Imunoensaio enzimático ELISA

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Imunoensaio Enzimático 
(ELISA)
Imunoensaio Enzimático 
ELISA
Doutoranda em Imunologia: Ana Carla Montino Pimentel
Imunoensaio enzimático ELISA
o Descrito inicialmente em 1972 por Engvall e Perlmann
o Utilizado rotineiramente em laboratórios de análise e 
diagnóstico
oEnsaio Heterogêneo
Na Biologia e biotecnologia é usado para 
detectar e quantificar antígenos e anticorpos 
presentes em uma determinada mistura em 
pequenas concentrações
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
Classificação por métodos utilizados:
• Indireto
• Direto ou Sanduíche
• Competitivo (Antígeno marcado ou anticorpo 
marcado)
• Terceira geração
Imunoensaio enzimático ELISA
Método indireto:
Método Direto ou Sanduíche
Antígeno Amostra (Soro) Anticorpo Detecção Substrato Cromógeno
Anticorpo de captura Amostra contendo o analito Anticorpo de detecção Substrato Cromógeno
Lavagem Lavagem
Lavagem
Lavagem Lavagem Lavagem
Imunoensaio enzimático ELISA
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
Antígeno da amostra
Antígeno marcado
Substrato Cromógeno Substrato Cromógeno
Lavagem
Método competitivo com antígeno marcado
Método competitivo com anticorpo marcado
Anticorpo marcado
Anticorpo amostra
Substrato 
Cromógeno
Substrato 
Cromógeno
Lavagem
Imunoensaio enzimático ELISA
ELISA de terceira geração
Imunoensaio enzimático ELISA
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
Imunoensaio enzimático ELISA
Seleção da placa (Fase 
sólida)
Propriedades do analito
Seleção do tampão de 
bloqueio
Tipo de anticorpo/antígeno 
específico
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
• A placa de microtitulação pode variar de 96 até 384 poços
• São de poliestireno, polímero que possui uma cadeia longa 
de carbono ligado a um anel de benzeno
• A área de superfície dos poços e propriedades químicas 
facilitam a imobilização do Ac/Ag
ELISA- FASE SÓLIDA
Interação Hidrofóbica
Pontes de hidrogênio
Ph do tampão de revestimento
Temperatura da reação
Tempo de incubação
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
ELISA- FASE SÓLIDA
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
ELISA- FASE SÓLIDA
• Os poços podem apresentar diferentes formas
Fundo arredondado Fácil lavagem Fundo plano Fundo plano metade 
da área
Fundo em forma de V
• Os poços apresentam um volume de 320-360 µl
• Volume de trabalho para o ELISA é de 300 µl/por 
poço
• A adsorção do Ag/Ac se dá num total de 100 µl
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
ELISA- FASE SÓLIDA
FUNDO ARREDONDADO
Poços de fundo redondo ou em U, 
melhoram a mistura do analito e a 
completa remoção do líquido durante 
as etapas de lavagem
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
ELISA- FASE SÓLIDA
FÁCIL LAVAGEM
Combinação de fundo plano e 
arredondado, permite uma ótima 
transmissão ótica e melhora a etapa de 
lavagem e remoção do líquido
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
ELISA- FASE SÓLIDA
FUNDO PLANO
Mais usados, permitem uma excelente transmissão 
ótica, que reduz o background, seu uso resulta na 
retenção de líquido residual de até 10µl ao longo 
das bordas de ângulos vivos, na borda inferior, 
tornando –os adequados para imunoensaios nos 
quais o analito pode ser excessivamente sensível a 
secagem extensa.
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
FUNDO PLANO METADE DA ÁREA
ELISA- FASE SÓLIDA
Permitem uma melhor performance do ELISA sobre 
limitado disponibilidade do analito na amostra ou 
condição de custo proibitivo para análise e que 
acomode um volume de trabalho de 50 µl
Greenfield, EA. Antibodies- A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª. Ed., New York, 2014. 
FUNDO EM FORMA DE V
São otimamente adequados para ensaios com beads
ou aglutinação pois sua forma em cone facilita a 
remoção do seu conteúdo sem problemas após a 
centrifugação de até 6000g
ELISA- FASE SÓLIDA
ELISA- FASE SÓLIDA
•Poliestireno puro
•Melhor visibilidade
•ELISA Colorimétricos
•Fluorescência
•Ensaios 
Bioquimicoluminescente/quimioluminescente
•Podem possuir poços transparentes podendo ser 
utilizados no ELISA
ELISA- BLOQUEIO
Previne ligações não específicas de outras moléculas aos 
poços e do analito adsorbido, reduzindo background
Estabiliza o analito imobilizado, aumentando a interação 
entre o antígeno e o anticorpo no ensaio
BLOTTO 
•Consiste de 5% (peso/volume) de leite em pó desnatado preparado 
em TBS 1x ou PBS. 
• Baixo custo
• Não é recomendado o seu uso em técnicas baseadas em 
streptavidina/avidina por causa da presença da biotina endógena no 
tampão
ELISA- Tipos de tampões de bloqueio
Soro Albumina Bovino (BSA)
• Solução de trabalho 5% em PBS
• Por ser proteína purificada, minimiza reação cruzada no ELISA
• Desprovida de biotina endógena, podendo ser usada com 
streptavidina/avidina
ELISA- Tipos de tampões de bloqueio
Tampão de bloqueio método caseína
• Contém a proteína caseína purificada do leite, disponível 
comercialmente a 1% em TPS ou PBS.
• Por ser uma proteína purificada consegue-se limitar reações 
cruzadas, e alguns tampões apresenta azida de sódio 0,1% e não 
deve ser usado como diluente para preparo do anticorpo conjugado-
HRP
Tampão de bloqueio livre de proteína
•Está disponível comercialmente pronto para uso em TBS ou PBS, 
com ou sem 0,05% (V/v) Tween 20
•Permite o completo bloqueio de superfícies ligantes disponíveis.
• A ausência de proteínas neste tampão elimina a reatividade 
cruzada
ELISA- Tipos de tampões de bloqueio
Soro
•Embora não usado rotineiramente no ELISA, soro não imune de cabra, humano, 
rato, ganso e coelho serve como um agente de bloqueio para tecido corado para 
imuno-histoquímica e vários outros métodos celulares de imagem. 
• Soro delipidado contém o complemento endógeno de proteínas do soro 
capazes de adequadamente de bloquear ligações não específicas no local e 
provém um ambiente químico natural para anticorpos quanto aplicados como 
diluentes
Gelatina
Comumente aplicado como agente de bloqueio no ELISA é derivado do extrato da pele de 
peixe. Gelatina de peixe é comercialmente disponível e tampão de bloqueio de peixe em 
gel pode ser usado no ELISA a 3 %em PBS. Sua utilização apresenta diversas vantagens 
sobre outros tampões de bloqueio, por que o seu conteúdo proteíco dificielmente irá 
interagir com analitos de origem de mamíferos e ele efetivamente estabiliza a solução, 
facilitando as interações de ligação do anticorpo. O seu uso no ELISA resulta em redução 
do background levando ao aumento da razão sinal ruído
• PBS ou TBS com ou sem detergente
• Tipos de detergentes
– Não ionico (tween 20,80, Triton X-100, X-114, 
Nonidet P-40, Brij-58.
• São adicionados numa concentração entre 
0,2% e 1%
ELISA- Tampões de Lavagem
Reconhecem diversos anticorpos primários, 
sendo disponíveis para detecção de moléculas 
de Imunoglobulinas inteiras ou fragmentos. 
ELISA- Anticorpo de detecção
Enzima conjugada ao Anticorpo de 
detecção
PEROXIDASEH2O2 +CROMÓGENO (OPD,TMB,ABTS) Fotometria/Luminometria
Fosfatase Alcalina 4-nitrofenol Fluorometria/luminometria
4-metilumbetiferona, AMPPD 
• O uso de um anticorpo secundário em um ELISA 
requer um adequado substrato de detecção.
• Variando no seu grau de sensibilidade, fácil de 
usar e compatível com o equipamento de 
imagem
• Substratos que apresentam alta sensibilidade são 
mais difíceis de otimizar a reação por causa de 
ligações não específicas ou bloqueio ineficiente 
dos poços na placa bem como distorcer a razão 
sinal ruído. 
ELISA- Substratos cromogênicos
TMB
• O mais sensível para detecção do Ac-HRP é o TMB 
(3,3’,5,5’ – tertametilbenzidina).
• Esta solução rapidamente produz uma cor azul sobre o 
processamento enzimático e apresenta o máximo de 
mensuração de densidade ótica (OD) em 652nm.
• As reações são interrompidas pela adição de ácido 
clorídrico, sulfúrico ou fosfórico, resultando em uma 
imediata mudança de cor comum máximo de absorbância 
de 450nm.
• A sensibilidade do TMB varia de aprox. 20 a 80 ng/ml, 
dependendo do fator de diluição do anticorpo primário e 
secundário. 
ELISA- Substratos cromogênicos
OPD
• Sua reação com o anticorpo secundário-HRP resulta numa cor 
amarelo/laranja com o máximo de absorbância de 450nm
• A adição de ácido sulfúrico 2,5 M termina a reação e muda a cor 
para verde, com o máximo de absorbância de 490nm até aprox. 
70ng/ml
ABTS 
• Substrato de reação lenta apresentando diminuição significativa 
de background. 
• A hidrólise do substrato associado ao HRP resulta na coloração 
verde mensurável em 410 e 650 nm. 
• Sua sensibilidade de detecção é aprox. 2,5ng/ml
ELISA- Substratos cromogênicos
PNPP (Nitrofenil-P fosfato sal dissódico)
• Mais usado na detecção de anticorpo conjugado a 
fosfatase. 
• Na presença da fosfatase alcalina PNPP gera uma cor 
amarela mensurável em 405nm.
• A atividade da fosfatase alcalina é ótima em ph 8-10. A 
reação enzimática é parada com fosfatos inorgânicos, 
cianetos, arseniato e EDTA.
ELISA- Substratos cromogênicos
ELISA- Leitura do resultado
Leitor de ELISA: fotômetro multicanal 
para tiras ou placas
•Leitura monocromática: Uso do comprimento de 
onda no qual o produto da reação tem maior 
absorbância
•Leitura bicromática:
•Uso de dois filtros: primário e secundário
•Elimina imperfeições do plástico
•Libera a diferença entre as duas absorbâncias
Quando um raio de energia 
atravessa uma solução a 
energia incidente será maior 
que a energia emergente
ELISA- Validação
Processo que busca assegurar a 
obtenção de resultados 
confiáveis, válidos, pelo uso de 
determinado método analítico
ELISA- Validação
Parâmetros principais:
•Linearidade (Capacidade do método gerar resultados proporcionais a 
concentração do analito)
•Precisão (grau de concordância entre os resultados de análise 
individuais, quando o procedimento é aplicado repedidamente a 
múltiplas análises de replicatas de uma mesma amostra)
•Limite de quantificação (menor concentração do analito que pode ser 
quantificada e geralmente constitui o primeiro ponto de curva)
•Limite de detecção (menor quantidade do analito que pode ser 
identificada por um procedimento analítico com um determinado grau 
de confiança)
•Sensibilidade
•Especificidade
y = 0,3219x - 0,3211
R² = 0,9488
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Série1
Linear (Série1)
Exponencial (Série1)
Linear (Série1)
y = 0,0792e0,5279x
R² = 0,9943
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 4 6 8
Série1
Exponencial (Série1)
Exponencial (Série1)
Linear (Série1)