RELATÓRIO ESPECTROFOTOMETRIA

Prévia do material em texto

Universidade Federal do Ceará
Centro de Ciências
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular 
Disciplina: Biofísica
Prof.: Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira
 
 
 
 
 
 
Espectrofotometria
 
 
 
 
 
Paulo Rafael Cardoso de Sousa - 373818
 
 
 
 
 
 
Fortaleza – CE
Novembro – 2017
INTRODUÇÃO
O termo espectroscopia (ou em alguns casos espectrofotometria) é a designação para toda técnica de levantamento de dados físico-químicos através da transmissão, absorção ou reflexão da energia radiante incidente em uma amostra. O fundamento da espectroscopia é a interação de uma radiação eletromagnética e a matéria constituinte da amostra. (CONSTANTINO, SILVA & DONATE, 2004). No procedimento básico, um feixe de energia atravessa a solução, podendo, essa energia incidente, ser refletida, transmitida ou absorvida, gerando informações sobre a qualidade e a quantidade dos componentes do sistema (HEINEINE, 2010).
As ondas que se conhecem como luz, e que são visíveis pelo homem, ocupam uma pequena parte do espectro, onde iniciam-se desde os 380-400 nm até os 700-780 nm. A energia da radiação é medida em nanômetros (nm), sendo a faixa mais utilizada do espectro a ultravioleta (200 nm) até o infravermelho curto (1000 nm) (FIGURA 1).
 
Figura 1. Espectro luminoso
	O espectrofotômetro é o equipamento destinado à análise de radiação e, desta forma, servem para a identificação físico-química, cujo processo é chamado de espectroscopia. Os espectrômetros compreendem uma fonte de energia, um sistema colimador (fenda, lentes etc), um local destinado à amostra, um sistema monocromador e um sistema detector (CONSTANTINO, SILVA & DONATE, 2004).
	Para realizar as análises no espectrofotômetro, um feixe de luz é dirigido até o monocromador, do qual sai a luz monocromática, isto é, luz em torno do comprimento de onda desejado, que pode ser ajustado pelo operador (BRACHT & ISHI-IWAMOTO, 2003). Essa luz refletida passa pelo prisma e sofre uma difração e os componentes monocromáticos chegam aos detectores espectrais, cada um no local correspondente ao seu comprimento de onda. Cada um dos espectros envia um sinal correspondente à energia relativa recebida naquele comprimento de onda e finalmente o fator de referência, em porcentagem, fica registrado. Assim, é possível a análise quantitativa de uma solução através de um comprimento de onda específico desta amostra (RÉGULA, 2004).
OBJETIVOS
Identificar e compreender as operações básicas de um aparelho analítico (espectrofotômetro);
Compreender o espectro de absorção e a análise quantitativa por fotometria;
Calcular a concentração de amostras desconhecidas.
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Materiais utilizados na prática
Espectrofotômetro;
Tubos de ensaio;
Solução mãe (estoque) e solução de amostra desconhecida;
Pipetas e ponteiras;
Pisseta com água destilada.
3.2 Espectro de absorção do Azul de Bromofenol (AB)
Utilizando a solução estoque (mãe) fornecida, cuja concentração era de 4,0 mg/mL de AB, foi retirado 2,0 mL e diluído com 2,0 mL de água. Com a amostra recém diluída, foi construído o espectro de absorção do Azul de Bromofenol, na faixa de comprimento de onda variando de 420 a 700 nm, seguindo de 40 em 40 nm.
Para o uso do espectrofotômetro, o comprimento de onda foi ajustado e o valor de Absorbância foi zerado com água em uma cubeta de plástico (utilizada nas leituras). Posteriormente, a água na cubeta foi retirada e substituída pela solução de Azul de Bromofenol recém diluída e foi realizada novamente a leitura da absorbância.
Os procedimentos acima foram repetidos para cada comprimento de onda e os valores de absorbância foram devidamente anotados. Ao fim das leituras, foi feito um gráfico com os espectros de absorção do Azul de Bromofenol lançando Absorbância (ordenada) X concentração para auxiliar na determinação da concentração real do corante.
3.3 Dosagem calorimétrica de soluções do Azul de Bromofenol (AB)
Para a construção da curva-padrão usando as concentrações conhecidas de Azul de Bromofenol, foram realizadas diluições a partir da solução estoque (mãe) de AB, em seguida, com o valor de absorbância devidamente zerado com água destilada, as diluições foram adicionadas na cubeta para as leituras da absorbância de cada amostra de AB, começando da menor para a maior concentração utilizando o comprimento de onda com maior pico de absorção escolhida na etapa anterior (580 nm). Baseado nas diluições feitas a partir da solução mãe de AB (4,0 mg/mL), foram calculadas as concentrações, em cada tudo de 1 a 6, para possibilitar a construção da curva-padrão. Os dados usados para a curva-padrão foram Abs (eixo Y) e Concentração (eixo X). O fator de correção da curva-padrão foi calculado.
Para o cálculo da concentração da amostra desconhecida (D*), foi utilizado o fator de calibração obtido a partir da curva padrão e, posteriormente, calculadas as concentrações de AB na amostra cuja concentração era desconhecida (D*), usando os valores de Abs obtidos das triplicatas (D1, D2 e D3). Com base na concentração da solução mãe de AB, foi calculado em quanto está diluída a solução D*.
RESULTADOS
O primeiro comprimento de onda utilizado no experimento foi o de 420 nm, o pico máximo de absorção se deu no comprimento de onda de 580 nm com absorbância de 0,253, como observado no gráfico 1.
Gráfico 1. Curva de variação de absorbância do Azul de Bromofenol em diferentes comprimentos de onda.
	Tubo
	Volume (ml) de AB estoque
	Volume de H2O (ml)
	[AB] (mg/ml)
	Absorbância
	Branco
	0,0
	4,0
	0,0
	0,000
	1
	0,5
	3,5
	0,5
	0,070
	2
	1,0
	3,0
	1,0
	0,143
	3
	1,5
	2,5
	1,5
	0,214
	4
	2,0
	2,0
	2,0
	0,279
	5
	3,0
	1,0
	3,0
	0,419
	6
	4,0
	0,0
	4,0
	0,540
	D1
	Amostra fornecida
	Apenas leitura
	0,245
	0,267
	D2
	Amostra fornecida
	Apenas leitura
	0,254
	0,267
	D3
	Amostra fornecida
	Apenas leitura
	0,259
	0,267
	D* (Média)
	-
	-
	0,251
	0,267
	Os resultados das análises de absorbância das amostras diluídas lidas no espectrofotômetro a um comprimento de onda de 580 nm estão dispostos na tabela 1.
Tabela 1. Valores de absorbância e concentração obtidos a partir das análises das amostras conhecidas de AB.
Gráfico 2. Curva-padrão da amostra de AB em diferentes concentrações medidas no espectrofotômetro a 580nm.
DISCUSSÃO
Qual é o pico máximo de absorção de AB?
O pico máximo de absorção de AB foi 580 nm com uma absorbância de 0,189.
Qual o comprimento de onda que deve ser usado para a dosagem calorimétrica do AB, de uma amostra qualquer, cuja concentração é desconhecida?
Como o Azul de Bromofenol possui absorção máxima no comprimento de onda de 580nm, essa é o comprimento ideal para realizar qualquer medição espectrofotométrica, pois é nesse comprimento de onda que o corante vi absorver melhor a luz que passa, variando apenas a absorbância de acordo com a concentração.
Qual o coeficiente de extinção molar de AB, sabendo que sua massa molecular é 669,96 Da?
669,96 g – 1000 mL – 1 mol
4x10-3 g – 1 mL – X
X = 4x10-3 g . 1 mol / 669,96 g = 5,97x10-6 mol.L-1
am = A/c . l
am = 0,540 / 5,97x10-6 M . 1 cm
am = 9x104 M-1.cm-1
D) Mostre como foi calculado o fator de calibração.
A partir das concentrações encontradas nas amostras diluídas, utilizou-se de dois pontos do gráfico, que estivessem dentro da curva para obter o Fator de Calibração.
Cotg a = Cateto Adjacente / Cateto Oposto = Fc
Fc = 3 – 1,75 / 0,419 – 0,252 = 1,25 / 0,167 = 7,485
Qual é a diluição da amostra desconhecida (D*) em relação à solução estoque?
A amostra desconhecida foi diluída 9 vezes.
Qual é a concentração da amostra D*?
CONCLUSÃO
Com a prática foi possível observar a grande importância e funcionalidade da espectrofotometria como uma técnica analítica que permite a identificação de componentes desconhecidos, bem como sua concentração em solução. Além disso, foi possível verificar em qual comprimento de onda a amostra utilizada absorve mais,através dos valores de absorbância que são diretamente proporcionais à concentração da amostra em questão.
REFERÊNCIAS
BRACHT, Adelar; ISHII-IWAMOTO. Métodos de Laboratório em Bioquímica. 1ª Ed. Barueri:Atheneu, 2003, 30p.
CONSTANTINO, M.G., SILVA G. V. J. & DONATE P. M. 2004, "Fundamentos de Química experimental", Editora EdUsp, São Paulo.
HEINEINE, I. F. Biofísica Básica. 2ª Ed. São Paulo: Atheneu, 2010.
RÉGULA, L. M. Padrões virtuais e tolerâncias calorimétricas no controle instrumental das cores. 2004. 135 f. Dissertação (Mestrado em Metrologia) – Curso de Pós-graduação em Metrologia, Pontificia Universidade Católica do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.