetiza um mensageiro intracelular secundário que irá desencadear a resposta celular.
algumas proteínas G e seus efeitos
> mensageiros intracelulares secundários:
O AMP cíclico é um dos principais mensageiros celulares, estando envolvido em diversos eventos celulares. A adenilil ciclase é uma proteína integral fonte de AMP cíclico de membrana plasmática, com o sítio ativo na face citoplasmática. 
sinais que usam o AMPc como segundo mensageiro
- epinefrina e glucagon
- o estímulo por Gsα é autolimitante. Gsα é uma GTPase que desliga a si mesma através da conversão do GTP ligado a GDP. Inativa, a proteína dissocia-se da adenilil ciclase. A Gsα reassocia-se com o dímero βγ (Gsβγ) e a Gs inativa está novamente disponível para interagir com um receptor ligado ao hormônio 
ativação da proteína quinase dependente de AMPc (PKA) 
Quando a concentração de AMPc está baixa, as subunidades de regulação se associam com as subunidades catalíticas, impedindo a ligação dos substratos. O complexo assim, está cataliticamente inativo. 
Quando a concentração de AMPc aumenta em resposta a um sinal hormonal → cada subunidade reguladora se liga a duas moléculas de AMPc e sofre uma dramática reorganização que afasta a sequência inibitória da subunidade C, abrindo a fenda de ligação ao substrato e liberando cada subunidade C na forma cataliticamente ativa. 
AMPc: restrição de processos de sinalização a regiões específicas da célula por meio de proteínas adaptadoras ― proteínas não catalizadoras que agrupam outras moléculas de proteínas que agem em conjunto 
Alguns tipos de AKAP atuam como arcabouços, mantendo subunidades catalíticas de PKA próximas a uma região ou organela específica da célula, por meio da interação da AKAP com as subunidades reguladoras.
Diferentes células têm diferentes complementos de AKAPs, de maneira que o AMPc pode estimular a fosforilação de proteínas mitocondriais em uma célula e a fosforilação defilamentos de actina em outra.
Em alguns casos uma AKAP conecta a PKA à enzima que leva à ativação da PKA (adenilil-ciclase) ou que extingue a ação da PKA (AMPc-fosfodiesterase ou fosfoproteína fosfatase). Esta proximidade de enzimas ativadoras e inativadoras provavelmente desencadeia uma resposta muito breve e extremamente localizada.
enzimas reguladas por fosforilação pela proteína quinase A
Exemplo: a cascata da adrenalina 
A adrenalina desencadeia uma série de reações nos hepatócitos, nos quais catalisadores ativam catalisadores, resultando em uma grande amplificação do sinal. A ligação de um pequeno número de moléculas de adrenalina aos receptores β-adrenérgicos específicos da superfície celular ativa a adenilil-ciclase. Assim, a resposta celular é desencadeada.
receptores -adrenérgico
O receptor β-adrenérgico é uma proteína integral com 7 regiões hidrofóbicas de 20 a 28 resíduos de aminoácidos que “serpenteia” 7 vezes na membrana plasmática. 
A ligação da adrenalina ao sítio no receptor mergulhado na membrana plasmática promove uma alteração conformacional no domínio intracelular do receptor que afeta sua interação com a segunda proteína da rota de transdução do sinal. Como visto anteriormente esta é a proteína G estimulatória. 
> diversos mecanismos levam ao término da resposta β-adrenérgica 
Para ser funcional, um sistema de transdução de sinal deve ser desligado após o término do estímulo pelo hormônio ou por outra molécula, e os mecanismos para a desativação do sinal são intrínsecos a todos os sistemas de sinalização.
A maioria dos sistemas também se adapta a presença contínua do sinal por tornar-se menos sensível, no processo de dessensibilização. O sistema adrenérgico ilustra ambos. 
Diminuição da concentração de adrenalina na corrente sanguínea.
Hidrólise do GTP ligado à subunidade Gα (atividade GTPásica intrínseca da proteína G).
Remoção do segundo mensageiro: hidrólise do AMPc a 5’-AMP pela AMPc fosfodiesterase.
Efeitos metabólicos que resultam da fosforilação enzimática podem ser revertidos pela ação de fosfoproteínas fosfatases, que hidrolisam os resíduos de Ser, Thr ou Tyr fosforilados.
Dessensibilização.
> dessensibilização do receptor β-adrenérgico na presença constante de adrenalina 
Fosfolipase C ativada por hormônio
Uma segunda ampla classe de receptores associados a proteínas G (GPCRs) se acopla por meio de uma proteína G a uma fosfolipase C da membrana plasmática, a qual é específica para o fosfolipídeo de membrana fosfatidil-inositol-4,5-bifosfato (PIP2) 
Exemplos de hormônios que agem por este mecanismo são os agonistas α1-adrenérgicos: 
- noradrenalina - fenilefrina - metoxamina - cirazolina 
- xylometazolina 
Ações específicas do receptor α1 envolvem sobretudo contração do músculo liso. Ela provoca vasoconstrição em muitos vasos sanguíneos, incluindo os da pele e do sistema gastrointestinal além dos rins (artéria renal) e no cérebro. 
Outras áreas de contração do músculo liso são:
uretra
ducto deferente
pelos (músculo eretor de pelo)
útero (na gravidez)
bronquíolos 
vasos sanguíneos do corpo ciliar (a estimulação provoca midríase).
Outros efeitos incluem a glicogenólise a partir da reserva de glicogênio do fígado. 
Alguns antagonistas são usados na hipertensão.
Prazosina é um fármaco relacionado com o controle da hipertensão. Bloqueia receptores alfa-adrenérgicos pós-sinápticos da terminação nervosa simpática. Causa vasodilatação, reduzindo a resistência periférica. 
Dois segundos mensageiros intracelulares são produzidos pelo sistema de fosfatidil-inositol sensível a hormônio: inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol.
Ambos segundos mensageiros contribuem para a ativação da proteína quinase C.
Pelo aumento da [Ca2+] citosólica, o IP3 também ativa outras enzimas dependentes de cálcio. Assim o cálcio também atua como um segundo mensageiro 
Existem diversas isoenzimas da PKC, cada uma com distribuição tecidual, especificidade para proteína-alvo e função características. Alvos incluem proteínas do citoesqueleto e enzimas nucleares que regulam a expressão gênica.
O cálcio é um segundo mensageiro que pode ser localizado no espaço (compartimentalização) e no tempo (ação temporal dos sinais hormonais). Nas células não estimuladas, a concentração de cálcio citosólica é mantida muito baixa (<10-7 M) através da ação de bombas de cálcio localizadas no RE, na mitocôndria e na membrana plasmática.
Estímulos hormonais causam o influxo de cálcio para dentro da célula através de canais de cálcio específicos da membrana plasmática, ou causam a liberação do cálcio sequestrado no RE ou na mitocôndria. Isto eleva a concentração citosólica de cálcio iniciando uma resposta celular
Variações na concentração intracelular de cálcio são detectadas por proteínas ligantes de cálcio, como por exemplo, a calmodulina.
A calmodulina é uma proteína com quatro sítios de ligação a cálcio de alta afinidade. A ligação do cálcio à calmodulina leva a mudanças na conformação da proteína. 
Duas extremidades globulares ligadas por uma alfa-hélice; há quatro sítios de ligação para o cálcio, dois na porção amino terminal e dois na região carboxil terminal
A calmodulina é uma subunidade de regulação da quinase da fosforilase b do músculo, que é ativada por cálcio. Isto é particularmente interessante, porque o cálcio inicia as contrações musculares que requerem ATP ao mesmo tempo em que ativa a degradação do glicogênio, fornecendo o combustível para a síntese de ATP. 
Outra variação é a ocorrência de lampejos (liberação rápida de cálcio por um único canal), baforadas (liberação rápida de cálcio por um conjunto de canais) e ondas (aumentos transitórios na concentração de cálcio intracelular que são limitados a regiões subcelulares específicas). 
2. receptores relacionados às enzimas
Funcionam como enzimas ou estão diretamente associados a enzimas (proteína-quinases) 
Os receptores tirosina-quinases, uma grande família de receptores de membrana plasmática com atividade quinásica intrínseca possuem um domínio de interação com o ligante na face extracelular da membrana plasmática e um sítio ativo enzimático na face citoplasmática, conectados por um único segmento transmembrana.
O domínio citoplasmático é uma proteína quinase que fosforila resíduos de Tyr em proteínas-alvo específicas. Os receptores da insulina, do fator de crescimento da epiderme e do fator de crescimento derivado de plaquetas são os protótipos deste grupo
A insulina regula tanto as enzimas do metabolismo quanto a expressão gênica. Ela não entra nas células, mas inicia um sinal que viaja por uma rota ramificada, desde o receptor na membrana plasmática até as enzimas sensíveis à insulina no citosol e também no núcleo, onde estimula a transcrição de genes específicos.
regulação da expressão gênica pela insulina 
O IRS-1 também estimula a síntese de outro mensageiro secundário: o fosfatidil inositol-3,4,5-trisfosfato (PIP3)
Ativação da glicogênio sintase e do transporte de glicose no músculo. Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2), Fosfatidil inositol-3,4,5-trisfosfato (PIP3), Proteína-quinase dependente de 3-fosfoinositídeo (PDK1) 
As guanilil-ciclases são enzimas receptoras que, quando ativadas, convertem GTP ao segundo mensageiro monofosfato cíclico de 3’,5’-guanosina (GMP cíclico, GMPc).
Muitas ações do GMPc em animais são mediadas pela proteína quinase dependente de GMPc (proteína-quinase G, PKG). Esta proteína fosforila resíduos de Ser e Thr em proteínas-alvo.
Integrinas: receptores bidirecionais de adesão celular
 	As integrinas compõem uma família de receptores diméricos (subunidades αβ) da membrana plasmática que interagem com macromoléculas extracelulares e com o citoesqueleto, transmitindo sinais para dentro e para fora da célula.
As formas ativa e a inativa de uma integrina diferem na conformação dos domínios extracelulares. 
Eventos e sinais intracelulares e extracelularespodem converter as formas ativa e inativa.
As integrinas medeiam diferentes aspectos da resposta imunológica, coagulação sanguínea e angiogênese, e participam da metástase tumoral, por exemplo. 
Em muitas integrinas, a subunidade α possui alguns sítios de ligação ao cálcio, que são essenciais para a atividade de integração com o ligante 
Os ligantes da matriz extracelular incluem proteínas como o colágeno ou proteoglicanos como o heparan-sulfato.
A interação com o ligante extracelular é comunicada aos domínios citosólicos, originando mudanças conformacionais que afetam a associação das integrinas com proteínas como a Talina, que conectam as integrinas aos filamentos de actina do citoesqueleto sob a membrana plasmática.
A interação com ligantes proteicos intracelulares ao domínio citosólico pode alterar a afinidade das integrinas pelos parceiros de ligação extracelulares, alterando a adesão da célula à matriz extracelular.
3. receptores vinculados a canais iônicos
Sinalização sináptica entre células excitáveis eletricamente → abertura ou fechamento de canal iônico
A difusão seletiva de íons gera um potecial de membrana 
O custo energético de mover um íon depende do potencial eletroquímico, que é a soma dos gradientes químico e elétrico:
A ATPase de Na+K+ produz um potencial elétrico transmembrana de aproximadamente -60 mV.
Produção e condução dos potenciais de ação neuronais
A sinalização envolvendo a abertura de canais iônicos pode ser de dois tipos:
1- alteração no potencial de membrana, que por sua vez afeta proteínas na membrana sensíveis a mudanças no potencial.
2- alteração na concentração citosólica de um íon (Ca2+, por exemplo), que atua como segundo mensageiro (o hormônio ou neurotransmissor é o primeiro mensageiro)
Inicialmente, a membrana plasmática do neurônio pré-sináptico está polarizada (interior negativo) pela ação da ATPase de Na+K+ eletrogênica.
- a estimulação deste neurônio (não mostrada) causa o avanço de um potencial de ação ao longo do axônio (flechas brancas), que se distancia do corpo celular. A abertura de um canal de sódio controlado por voltagem permite a entrada de Na+, e a despolarização local resultante causa a abertura dos canais de Na+ adjacentes, e assim por diante. A inativação é extremamente rápida (fechamento). A saída de potássio por canais voltagem-dependentes repolariza a membrana.
- quando a onda de despolarização atinge a extremidade do axônio, canais de Ca2+ controlados por voltagem se abrem, permitindo a entrada de Ca2+.
Canais de Na+ controlados por voltagem em neurônios
Os canais de sódio de diferentes tecidos e organismos possuem uma grande variedade de subunidades, porém apenas a subunidade principal (α) é essencial. 
- a subunidade alfa é uma proteína grande com quatro domínios homólogos (I a IV), cada um contendo seis hélices transmembrana.
-a hélice 4 de cada domínio (em azul) é o sensor de voltagem; supõe-se que a hélice 6 (em laranja) seja o portão que controla a ativação.
- os segmentos entre as hélices 5 e 6, a região do poro em vermelho, formam o filtro de seletividade.
- o segmento conectando os domínios III e IV (em verde) é o portão que controla a inativação.
- os quatro domínios são enrolados ao redor de um canal transmembrana central revestido com resíduos de aminoácidos polares.
- as quatro regiões do poro (em vermelho) aproximam-se da superfície extracelular para formar o filtro de seletividade. 
- o filtro garante ao canal a capacidade de discriminar entre o Na+ e outros íons de tamanho similar
- o portão controlador da inativação (em verde) se fecha (linhas pontilhadas) logo após a abertura do portão controlador da ativação.
O mecanismo sensor da voltagem envolve o movimento perpendicular em relação ao plano da membrana da hélice 4 em resposta a uma variação no potencial transmembrana. 
Como mostrado no painel superior, a forte carga positiva da hélice 4 possibilita que ela seja atraída para dentro da célula em resposta ao potencial de membrana quando o interior é negativo. 
A despolarização reduz esta atração, e a hélice 4 relaxa, movendo-se em direção ao exterior (painel inferior).
Este movimento é comunicado ao portão que controla a ativação (em laranja), induzindo alterações conformacionais que abrem o canal em resposta à despolarização.
O receptor de acetilcolina é um canal iônico controlado por ligante
a) Cada uma das 5 subunidades homólogas (α2βγδ) possui quatro hélices transmembrana (M1 a M4). As hélices M2 são anfipáticas; as outras contêm principalmente resíduos hidrofóbicos. 
b) As 5 subunidades são arranjadas ao redor de um canal transmembrana central, que é revestido pelos resíduos polares das hélices M2. Nas extremidades superior e inferior do canal estão anéis de resíduos de aminoácidos negativamente carregados (polares).
c) Modelo do receptor de acetilcolina, com base na estrutura determinada por microscopia eletrônica e raios X 
A vista superior de um corte transversal através dos centros das hélices M2 mostra cinco cadeias laterais de leucina (em amarelo), uma de cada hélice M2, projetando-se para dentro do canal e constrigindo-o um diâmetro pequeno demais para permitir a passagem de Ca2+, Na+ ou K+.
Quando ambos os sítios de ligação a acetilcolina (um de cada subunidade alfa) estão ocupados, ocorre uma mudança conformacional.
À medida que as hélices M2 se torcem levemente, os cinco resíduos de leucina são afastados do canal e são substituídos por resíduos polares menores (em azul). Este mecanismo de controle abre o canal, permitindo a passagem de Ca2+, Na+ ou K+. 
4. receptores não ligados a membranas 
Livres no citosol ou núcleo; receptores dos hormônios esteroides 
mecanismo geral por meio do qual os hormônios esteroides e da tireóide, retinóides e vitamina D regulam a expressão gênica