Roteiro Prático - Separação e Purificação de Proteínas

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Isolamento e Caracterização de
Imunoglobulina G de soro 
de coelho (IgG)
A resposta imune consiste em dois
sistemas complementares, o sistema imune
humoral e o celular.
No centro da resposta imune humoral
estão proteínas solúveis chamadas anticorpos
ou imunoglobulinas, abreviadas como Ig.
A imunoglobulina G é a principal classe
de moléculas de anticorpo e é uma das
proteínas mais abundantes no soro.
IgG
IgG
Estrutura
Covalente da
molécula de IgG
IgG Estrutura tridimensional 
da molécula de IgG
IgG
Ligação da IgG com um antígeno
Ética
•BOM SENSO 
•RESPEITO PELO 
ANIMAL 
Ética
PRINCÍPIOS BÁSICOS
Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Prefeitura do 
Campus Administrativo da USP em Ribeirão Preto - SP
Os princípios que servem de base para a normatização desta CEUA foram 
propostos em 1959 por Russel e Burch e ratificados em Assembléia da 
UNESCO, em Bruxelas, em 27/01/78, que culminou com a Declaração dos 
Direitos dos Animais, especificamente em seus artigos 8º, letra a) e b) e 
14º. 
- Refinamento - Visa a redução da dor e do sofrimento animal através do 
aprimoramento de técnicas que permitam a manutenção da integridade 
científica em um experimento.
- Redução - Refere-se a incorporação de técnicas e abordagens que 
reduzam o número de animais utilizados.
- Substituição - Visa a busca e utilização de métodos que permitam a 
obtenção de resultados científicos sem a utilização de animais.
Ética
Em nossa universidade
Antes de se iniciar a pesquisa deve-se preencher um 
formulário da “Comissão de ética no uso de 
animais” (CEUA)
Informar 
• TODOS procedimentos técnicos utilizados no 
experimento com animal incluindo técnicas de 
sacrifício.
• Número de animais utilizados.
• Local de trabalho.
Ética
• Limpar bem o local do experimento antes e 
após o trabalho com o animal,pois este 
exala odores que podem estressar outros 
animais em teste.
• O sacrifício do animal deve ser feito em 
local separado dos outros animais pois ele 
emite sons e odores “avisando” que está em 
perigo. Além do estresse nos outros 
animais, pode-se obter como conseqüência 
resultados equivocados. 
Notas importantes
Ética
Todas as pessoas que praticam experimentação 
biológica devem tomar consciência de que o 
animal é dotado de sensibilidade, de memória e 
que sofre sem poder escapar à dor......
Ética
Escolha do animal
•Coelho
•Fêmea 
Sangria
•Anestesia (xilasina – relaxante muscular (5 mg/Kg)
+ ketamina – anestésico (35 mg/Kg))
•Punção cardíaca (eutanásia em câmara de CO2)
•Obtenção do soro
Animal
• Coelho fêmea: Animal dócil, de fácil manuseio, 
controle e alojamento
• 2,5Kg 80mL sangue e 40mL soro
Animal e sexo
Animal
Fonte de material: Soro de coelho
Precipitação com sulfato de 
amônio 40% de saturação
Diálise
Centrifugação
Primeira Etapa do Processo de 
Purificação de IgG
Precipitação Salina
• É a sedimentação de uma macromolécula (não
eletrólito), a partir da ajuda de sais (eletrólitos).
Sendo que a sedimentação é seguida de uma
filtração (ou centrifugação) para que o material seja
completamente concentrado.
• Ocorre quando a proteína (macromolécula) está em
meio aquoso, em seu pI (ponto isoelétrico) e em
baixa força iônica.
• Os precipitados protéicos mantêm sua conformação 
nativa e podem ser dissolvidos novamente sem que 
ocorra desnaturação.
Precipitação salina
SOLUBILIDADE
• A solubilidade de uma protéina depende de suas
interações polares com o solvente aquoso.
• O aumento da concentração de íons ocasiona uma
competição entre a macromolécula e o íon salino pelo
solvente. A solubilidade do íon salino é maior devido a
sua concentração no meio, além da sua propriedade
hidrofílica. Assim, a adição de sal à solução promove a
precipitação da macromolécula, devido a competição
entre eles pela camada de solvatação.(”salting out”)
• Solubilidade da proteína aumenta em baixas
concentrações do sal, em meio aquoso, devido a baixa
força iônica do meio. (“ salting in”)
Precipitação salina
Precipitação salina
SALTING-IN
É o aumento da solubilidade da proteína (diminui a
interação proteína-proteína), devido a adição de
pequenas quantidades de sal (eletrólito) à solução.
O efeito é maior em ânions fracamente hidratados.
Precipitação salina
SALTING-OUT
É a diminuição da solubilidade da proteína (predominância da
interação proteína-proteína), devido a adição de um sal
(eletrólito) à solução. O efeito é maior em ânions fortemente
hidratados.
Esse processo depende da hidrofobicidade da proteína, da
força iônica do sal, da temperatura e do pH do meio.
Precipitação salina
SULFATO DE AMÔNIO (NH4)2SO4
• É um sal divalente, de grande solubilidade em água, que
não promove a desnaturação da proteína,
independentemente da sua concentração.
• É utilizado em 40% de saturação, pois nessa porcentagem
ocorre a precipitação das frações  e β globulinas do soro.
• O sulfato de amônio é largamente utilizado em protocolos
de isolamento de proteínas. Em geral, fornece
preparações com menor grau de contaminação e maior
concentração da proteína de interesse.
Precipitação salina
Perfil Eletroforética das Proteínas do Soro
Precipitação salina
KCl
MgSO4
(NH4)2SO4
Solubilidade
Força iônica
Precipitação salina
Centrifugação
• A centrifugação é um
processo de separação
em que a força centrífuga
relativa gerada pela
rotação da amostra é
usada para sedimentar
sólidos em líquidos, ou
líquidos imiscíveis de
diferentes densidades,
separando-os.
Centrifugação
UNIDADES
A velocidade com que a centrífuga é
operada é geralmente expressa em
termos de números de rotações por
minuto (rpm) do rotor. Frequentemente é
desejavel expressar rpm como aceleração
angular ou o número de vezes que a força
da gravidade é excedida (nº de “g’s”).
Centrifugação
FÓRMULA DE CONVERSÃO
• FCR = 0.00001118 × R × N2
• Onde FCR é a força centrífuga relativa, R é o raio
de centrifugação, em milímetros, e N a velocidade
de centrifugação em rotações por minuto (rpm).
• A unidade de medida da força centrífuga relativa é o
"g", sendo 1g equivalente à aceleração da
gravidade na superfície da terra.
Centrifugação
Diálise
Método baseado no princípio da difusão através de uma membrana 
semi-permeável.
Utilizado para remover sais e moléculas de baixo peso molecular de 
uma solução concentrada com proteínas precipitadas durante o 
processo de purificação.
Diálise
COMO SERÁ REALIZADA A DIÁLISE NESSE 
EXPERIMENTO?
O saco de diálise é
colocado em um recipiente
contendo uma solução
tampão, a qual deve ser
trocada sempre que
necessário, até que ocorra
a retirada total de sal e
haja o equilíbrio entre a
solução contendo IgG e a
solução tampão. Com agitação constante
Diálise
• A solução concentrada contendo IgG é colocada dentro do saco 
de diálise, que nada mais é do que um saquinho de membrana 
semi-permeável (celulose) .
VOLTANDO À NOSSA 
AMOSTRA...
Centrifugação por 
10 minutos a 5000 
rpm (3913g).
Despreze o 
sobrenadante.
Precipitação 
salina (40% 
de sulfato 
de amônio)
Ressuspenda o 
precipitado com 
sulfato de 
amônio a 40% e 
o centrifugue 
sob as mesmas 
condições.
Após a 
centrifugação, 
despreze o 
sobrenadante 
e dissolva o 
precipitado 
em 3,5 ml de 
água 
destilada
Solução contendo IgG
em tampão 
fosfato 
0,02mol/L 
pH 7,4
DIÁLISE
Cromatografia
Troca Iônica (DEAE-celulose)
Análise dos perfis cromatográficos pelos
métodos do “spot test” e leitura a 280nm
Eletroforese (SDS-PAGE)
ImunodifusãoCromatografia 
Imunoglobulina
de coelho
Cadeia
pesada
Cadeia
leve
Coeficiente
sedimentação
Massa
molecular
MM cadeia
pesada
Conteúdo
carboidrato
pI 
IgG  1 , 7 S 150 000 50 000 2-3 7,0 
IgM  , 19 S 900 000 68 000 12 6,45 
Características das proteínas a serem
utilizadas para efeito desta etapa de
purificação
IgG
Cromatografia de troca iônica
DEAE-celulose
 Celulose: polímero de 
glicose. Apresenta ligações 
cruzadas de ponte de 
hidrogênio, tendo grupos 
hidroxílicos altamente 
oxidáveis a grupos 
carboxílicos, sendo esta a 
razão que a capacita como 
trocador.
 Vantagem: poros largos, 
facilita acesso das 
substâncias aos grupos 
trocadores.
 Grupos iônicos positivos 
ligados à matriz:
dietilaminoetil
Cromatografia 
Fase estacionária
 DEAE-celulose (resina): trocador aniônico fraco 
(carga positiva)
 Proteínas carregadas negativamente ficam retidas na 
coluna devido à interação com a FE
RNH2 + H+ RNH3+
Cromatografia 
Este método de separação consiste na 
competição entre os componentes 
carregados da amostra e da fase móvel 
pelos sítios carregados da fase 
estacionária
A FE é sólida e a FM é líquida
Realizada em coluna clássica
Cromatografia 
Cromatografia 
+
+ +
+
+
+
+
TAMPÃO
TAMPÃO
+ SAL
F
lu
x
o
 d
e
 s
o
lv
e
n
te
F
lu
x
o
 d
e
 s
o
lv
e
n
te
F
lu
x
o
 d
e
 s
o
lv
e
n
te
 Os componentes adsorvidos pela FE podem ser eluídos, 
por deslocamento com outros íons com o mesmo tipo de 
carga, porém estes íons devem apresentar maior força 
de interação com a fase estacionária.
 A afinidade entre íons da fase móvel e matriz acoplada 
ao grupo trocador podem ser controlados utilizando os 
fatores como pH e força iônica.
 Um aumento da força iônica, isto é, da concentração do 
tampão, faz com que moléculas do soluto eluam de uma 
forma mais rápida e assim utilizamos um menor volume 
de tampão
Cromatografia 
O experimento...
 Eluente usado: tampão fosfato 0,02 mol/L / pH 7,4 e 
tampão fosfato 0,02 mol/L + NaCl 1 mol/L / pH 7,4
 Amostra: soro de coelho precipitado com 40% de 
sulfato de amônio, dialisado contra tampão fosfato.
 Coluna: 8mL
 Fração: 1 mL/tubo, sendo 15 tubos com tampão 
fosfato 0,02 mol/L / pH 7,4 e 15 tubos com tampão 
fosfato 0,02 mol/L + NaCl 1 mol/L / pH 7,4
Cromatografia 
Capacidade da Coluna
 1g resina = 10 mL FE  1 mL soro 
0,8g resina = 8 mL FE  0,8 mL soro 
 1 mL soro  ± 60 mg proteína
0,8 mL soro  ± 48 mg proteína
 0,5mL da fração precipitada a 40% da 
aproximadamente 6mg de proteína.
 Vantagem: alta capacidade da coluna
Cromatografia 
- -
-
-
-
--
--
-
-
-
-
-
+ +
+
+
+
+
+
-
- -
- -
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+- -
-
-
-
-
-
+ +
+ +
0
pH = PI
Carga 
Líquida + -
Ponto isoelétrico
Lembrando que
Metodologia
 O pH inicial é de 7,4 (tampão fosfato) a IgG está com 
carga levemente negativa pois seu PI (7,0) é muito 
próxima deste pH. Sendo assim, a IgG e outras 
proteínas com cargas neutras ou positivas e levemente 
negativa nesta força iônica eluirão diretamente
 Proteínas com carga negativa, neste caso (IgM) PI 
6,45, ficarão retidas na coluna e serão eluídas com 
tampão fosfato 0,02 mol/L pH 7,4 contendo NaCl 1 
mol/L, obedecendo o seguinte equilíbrio:
DEAE+ IgM- + Cl- ↔ DEAE+Cl- + IgM-
Cromatografia 
Perfil cromatográfico de proteínas eluídas em 
DEAE –Celulose analisados pela leitura em 280nm
Cromatografia 
Cromatografia DEAE celulose
0 10 20 30
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
1M
NacL
Aplicamos 0,5mL de soro de coelha normal precipitado e dialisado.
Amostra 19,5mg/mL
coluna 8,5x0,9cm (v= 5,4mL)
fração de 1,0mL/tubo
amostras
ab
s 
28
0n
m
8mL
5 6 7 8
18 19 20 21
“Spot Test”
Eletroforese 
A eletroforese é uma técnica que envolve a 
migração de moléculas ionizadas, quando submetidas a 
uma diferença de potencial aplicada por uma fonte 
elétrica. Essa migração ocorre de acordo com sua 
carga e sua massa molecular.
Utilizaremos essa técnica para averiguar o grau de 
pureza da IgG com base em sua massa molecular, assim 
poderemos separar a IgG de outras proteínas que possam 
ter eluído com ela em determinadas frações obtidas da 
cromatografia. 
Proteínas são moléculas anfóteras, sua carga 
depende do pH em que ela se encontra. Quando o pH é 
igual ao seu pI (ponto isoelétrico), a proteína se encontra 
com carga líquida nula e não ocorre migração 
eletroforética. 
Eletroforese 
Para o tipo de 
eletroforese com que 
iremos trabalhar não 
importa a carga da proteína 
pois cada molécula de 
proteína irá se ligar a um 
grande número de 
moléculas do detergente 
dodecil sulfato de sódio 
(SDS), carregado 
negativamente, superando a 
carga intrínseca da própria 
proteína e fazendo com que 
ela migre em direção ao 
eletrodo positivo, quando 
uma corrente elétrica é 
aplicada. 
Assim, identificaremos a 
proteína de interesse (IgG) não 
pelo seu pI, mas sim pelo sua 
massa molecular.
Eletroforese SDS-PAGEEletroforese 
SDS – Dodecil Sulfato de SódioEletroforese 
+
proteína
Gel de Poliacrilamida
A poliacrilamida é 
uma mistura de 
duas substâncias:
• acrilamida e 
• metilenobis-
acrilamida. 
Eletroforese 
Concentração de Acrilamida
Misturando essas
duas substâncias,
temos a formação de
uma “rede”.
Diferentes
relações entre as
concentrações dessas
permitem a criação de
diferentes gradientes
de separação.
Eletroforese 
A polimerização da acrilamida forma um gel inerte com 
ligações cruzadas que conferem resistência à migração das 
proteínas agindo como uma peneira molecular onde as proteínas 
maiores são retardadas muito mais do que as menores. 
Perfil de migração eletroforéticaEletroforese 
Gel de Empilhamento (4%)
Tris 0.5 mol/L – pH 6.8 500 uL 
Acrilamida/bis 180 uL
Água 1160 uL 
SDS 10% 40 uL
Temed 10% 10 uL
Persulfato de amônio 10 uL
Gel de Corrida (10%)
Tris 1.5 mol/L – pH 8.8 1500 uL 
Acrilamida/bis 1333 uL
Água 1047 uL 
SDS 10% 80 uL
Temed 10% 20 uL
Persulfato de amônio 20 uL
Preparação do GelEletroforese 
Materiais utilizados na 
eletroforese de poliacrilamida
Eletroforese 
Preparação da cuba 
para corrida
Eletroforese 
As proteínas mais abundantes podem ser facilmente 
detectadas (10ug) corando-se o gel com um corante como o 
Coomassie blue, as proteínas menos abundantes podem ser 
visualizadas em géis tratados com coloração de prata ou ouro 
(com o qual pequenas quantidades, como 10 ng de proteína, 
podem ser detectadas em uma banda).
Coomassie blue Prata Ouro
Métodos de coloraçãoEletroforese 
Através da migração relativa dos padrões de massa 
molecular, podemos traçar uma curva de calibração e obter 
o valor da Massa Molecular de uma proteína.
Estimando a Massa Molecular de uma proteínaEletroforese 
Tiroglobulina : 330.000 Da 
Ferritina: 220.000 Da 
Albumina: 67.000 Da 
Catalase: 60.000 Da 
Lactato desidrogenase: 36.000 Da
FosforilaseB : 94.000 Da 
Albumina: 67.000 Da 
Ovoalbumina: 43.000 Da 
Anidrase Carbônica: 30.000 Da 
SBTI: 20.100 Da 
Lactoalbumina: 14.400 Da
1 - Padrões de alto peso molecular 
(PHARMACIA)
2 – Padrões de baixo peso molecular 
(PHARMACIA)
Eletroforese SDS-PAGE - Resultados 
1- PADRÕES DE ALTO PESO MOLECULAR 
2- PICO I – DEAE-CELULOSE
3- PICO II - DEAE-CELULOSE
4- PICO I – DEAE-CELULOSE
5- PICO II – DEAE-CELULOSE
6- PICO II - DEAE-CELULOSE
7- PICO I - DEAE-CELULOSE
8- PICO II – DEAE-CELULOSE
9- PICO I – DEAE-CELULOSE
Eletroforese 
1 2 3 4 5 6 7kDa
225
150
52
8
102
38
9
kDa
180
130
100
56
34
22
IMUNODIFUSÃO
DIFUSÃO RADIAL DUPLA
Esta técnica é baseada no princípio de que ocorre a difusão do
antígeno e do anticorpo em um meio semi sólido (agarose), com a
formação de complexos antígeno-anticorpo estáveis que se precipitam
e formam um halo entre os orifícios.
Técnica: Em uma camada de agarose que recobre uma lâmina de vidro
são feitos orifícios. No orifício central é adicionado antígeno e nos
outros, diluições da amostra purificada. A lâmina é incubada por
24/48 horas. Observa-se o halo de precipitação entre os orifícios.
Após a formação das linhas de precipitação a lâmina é lavada em NaCL
0,15mol/L e seca em estufa 370C. Após este procedimento as lâminas
são coradas com corante Comassie.
Como verificar a funcionalidade da imunoglobulina isolada
Gel antes de corar
Pico 1 Pico 1 
A
n
ti Ig
G
Pico 1 Pico 1
A
n
ti Ig
G
Gel após corar
Pico 1Pico 2
A
n
ti Ig
G
Pico 1Pico 2
A
n
ti Ig
G
Pico 1Pico 2
A
n
ti Ig
G
Pico 1Pico 2
A
n
ti Ig
G
Resultado da Imunodifusão
Dosagem 
de 
Proteína
Dosagem de Proteína 
Sensibilidade: 50 a 100 mg/mL
 Proteínas possuem aminoácidos aromáticos e estes 
apresentam absorção máxima em 280nm. Quanto maior a 
quantidade de proteína eluída, maior a absorção neste 
comprimento de onda. (A = e.b.c)
1. Leitura a 280 nm
 Proteínas apresentam absorção na região de 
280nm(aminoácidos aromáticos) e na região abaixo de 
220 nm (ligação peptídica)
Espectro de absorção ultravioleta da proteína globular -quimotripsina
Dosagem de Proteína 
Vantagens leitura a 280
• Não destrói a amostra e é rápido
• Em 280 nm e em ph neutro somente os aminoácidos
triptofano, tirosina e cistina possuem absortividade
molar relativamente grande, mas estão presentes
em praticamente todas as proteínas.
• Método mais preciso
Desvantagens leitura a 280
• Qualquer substância que absorva em 280 nm é um 
interferente.
• Maior custo: equipamento caro.
Dosagem de Proteína 
Coomassie Brilliant 
Blue 
Complexo: 
Cadeias laterais 
básicas ou aromáticas
Cor: Azul
CH2
-
O3S
N
H5C2
R
N
OC2H5
R
N
CH2
C2H5
Dosagem de Proteína 2. Spot test
Sensibilidade: 0,05 a 4 mg/mL para dosagem (<0,05 para detecção)
Vantagens Spot Test
• Método rápido e barato
• Altamente específico para proteínas
• Poucos interferentes
• Uso de amostras pequenas e de baixa
concentração
• Complexo proteína corante estável
• Resultados confiáveis
• Alta sensibilidade
Dosagem de Proteína 
Spot test pode ser utilizado para medidas 
quantitativas: 
Procedimento:
• É importante pipetar rigorosamente para não cometer erros
• Método trabalhoso para dosagem: recortar os círculos corados, 
eluí-los com SDS 1% e ler a absorbância em 600nm.
• Através da curva de calibração feita com BSA calcular a 
concentração da amostra.
Dosagem de Proteína 
BSA 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 
(mg/mL)
BSA 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 
(mg/mL)
Comparação entre Spot test e 
leitura a 280 nm
• Para a dosagem, a leitura em 280 nm é 
mais precisa, e com isso obteremos a 
massa de proteínas
• Para o perfil da amostra, o spot test 
pode ser utilizado por ser um método 
qualitativo barato e rápido
Dosagem de Proteína 
Sensibilidade: 1 a 10 mg/mL
3.1. Princípio do Método:
Uma solução de proteínas na presença de íons Cu+2 em meio 
moderadamente alcalino, forma um complexo violeta entre o
Cu+2 e os átomos de nitrogênio das ligações peptídicas. A
intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração
de proteínas existente na amostra.
Proteína + Cu+2 Complexo violeta
OH-
BiuretoDosagem de Proteína