Enzymology class 3

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Fernando Segato 
Lorena - 2014 
Enzimologia – LOT2017 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
DNA 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Transcrição 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Síntese de proteinas 
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Intracelulares	
  ou	
  endo-­‐enzima	
  
Vias	
  metabólicas	
  
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Extracelular	
  ou	
  exo-­‐enzima	
  
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Pep9deo	
  sinal	
  
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Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Introdução ao mercado mundial de enzimas 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Estruturas tridimensionais e sua determinação 
 
 
 
 Importância da estrutura terciária na atividade catalítica 
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Estrutura das proteínas 
•  Primária 
•  Secundária 
•  Terciária 
•  Quaternária 
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Estrutura primária 
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Estrutura primária 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Estrutura primária 
MSYIKVSGTKLVDGNGKEIILRGAGLGGWMNMENFITGYPGCEYQIREALAEVVGKEKSEFFFDRFLEYFF
QDEDAKFFKSLGLNCIRIAFNYRHFEDDMNPRVLKPEGFKHLDRVIDACAKHGIYTILDLHAVPGGQNTDW
HSDHGTHIANFWKHKDFQDRVVWLWEELAKHYVGNTWIAGYNPLNEPTDPTQTTLIQFYNRIYKAIRDIDP
YHALFLDGNTFASDFSHFGDACKNWENTAYSIHDYSLFGFPASPEPYVSNDTQRRRLRRSYEKKREWMDQR
GLCVWNGEWGPVYARREYEGDRMDAINEERYRVLKDQLDIYNKDRLSWSIWLYKDIGFQGMVYVSRETPYM
QLFKDFLAKKHRLAIDAWGADDTHVRNVYQPLIDHLKREVKPEHQNLYPFPVWKLEDRVGRLARCILVAEY
LVKEWAEHFRGMDEKELDKVAKSFAFENCLQREGLNRILTENATLVKEA !
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Tir – Gli – Gli – Fen – Leu (YGGFL) 
 
 
Leu – Fen – Gli – Gli – Tir (LFGGY) 
resíduo 
Estrutura primária 
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Estrutura primária 
R1 
R2 
R3 
R4 carbonila amino 
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Estrutura secundária 
Linus Pauling 
1901 - 1994 
Robert Corey 
1897 - 1971 
1951 
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Estrutura secundária 
α-hélice lâmina-β 
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Celobiohidrolase 
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Estrutura primária 
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Estrutura terciária 
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Estrutura quaternária 
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Porque é importante conhecer a sequencia de 
aminoácidos de uma proteína? 
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1° determina a estrutura tridimensional da proteína; 
 
 
2° elucidar o mecânismo de ação; 
 
 
3° patologia molecular; 
 
 
4° história evolutiva (paleontologia molecular). 
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The tree of life 
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The tree of life 
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Como a estrutura tridimensional é determinada? 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 1950 - Anfinsen Experiment 
Christian Anfinsen 
1915 - 1995 
100% 
active 
>90% 
active 
Cristalografia de raios-X 
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Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Cristalografia de raios-X 
 O processo completo 
consiste em produzir cristais de 
proteínas (>0.1 mm na sua menor 
dimensão), nos quais as moléculas 
es te jam razoave lmente bem 
ordenadas para que o feixe de 
raios-X incidente sobre esse cristal 
seja difratado gerando um padrão 
de reflexões que, através da análise 
d o s d a d o s c r i s t a l o g r á f i c o s , 
produzam um mapa tri-dimensional 
de dens idade e le t rôn i ca da 
molécula. Um modelo da proteína 
com sequência conhecida deve 
então ser modelado neste mapa. 
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Por que raios-X? 
O uso de radiação eletromagnética para visualizar objetos 
requer que a radiação tenha um comprimento de onda 
comparável às menores características que desejamos 
resolver. Os raios-X tem um comprimento de onda de 
1.54Å. Este valor é próximo à distância entre átomos de 
carbono numa ligação peptídica, sendo então ideal para 
estudar estruturas de proteínas. 
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Por que cristais? 
Incidir Raios-X sobre uma única molécula resultaria num sinal 
extremamente fraco que nunca poderia ser detectado acima do 
nível de barulho, gerado pelo espalhamento da água e do ar. 
Um cristal arranja um número grande de moléculas na mesma 
orientação, então as ondas espalhadas podem ser adicionadas 
em fase aumentando o sinal a um nível que possa ser medido. 
O cristal atua como um amplificador. 
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•  Uma gota é formada misturando-se volumes iguais de 
solução de proteína e de uma solução precipitante. 
gota contendo 
proteína e 
precipitante 
•  Inicialmente a concentração de precipitante na gota é 
metade da sua concentração no poço. 
•  Um volume bem maior de precipitante é colocado em um 
reservatório abaixo da gota. 
Método de difusão de vapor com a gota sentada 
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GP120 - uma 
glicoproteína do 
envelope exterior do 
vírus HIVtipo 1 
Universidade de 
Columbia 
Proteína que liga 
quitina 
RU Groninger 
Lisozima 
NASA 
Dihidrolipoamida 
desidrogenase 
NASA 
Biliverdina-IX redustase 
complexada com NADP 
IBMB-CSIC 
Barcelona 
Exemplos de cristais de proteínas já estudados 
TIM 
LNLS 
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Raios-X e Cristais de Proteínas 
O Experimento : 
Uma vez obtido, o cristal da proteína é irradiado 
com Raios-X 
Placa de Imagem 
Espelhos para 
focalizar o feixe de 
raios-x 
Os raios-X são difratados pelo cristal 
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Padrão de Difração de Raios-X 
Ø  A organização dos pontos 
no padrão está relacionada 
c o m a d i s t r i b u i ç ã o d e 
moléculas no cristal; 
Ø  Diferenças de intensidade 
relacionam-se com a distribuição 
dos átomos na molécula. 
Ø  O espalhamento do feixe de 
raios-X pelo cristal produz o 
padrão de difração; 
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Padrão de Difração de Raios-X 
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Mapa de densidade eletrônica 
O resultado do experimento não é a figura dos átomos , 
mas um mapa de distribuição dos elétrons na molécula, isto 
é, um mapa de densidade eletrônica. No entanto, uma vez 
que os elétrons são mais localizados ao redor do núcleo, o 
mapa de densidade eletrônica nos dá uma boa idéia da 
molécula. 
 
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Resolução 
• Todos os modelos tem uma incerteza na posição dos átomos. 
Valores numéricos pequenos para resolução significam uma 
pequena incerteza, então resolução alta; valores altos significam 
uma grande incerteza, então resolução baixa. 
• A resolução é medida em Ångstroms (Å). 
Está diretamente relacionada com a distância mínima a que dois 
objetos podem estar e ainda serem vistos como dois objetos. 
7.0 Å é uma resolução 
baixa para proteína 
3.0 Å é uma resolução 
média 
1.6 Å é alta resolução 
Quebra na densidade eletrônica 
Posição do CO não está bem definida 
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Mapa de densidade 
eletrônica 
Átomos são inseridos na densidade 
para construir o modelo da 
proteína 
Ajustando o modelo na densidade eletrônica 
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 Construção do modelo da proteína 
Uma vez obtido o mapa de densidade eletrônica, é 
necessário colocar a sequência de aminoácidos da proteína 
dentro da densidade para construir o modelo: 
Uma vez obtida a estrutura tri-dimensional da proteína 
podemos utilizá-la para: entender seu funcionamento... 
Análise do modelo para estudo da função da proteína 
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http://www.cbi.cnpia.embrapa.br 
… visualizar partes específicas de uma proteína como 
sítios de ligação de pequenas moléculas, para entendercomo a ligação acontece... 
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… verificar as distâncias interatômicas... 
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… fazer comparações entre estruturas de proteínas, ... 
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Azul: cargas positivas 
… visualizar a distribuição de cargas na superfície da proteína, etc. 
Vermelho: cargas negativas 
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A informação estrutural é essencial para entender como as 
moléculas biológicas funcionam e fornece conhecimento 
para a obtenção de novos medicamentos para cura de 
doenças como AIDS, Câncer, anemia, diabetes, etc. 
HIV protease ligado a um inibidor 
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 Importância da estrutura terciária na atividade catalítica 	
  
Ligante 
Sítio de ligação 
Características? 
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Encaixe induzido 
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Interação 
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Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Enzimologia – LOT2017 – aula 3 
Grupo prostético 
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Celobiohidrolase 
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Celobiohidrolase 
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Celobiohidrolase 
glutamina 
asparagina 
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Enzimologia – LOT2017 – aula 3 Celobiohidrolase 
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ATENÇÃO