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CURSO TECNICO EM BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS PROF.ª BIANCA PFAFFENSELLER RELATÓRIO FINAL DE AULAS PRÁTICAS Jessika Lara, Paula Soares e Thayana Tabarkiewicz 19 de JULHO de 2014 Prática I – SOLUÇÕES TAMPÃO Introdução As soluções tampões são soluções que resistem a mudanças de pH, quando a elas são adicionados ácidos ou bases ou quando uma diluição ocorre. Essa resistência é resultado do equilíbrio entre as espécies participantes do tampão. Um tampão é constituído de uma mistura de um ácido fraco e sua base conjugada, ou de uma base fraca e seu ácido conjugado. “O conceito original de ação tamponante surgiu de estudos bioquímicos e da necessidade do controle do pH em diversos aspectos da pesquisa biológica, como por exemplo em estudos com enzimas que têm sua atividade catalítica muito sensível a variações de pH. Neste contexto, em 1900, Fernbach e Hubert, em seus estudos com a enzima amilase, descobriram que uma solução de ácido fosfórico parcialmente neutralizado agia como uma proteção contra mudanças abruptas na acidez e alcalinidade”¹. A capacidade tamponante é o quanto a solução tampão resiste às variações de pH, quando se adiciona s quantidades de ácido ou base. Os tampões têm a propriedade de resistir a mudanças no pH, isto ocorre porque essas soluções contêm um componente ácido e um básico em sua constituição. É importante lembrar que existe um limite para as quantidades de ácido ou de base adicionados a uma solução tampão antes que um dos componentes seja totalmente consumido. Esse limite é conhecido como a capacidade tamponante de uma solução tampão. Assim, quanto maior a capacidade, maior será o tempo da ação tampão. Os sistemas tampão são escolhidos de acordo com a faixa de pH que se deseja tamponar.Tampões biológicos: Existem mecanismos importantes para a defesa do organismo contra alterações do pH, estes mecanismos, químicos ou então fisiológicos estão interligados. Os mecanismos químicos são representados pelas substâncias químicas que se encontram dissolvidas no plasma e líquido intracelular, que agem como ácidos e bases neutralizando efeitos do aparecimento de quaisquer ácidos ou bases oriundos do próprio metabolismo, de medicamentos ou distúrbios fisiológicos e alimentares (sistemas-tampão). Os órgãos importantes para o funcionamento dos mecanismos filológicos são os pulmões e os rins, que eliminam substâncias indesejáveis ou em excesso, ácidas ou bases, e reservam outras, dependendo da necessidade momentânea do indivíduo. Objetivos: Verificar o efeito do tampão de diferentes soluções e as variáveis que o influenciam. Materiais: 100 mL de solução de fosfato monobásico de potássio 0,1 M 60 mL de solução de fosfato bibásico de potássio 0,1 M 6 mL de HCl 0,1 M 6 mL de NaOH 0,1 M Água destilada Béqueres, provetas Potenciômetro Métodos: - Calibramos o potenciômetro com as soluções padrões de pH 4,0 e 7,0. - Preparamos o tampão fosfato de pH final de 6,5: - Colocamos em um béquer, 100 mL de fosfato monobásico de potássio 0,1 M. Acrescentamos a esta solução fosfato bibásico de potássio 0,1 M até que atingisse o pH de 6,5. Este procedimento foi realizado com adição aos poucos da solução, monitorando o pH com o auxílio do pHmetro. - Capacidade tamponante do tampão fosfato - Colocamos a metade da solução preparada em um béquer e acrescentamos HCl 0,1 M, de 1 em 1 mL, medindo o pH após cada adição - Na outra metade desta solução, colocamos NaOH 0,1 M, de 1 em 1 mL, medindo o pH após cada adição. Resultados: Tampão fosfato (nosso experimento) Medições de pH 0 mL 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL HCl 6,5 6,45 6,42 6,37 6,32 6,27 6,22 NaOH 6,5 6,53 6,58 6,63 6,68 6,72 6,76 *Eixo X: representa a variação do pH da solução tampão de fosfato com a adição de ácido (HCl) e base (NaOH). *Eixo Y: representa o volume adicionado em mL de cada reagente. No preparo do tampão fosfato foi observado que para atingirmos o pH de 6,5 foi necessário a adição de 60 mL de solução de fosfato bibásico de potássio 0,1 M. Foram adicionadas 1190 gotas dessa solução. 1 gota – 50 uL 1190 gotas – x uL X= 59.500uL= 59,5 mL Capacidade tamponante do ácido acético (Colegas) Medições de pH 0 mL 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL HCl 4,68 4,64 4,60 4,56 4,51 4,46 4,41 NaOH 4,68 4,73 4,79 4,84 4,92 4,96 5,02 *Eixo X: representa a variação do pH da solução de ácido acético com a adição de ácido (HCl) e base (NaOH). *Eixo Y: representa o volume adicionado em mL de cada reagente. Capacidade tamponante do leite (colegas) Medições de pH 0 mL 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL HCl 6,70 6,69 6,67 6,64 6,64 6,63 6,61 NaOH 6,70 6,72 6,73 6,76 6,80 6,83 6,86 *Eixo X: representa a variação do pH do leite com a adição de ácido (HCl) e base (NaOH). *Eixo Y: representa o volume adicionado em mL de cada reagente. Capacidade tamponante da água (colegas) Medições de pH 0 mL 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL HCl 5 3,67 3,5 3,09 2,96 2,85 2,18 NaOH 5,15 9,04 9,59 9,89 10,18 10,43 10,61 *Eixo X: representa a variação do pH da água destilada com a adição de ácido (HCl) e base (NaOH). *Eixo Y: representa o volume adicionado em mL de cada reagente. Conclusão: Para o leite proveniente de diversas fontes, após misturado, o pH varia entre 6,6 e 6,8, com média de 6,7 a 20 °C ou 6,6 a 25 °C. No caso da secreção após o parto (colostro), o pH varia de 6,25 no primeiro dia a 6,46 no terceiro. O leite proveniente de animais com mamite é levemente alcalino, podendo atingir pH 7,5. O leite apresenta considerável efeito tampão, especialmente em pH entre 5 e 6, em razão da presença de dióxido de carbono, proteínas, citratos, lactatos e fosfatos. Foi possível observar que dos quatro experimentos realizados, aqueles que têm maior capacidade de tamponamento são: o tampão fosfato, solução de ácido acético e o leite, pois eles têm pouca variação de pH. Já a água tem uma variação muito alta de pH (como observado nos resultados acima). Bibliografia: http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc13/v13a04.pdf PERUZZO, Francisco Miragaia (Tito); CANTO, Eduardo Leite; Química na Abordagem do Cotidiano, Ed. Moderna, vol.1, São Paulo/SP- 1998. ¹ Protocolo da aula prática de soluções tampão. http://qnint.sbq.org.br/qni/visualizarTema.php?idTema=18 Paulo Henrique Fonseca da Silva, originalmente publicado em Química Nova na Escola, n. 6, novembro 1997 Edição: Leila Cardoso Teruya Prática II – TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDO Introdução: Um aminoácido é uma molécula orgânica que contém um grupo amina e um grupo carboxila, e uma cadeia lateral que é específica para cada aminoácido. Os aminoácidos constituem as proteínas. A titulação de aminoácidos determina o pH, onde ocorre desprotonação dos grupos carboxila e amino. Em pH ácido, os AA estão carregados positivamente e em pH alcalino estão carregados negativamente. Ao se adicionar o AA em uma solução ácida, ocorre a protonação dos grupos ionizáveis. Assim com a adição de uma solução básica, observa-se a diminuição da concentração de prótons e eleva o pH. Na titulação de um aminoácido em determinado momento se observa a resistência na variação de pH (efeito tamponante), causado pelo grupamento carboxila (em solução ácida), e pelo grupamento amino (em solução básica). O ponto onde é possível observar o fim da liberação de prótons pelo grupo carboxila é o ponto de isoelétrico, a carga total é igual a zero/nula do aminoácido, após o grupo amino que libera seu próton, que também é possível observar o pI (corresponde ao valor de pH no qual a proteína possui carga global igual a zero). O pK, é o valor de pH onde a metade dos ácidos ou bases estão dissociados e a metade está associada. A titulação, adição ou remoção gradual de H, relacionado a: base (parte-se do pH ácido até chegar ao alcalino) e ácido (parte-se do pH alcalino até chegar ao ácido). A titulação também é útil para determinar a reatividade das cadeias laterais dos aminoácidos. O processo é utilizado para determinar a concentração de uma solução amostra através de sua reação com outra solução de concentração conhecida (padrão). Objetivo: Identificar aminoácidos utilizando os valores de pks obtidos a partir de uma curva de titulação. Materiais: 25 mL de solução de aminoácidos desconhecidos a 0,02 M (preparado em água acidificada – 2 gotas de HCl) NaOH 0,1 M Soluções padrão para calibração dos potenciômetros Béquer 100 mL Potenciômetro Métodos: Calibramos os potenciômetros com padrões de pH 4,0 e 7,0; Medimos o pH da solução de aminoácidos desconhecidos; Transferimos para um béquer 25 mL desta solução; Fomos adicionando a solução de NaOH de 0,5 a 0,5mL até a nona medição, após aumentamos o volume adicionado para 1 em 1 mL; A cada mL adicionado fomos medindo o pH da solução.; Adicionamos base até que o pH atingisse 12. Resultados: Volume de NaOH (mL) pH 25 1,61 25,5 1,59 26 1,66 26,5 1,71 27 1,81 27,5 1,87 28 1,98 28,5 2,09 29,5 2,25 30,5 2,46 31,5 2,85 32,5 4,73 33,5 9,26 34,5 9,78 35,5 10,18 36,5 10,72 37,5 11,30 38,5 11,58 39,5 11,73 40,5 11,81 41,5 11,88 42,5 11,95 43 12 Resultados referente ao NaOH (ml), quantidade adicionada e o pH da solução. pK1= 1,61+1,66+1,81= 1,69 3 pK2= 11,81+11,88+11,95= 11,88 3 pI= 1,69+11,88= 6,78 2 Conclusão: Através do resultado do nosso gráfico foi possível concluir que o aminoácido desconhecido tem um pI de 6,78/2,9% (significa que é o ponto onde o valor de pH do aminoácido apresenta carga elétrica igual a zero). Comparando nossos valores com a tabela de valores de pKs observamos que não conseguimos identificar qual foi o aminoácido desconhecido, pois os valores não se aproximaram da tabela de pKs, talvez se tivéssemos continuado a adicionar base de 0,5 a 0,5mL conseguiríamos chegar nos valores próximos aos da tabela. Com base nos gráficos dos nossos colegas percebemos que eles utilizaram uma quantidade maior de base para atingir o pH 12 do aminoácido, alguns obtiveram a titulação esperada porém outros, não. desconhecido. Bibliografia: Protocolo ‘Titulação de aminoácidos’ http://www.ebah.com.br/content/ABAAABHJkAC/pka-ph-tampao Prática III - Espectrofotometria e quantificação de proteínas pelo método do Biureto Introdução: A partir de soluções de concentrações conhecidas obtemos a curva padrão, que serve para determinar a concentração de substâncias não conhecidas. A curva padrão corresponde à relação gráfica entre os valores de absorbância (A) e os de concentração. A relação entre e concentração da substância e a absorbância é chamada de fator de calibração (FC). Fc = C/A. A concentração de uma substância em uma determinada amostra pode ser determinada através da comparação da intensidade da cor obtida nesta amostra com a intensidade da cor produzida em uma solução padrão aplicando uma regra de três. Para evitar erros de aferição, não é utilizado um único padrão para realizar a comparação. É realizada uma série de determinações com concentrações crescentes da solução padrão, medindo as suas respectivas absorbâncias, a curva padrão. É calculado o fator de calibração para cada solução padrão e é feita uma média destes fatores, o fator de calibração médio (FCM). Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração. Existem métodos para detecção e quantificação de substâncias como essas. O método fotocolorimétrico foi desenvolvido com a finalidade de dosar substâncias biológicas. Neste método são utilizadas reações que resultam em soluções coloridas. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração da substância que está sendo dosada. Em conseqüência desta proporcionalidade, é possível dosar substâncias em soluções de concentração desconhecida (amostra), ao comparar a intensidade da cor produzida por esta substância à intensidade da cor produzida pela mesma substância em outra solução onde a concentração é previamente determinada (padrão). A diferença de coloração é muitas vezes imperceptível a olho nu. A medida da intensidade de cor é efetuada por instrumentos denominados fotocolorímetros ou espectrofotômetros. A que iremos trabalhar é o método de espectrofotometria, uma técnica analítica que avalia a capacidade dos solutos de absorver luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz absorvida permite inferir sobre a concentração do soluto em determinada solução. Compostos desconhecidos podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível ou infravermelho. Quando uma radiação eletromagnética, por exemplo, a luz visível, incide em uma solução, se os fótons da radiação têm energia adequada, a energia associada a essa radiação pode sofrer três diferentes tipos de variações: Ser refletida nas interfaces entre o ar e a parede do frasco contendo a solução (cubeta); Ser dispersa por partículas presentes na solução; Ser absorvida pela solução. Nas aplicações espectrofotométricas, quando se usa energia monocromática em um simples comprimento de onda (λ), a fração de radiação absorvida pela solução, ignorando perdas por reflexão, será função da concentração da solução e da espessura da solução. Portanto, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da espessura atravessada – Lei de Lambert – e o aumento da concentração ou da intensidade de cor da solução – Lei de Beer. A relação entre energia emergente (I) e energia incidente (I0) indica a transmitância (T) da solução. Em espectrofotometria, utiliza-se a absorbância (A) como a intensidade de radiação absorvida pela solução, seguindo as leis de Lambert-Beer. Para quantificarmos a concentração de proteínas na substância é usado o método de Biureto, baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e peptídeos. As ligações peptídicas das proteínas reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das proteínas no meio. O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro-espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. Tem sido também, utilizado em análise por injeção em fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma sanguíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos autores, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva e leite, quando comparado com outros métodos. Objetivo: compreender o princípio, objetivo e prcedimento de uma curva padrão e determinar a concentração de proteínas através do método do Biureto. Materiais: - reativo de Biureto (48 mL) - solução padrão de albumina 5 mg/mL (5 mL) - soluções A, B e C - 16 tubos de ensaio de vidro - espectrofotômetro - cubeta - micropipeta - 2 pipetas de vidro de 5 mL e 1 mL - banho-maria e termômetro. Métodos: - Procedimento para realização da curva padrão: 1. Foram separados 5 tubos de ensaio conforme demonstrado abaixo: Tubo [ ] mg/mL de Albumina Volume de Albumina Volume de água abs a 5mg/µl (µl) 4 2 400 600 3 1,5 300 700 2 1 200 800 1 0,5 100 900 branco 0 0 1000 2. Pipetamos 2,5 mL de biureto em todos os tubos. 3. Agitamos fortemente cada um deles. 4. Deixamos os tubos em banho Maria a 37ºC por 20 minutos. 5. No espectrofotômetro já ligado foi ajustado o comprimento de onda para 546 nm. 6. Zeramos o aparelho no botão de transmitância 100%.com o branco preparado. 7. Medimos as absorbâncias de cada tubo, e anotamos na tabela representada nos resultados. 8. Calculamos o FC de cada tubo (Q/Abs) conforme os cálculos representados nos resultados. - Quantificação de proteínas em Espectrofotômetro – método Biureto: 1. Foram dadas a cada grupo3 soluções com concentrações desconhecidas. 2. Pipetamos conforme a tabela abaixo as soluções necessárias para determinarmos cada concentração: Tubos Branco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 água (mL) 1,0 - - - soluções de albumina (mL) 0,0 1,0 (solução A) 1,0 (solução B) 1,0 (solução C) reagente biureto (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 LEITURAS (Abs) - Concentração mg/mL) - 3. Deixamos os tubos em banho-maria a 37ºC por 20 minutos. 4. Zeramos o aparelho com o branco preparado e realizados as leituras no espectro em 546 nm. 5. Foram anotadas todas as absorbâncias conforme descrito em resultados. 6. Após calculamos a concentração de proteína em cada tubo utilizando o valor obtido na curva padrão realizada previamente e anotamos na tabela também em resultados. Resultados: - Preparação da curva padrão: tubo [ ] de BSA mg/mL volume de BSA volume de água abs a 5mg/µl (µl) 4 2 400 600 0,222 3 1,5 300 700 0,190 2 1 200 800 0,161 1 0,5 100 900 0,126 branco 0 0 1000 - FC= Q/Abs FC4= 2/0,222 = 9,009 FCM= 6,769 FC3= 1,5/0,190= 7,894 FC2= 1/0,161= 6,211 FC1=0,5/0,126= 3,968 -Gráfico Curva Padrão: Curva padrão: Concentração obtida em cada leitura de absorbância feita - Quantificação de proteínas: Tubos Branco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 água (mL) 1,0 - - - soluções de albumina (mL) 0,0 1,0 (solução A) 1,0 (solução B) 1,0 (solução C) reagente biureto (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 LEITURAS (Abs) - 0,285 0,206 0,152 Concentração mg/mL) - 1,929 1,394 1,028 Conclusão: Através da preparação da Curva Padrão é possível determinar a concentração de uma solução desconhecida, juntamente com a leitura dessas soluções no espectrofotômetro. Conforme foi visto em aula, para determinar a concentração de uma solução desconhecida é preciso ter uma curva padrão para obtermos um fator de calibração médio (FCM) de cada tubo, que é diretamente proporcional a concentração. Quando se tem os valores de absorbância dessas soluções e o FCM é possível determinar a concentração com a fórmula a seguir: Q = FCM x Abs. O esperado de uma curva padrão é que fique neste sentido: Nossa curva não ficou exatamente como é esperado, mas ficou boa. As razões para não ficar assim, podem ser: alguns erros na pipetagem, reagentes não muito bons ou sem 100% de pureza. Comparando nossos resultados com os demais grupos, observamos que a determinação da quantificação das proteínas nas soluções A, B e C foram semelhante as nossas (principalmente na solução B), com exceção de apenas um grupo que não teve sucesso na realização da curva padrão. Bibliografia: Roteiro de prática “Espectrofotometria e Quantificação de proteínas pelo método do Biureto”. IFRS – Técnico em Biotecnologia – Biotec 2 2014/1 Espectrometria e curvas. Disponível em: http://pt.scribd.com/doc/51162574/ESPECTROFOTOMETRIA-E-CURVAS. Acesso 27.03.14 Curva padrão. Disponível em: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html. Acesso 15.07.14 Análise pelo espectrofotômetro e curva padrão. Disponível em: http://pt.scribd.com/doc/19825031/Analise-pelo-espectrofotometro-e-curva-padrao. Acesso 15.07.14 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914.pdf. Acesso 15.07.14 Prática IV – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE LOWRY Introdução: De toda célula viva as proteínas são as maiores constituintes, cada uma com sua estrutura molecular e função. Para dosagem de proteínas existem vários métodos, um deles é o de Follin-Ciocalteau-Lowry. O método que atualmente conhecemos como de Lowry e cols., para a determinação de proteínas totais, foi originalmente proposto por Wu, em 1922, sendo esta a metodologia mais utilizada para a determinação de proteínas. O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre. Além de ser 100x mais sensível que o método biureto, sua sensibilidade e é muito alta, por isto, tem sido utilizado para a determinação da concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: líqüor, plasma sangüíneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar, membranas, leite humano e produtos alimentícios. São poucas as substâncias potencialmente interferentes, sendo a sacarose, em alta concentração, uma das poucas. Porém, é lento. Esse método apresenta limite de detecção de 0,7 mg.L-1 e leituras de absorbância em comprimento de onda 750 nm, em meio alcalino, a proteína reage com o cobre formando um complexo com capacidade de reduzir o reagente de Fenol (Folin – Ciocalteau) obtendo-se um composto de cor azul intensa. A espectrofotometria de absorção permite quantificar no espectrofotômetro a quantidade de luz absorvida (absorbância) das proteínas e, consequentemente, medir a concentração dessas biomoléculas em determinado meio. Segundo a lei de Lambert-Beer, a absorbância é diretamente proporcional à concentração da amostra quando uma faixa de luz monocromática atravessa a solução. A determinação da concentração de proteínas em uma solução por espectrofotometria envolve a comparação da absorbância da solução estudada a uma solução padrão, onde a concentração já é conhecida. Com os valores de absorbância e de concentração definidos, pode-se traçar uma curva padrão. Neste gráfico se observa uma linearidade, que indica a proporcionalidade entre o aumento da absorbância e da concentração de proteínas. A curva padrão serve de base para a análise da amostra desconhecida, pois com ela obtém-se o fator de calibração médio (FCM), que servirá de base para o cálculo da concentração de proteínas na amostra. É importante estabelecer o branco, que deve ter o mesmo volume final das amostras e das soluções padrões. Este serve para calibrar o espectrofotômetro, isto é, o aparelho é ajustado de forma que, no comprimento de onda escolhido, identifique absorbância zero. Objetivos: utilizar um método espectrofotométrico de quantificação de proteínas e determinar a concentração de proteínas em uma amostra biológica pelo método de Lowry. Materiais: - 14 tubos de vidro - Proveta de 50 mL - Pipetas de vidro 1 mL e 5 mL. - Micropipeta de 1 mL e 200µ e ponteiras respectivas - Solução padrão de albumina a 5 mg/mL - Amostra: leite. - Reagente A: previamente preparado (5 g/L de sulfato de cobre e 10g/L de citrato de sódio. - Reagente B: previamente preparado (20g/L de carbonato de cálcio, 4g/L de NaOH. - Reagente C: 35 mL (2,5 mL em cada tubo x 14 tubos) = preparado no momento de uso. 1 parte do reagente A + 50 partes do reagente B. - Reagente D: 3,5 mL (250µ em cada tubo). Partes iguais de reagente de Folin Clocaltens 2N e água. - Espectrofotômetro. Procedimentos: Para se obter a curva padrão é necessário pipetar conforme tabela abaixo: Tubo [ ] de BSA mg/mL Volume (µl) de BSA Volume de água Reag C (mL) Reag D (µL) a 5mg/mL (µL) 5 0,5 100 900 2,5 250 4 0,4 80 920 2,5 250 3 0,3 60 940 2,5 250 2 0,2 40 960 2,5 250 1 0,1 20 980 2,5 250 Branco 0 0 1000 2,5 250 Preparo da amostra a ser quantificada: -A amostra (leite) deve ser diluída de forma que a sua concentração fique dentro da amplitude da curva padrão (0,1 – 0,5 mg/mL). Para este procedimento, o leite deverá ser diluído 80x, sendo que o volume final da amostra deverá ser de 5 mL. - Após a diluição da amostra, foi pipetado em 2 tubos de ensaio conforme a tabela abaixo: Tubos volume amostra (µL) volume água (µL) Reag C (mL) Reag D (µL) amostra 1 2000 µL 500 µL 2,5 250 amostra 2 2000 µL 500 µL 2,5 250 - Preparar o reagente C: 1 parte do reagente A + 50 partes do reagente B totalizando 35 mL. - Adição do reagente C em cada tubo de ensaio. - Incubação por 5 minutos à temperatura ambiente. - Adicionar 250 µL do reagente D e aguardar 30 minutos à temperatura ambiente e no escuro (pois o reagente D reage com a luz). - Leitura da absorbância em espectrofotômetro a 750 nm. Resultados: Cálculo para preparação do reagente C: - Reagente C 35 mL/50= 0,7 mL ou 700 µl (uma parte) 1 parte do reagente A + 50 partes do reagente B = 700 µL (reagente A) + 34,3 mL (reagente B) Cálculos para preparação da diluição da amostra: - o volume final da amostra teve que ser diluído por 80x, portanto: 2000 µL/80= 25 µl (volume da amostra a ser usado) 1750 µl (água) Curva Padrão: tubo Leituras (Abs) 5 1,275 4 1,075 3 0,801 2 0,56 1 0,355 Gráfico da curva padrão: Concentração obtida em cada leitura de absorbância feita. Fator de Calibração (FC=Q/Abs) FC1 = 0,1/0,355 = 0,281 FC2 = 0,2/0,560 = 0,357 FC3= 0,3/0,801 = 0,374 FC4 = 0,4/1,075 = 0,372 FC5 = 0,5/1,275 = 0,392 FCM = 0,281+0,357+0,374+0,372+0,392 = 0,355 5 FCM= 0,355 Quantificação de proteínas na amostra - Para quantificação de proteínas na amostra é necessário o cálculo: Q = FCM x A. tubo Leituras [ ] (Abs) mg/mL amostra 1 1,509 0,53 amostra 2 1,37 0,48 [ ] Amostra 1 = 0,355 x 1,509 = 0,53 [ ] Amostra 2 = 0,355 x 1,370 = 0,48 Q = 0,53 + 0,48 = 0,505 x 80* x 2* = 80,8 mg/mL 2 * x80 = pois a amostra foi diluída em 80x para realização do experimento. * x 2 = A multiplicação por 2 é devido a uma segunda diluição q se fez ao colocar 500 uL da amostra e 500 uL de água no tubo da amostra. Conclusão: Através da quantificação de proteínas pelo método de Lowry, se obteve na amostra de leite que a quantidade de proteínas existente nela é de 80 mg/mL. Resultado este, devido a medições do espectrofotômetro, com auxilio do reagente de Fenol (Folin – Ciocalteau) que forma um complexo com a proteína da amostra com coloração azul, possibilitando a quantificação espectrofotométrica. Observamos que há uma grande quantidade de proteínas presente no leite, em média 6g para cada 200mL, equivalente a 33,33mg/mL, em um total de 30g por litro (valores referentes a informação nutricional descrita na embalagem leite Elegê. O resultado que nós obtivemos em nossa análise foi de 80,8 mg/mL o que comparado com o resultado dos outros grupos foi uma quantidade muito maior de proteínas em nossa amostra, já que o resultado dos outros grupos foram todos abaixo de 40mg/mL. Nossa curva padrão como o nosso resultado, não foram bons, já que em ambos é possível perceber que houve um grande erro. Nossa curva não ficou nada linear e o nosso resultado da amostra foi mais do que o dobro do verdadeiro valor proteico da amostra. Referências: Relatório de prática “Quantificação de proteínas em espectrofotômetro – Método de Lowry”. IFRS – Técnico em biotecnologia – biotec 2 2014/1 Método Lowry. Disponível em: www.ebah.com.br/content/ABAAAA1tcAJ/metodo-lowry. ACESSO: 06.04.14 Leite Longa Vida UHT Integral Elegê - 1L. Disponível em: http://www.elege.com.br/detalhamento.cfm?marca=3&codigo=15. ACESSO: 17.07.14 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914.pdf. Acesso 17.07.14 Quantificação de proteínas pelo método Lowry. Disponível em: http://www.trabalhosfeitos.com/ensaios/Quantifica%C3%A7%C3%A3o-De-Prote%C3%ADnas-Pelo-M%C3%A9todo-De/459479.html. Acesso 17.07.14 Prática V – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS PELO MÉTODO DE BRADFORD Introdução: O método baseia-se na observação do “Coomassie brilliant blue” BG-250 que estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança de coloração, inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína. O complexo é formado em cerca de 2 minutos. Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. Para isto ocorrer, a proteína deve ter estrutura macromolecular, ou seja, de 8-9 ligações peptídicas no mínimo. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm. Com os valores de absorbância e de concentração definidos, pode-se traçar uma curva padrão. Neste gráfico se observa uma linearidade, que indica a proporcionalidade entre o aumento da absorbância e da concentração de proteínas. A curva padrão serve de base para a análise da amostra desconhecida, pois com ela obtém-se o fator de calibração médio (FCM), que servirá de base para o cálculo da concentração de proteínas na amostra. É mais indicado para a detecção e quantificação de proteínas (em meios sem detergentes) totais, tais como: plasma ou soro sanguíneo, liquor, saliva humana, produtos alimentícios, leite, leite humano, tecidos de plantas e urina. É simples, preciso e rápido. O método requer poucas etapas de misturas, não necessita de aquecimento e possui uma grande estabilidade colorimétrica, com pouca interferência de cátions como sódio ou potássio. Vantagens: sensibilidade; rapidez; menor número de interferentes. Alguns interferentes: Lipídios, detergentes, melanina, açucares, RNA, bilirrubina e sulfato de amônio. Desvantagens: variação da absortividade específica; dependente da solubilidade e tamanho da proteína; falta de linearidade também tem sido observada devido a uma variação do pH quando há adição da amostra ao reagente BG-250. A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações biológicas e físico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Lei de Beer-Lamberttem: “Quando uma faixa de luz monocromática atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada”. Objetivos: utilizar um método espectrofotômetro de quantificação de proteínas; determinar a concentração de proteína em uma amostra biológica através do método de Bradford. Materiais: - 1 estante para tubos de ensaio - 14 tubos de ensaio grandes - 350 µL de albumina 1 mg/mL (previamente preparada) - 35 mL de Coomassie Blue - Micropipeta de 10-200 µL - Ponteiras pequenas para água, albumina e amostra - 1 pipeta de vidro de 5 mL para o Comassie Blue - Espectrofotômetro Métodos: Diluição do leite em 50x, para que o espectrofotômetro consiga fazer a leitura. Pipetar a curva padrão e a amostra conforme tabelas abaixo: Curva Padrão - Bradford 1996 [ ] de albumina (mg/mL) água (µl) Albumina Coomassie 1 mg/mL (µl) Blue (µl) branco 50 0 2500 0,2 40 10 2500 0,4 30 20 2500 0,6 20 30 2500 0,8 10 40 2500 1 0 50 2500 Amostra Tubos Água (µl) Amostra Coomassie (µl) Blue (µl) 1 30 20 2500 2 30 20 2500 Realizar leituras no espectrofotômetro em 595 nm, iniciando pela curva padrão. Deixar encubando por 5 a 20 minutos. Calcular o ponto de calibração para cada ponto da curva (FC = [ ]/Abs) Calcular a concentração da proteína utilizada. (C = Abs x FCM) - Preparo do Coomassie Brilliant Blue 1L: Dissolver 100 mg de Comassie Brilliant Blue G 250 em 50 mL de etanol. Agitar e adicionar lentamente 100 mL de ácido fosfórico concentrado. Completar o volume com água destilada e/ou deionizada para 1 L. Filtrar a solução em papel filtro. Resultados: - Diluição do leite 50x para a amostra: 30 mL de volume final: 1 – 50 X – 30 X= 0,6 mL Então: 600 µL de leite para 2400 µL de água. - Curva Padrão de Albumina 1 mg/mL Gráfico da curva padrão: Concentração obtida em cada leitura de absorbância feita. - Fator de Calibração (FC = [ ]/Abs) Curva Padrão - Bradford 1996 Tubo [ ] mg/mL Abs FC FCM 1 0,2 0,203 0,985 1,0524 2 0,4 0,451 0,886 3 0,6 0,542 1,107 4 0,8 0,715 1,118 5 1 0,857 1,166 - Amostra – Quantificação de Proteínas (C = Abs x FCM) Amostra Tubos Abs [ ] 1 0,136 0,143126 2 0,142 0,149441 0,1431+0,1494 = 0,14628 x 50 x 2,f = 18,285 mg/mL 2 - x50 porque o leite foi diluído 50x. - x2,5 pela diluição da amostra no tudo de reação. Discussões: Na curva padrão podemos ver uma pequena variação entre a segunda e terceira medições no espectrofotômetro, o que resultou em um leve desnível, dificultando a linearidade da curva. Pode ter ocorrido um erro de pipetagem do preparo no tubo 3. Se formos comparar os três experimentos de quantificação de proteínas, podemos dizer que o método de Lowry é sensível e preciso, com uma faixa de detecção de 10 a 1000 µL/mL, porém é incompatível com detergentes e agentes redutores, além de ser um processo demorado. Enquanto isso o método de Bradford é compatível com agentes redutores e rápido, detectando entre 20 a 2000 µg/mL, mas também é incompatível com detergentes. Já o método de Biureto não tem praticamente nenhuma compatibilidade com agentes redutores, que são usados para estabilizarem proteínas em soluções, o que pode influenciar na qualidade da precisão de quantificação de proteínas. Ao contrário do método de Lowry e Bradford este é compatível com detergentes, e também com agentes desnaturantes, o que lhe proporciona uma baixa variabilidade. O método de Bradford como uma técnica rápida é eficiente, mas seu reagente exige altas concentrações de proteínas, isso poderia variar a quantificação, atribuindo uma menor precisão. Assim sendo, uma vantagem deste método é calcular proteínas de alta massa molecular, já que o reagente não se liga a baixas concentrações de proteínas. Este método é comum na determinação de proteínas totais em plasma ou soro sanguíneo, leite e saliva humana, tecidos de planta e urina. Comparando o resultado da quantificação do experimento com o valor nutricional na caixa do leite (Elege) obteve-se uma variação, enquanto no leite se tem aproximadamente 30 g/L, no experimento obtivemos 18g/L. Na aula anterior com o método Lowry obtivemos o valor de 80,8 mg/mL, pudemos perceber então que em nossas técnicas estão tendo erros. Por isso acreditamos que essa variação essa que pode ser por erros no procedimento de pipetagem, ou interferência de detergentes, como carboidratos e lipídios no caso do leite. As principais proteínas do leite são a caseína, a b-lactoglobulina e a a-lactoalbumina. Os cinco tipos de caseínas (fosfoproteínas) representam 80% das proteínas do leite, o restante é constituído pela b-lactoglobulina e a-lactoalbumina com 16% e 4% do total das proteínas respectivamente. Bibliografia: Relatório de aula prática “Quantificação de proteínas pelo método de Bradford”, IFRS – Técnico em Biotecnologia, data: 08/04/2014. http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914 Acesso: 22/04/2014 http://www.labome.com.br/method/Protein-Quantitation.html Acesso: 22/04/2014 http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1413-41522008000200014 Acesso: 21/04/2014 LEHNINGER, Albert Lester, 1917-1986. Lehninger princípios de bioquímica/David L. Nelson, Michael M. Cox; traduzido por Arnaldo Antônio Simões, Wilson Roberto Navega Lodi. 3. Ed. São Paulo 2002. Espectrofotometria. Disponível em http://pt.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometria. Acesso 18.07.14 As proteínas do leite. Disponível em http://www.pratiqueleite.com.br/content.php?recid=2787. Acesso em 18.0714 Práticas VI e VII - DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS Introdução: A solubilidade das proteínas está relacionada com a presença de cargas elétricas em radicais de aminoácidos das cadeias polipeptídicas. A existência de uma carga positiva ou negativa determina a interação do radical com o meio aquoso em que estão as proteínas do nosso organismo ou em qualquer outro solvente polar. Essa diferença de carga na proteína faz elas se repelirem, aumentando a interação com o solvente. No ponto isoelétrico, é o pH onde o número de cargas positivas e negativas, de um aminoácido ou proteína, se anulam, onde a repulsão entre elas são mínimas, possibilitando a eletrostática entre moléculas protéticas, ocorrendo precipitação de grumos que tendem a precipitar. A solubilidade das proteínas depende de diversos fatores, tais como: pH, diferença nas concentrações de sais/íons e temperatura. A desnaturação provoca grande perda da solubilidade das proteínas em solventes aquosos, este processo causa uma desorganização das cadeias polipeptídicas mudando a conformação e alterando as propriedades físico-químicas e biológicas da proteína. Assim, a solubilidade de uma proteína desnaturada diminui devido a modificações em suas estruturas secundarias, terciarias e quaternárias. O pH variando influencia nas cargas dos radicais dos aminoácidos constituintes da proteína, o que também pode modificar as estruturas da proteína conforme a variação do pH, alterando sua solubilidade. Temperatura é outro fator que altera a solubilidade da proteína, pois a maioria das proteínas é solúvel a temperatura ambiente, temperatura ótima de 37ºC. A medida que se eleva a temperatura entre 40ºC e 50ºC a solubilidade tende a aumentar, além dessas medidas, a proteína começa a desnaturar e a solubilidade diminui. O último fator que pode influenciar a solubilidade da proteína, e não menos importante, são as concentrações de íons. Em baixas concentrações a solubilidade aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade. Já em altas concentrações salinas, os íons competem com a proteína pela água, ocorrendo perda de água, atração mutua entre as moléculas e formação de precipitado. Precipitação por sais é um fenômeno chamado “salting out”. Os sais em grandes concentrações atraem as moléculas de água do meio diminuindo a disponibilidade de água para as proteínas, é um processo de desidratação. Precipitação por metais pesados ocorrem porque os sais desses metais combinam-se com partes negativas de proteínas levam a formação de outros sais chamados de ‘quelatos’, que não são solúveis em água. Precipitação por ácidos fortes acontece, pois há uma mudança no pH, tal mudança facilita a interação entre os íons positivos com os negativos, levando assim a desnaturação e sucessivamente a precipitação. Precipitação por calor se dá a uma desorganização das cadeias peptídicas das proteínas, isso ocorre por causa dos movimentos moleculares intensos que acabam afastando demais os grupamentos químicos, rompendo as estruturas secundárias, terciárias e quartenárias. Desnaturando-a. Objetivo: determinar o ponto isoelétrico médio das proteínas biológicas e verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação. Materiais: 1º Parte: - 1 estante para tubos de ensaio - 7 tubos de ensaio de vidro - Água destilada - 8 mL de ácido acético 0,1 M - 7 mL de amostras proteicas (leite, clara de ovo, e solução de proteína isolada de soja) - Indicador de pH ou potenciômetro - 3 pipetas de vidro de 5 mL - 1 pipeta de vidro de 1 mL - 1 micropipeta de 40-200 µL - 1 micropipeta de 200 – 1000 µL 2º Parte: - 1 estante para tubos de ensaio -5 tubos Falcon 15 mL -1 tubos de vidro -10 mL de leite -4 mL de solução de sulfato de amônio (aprox. 4 M) -3 mL de tampão fosfato (PBS)pH 7,0 -2 mL da solução de acetato de chumbo 20% - 2 mL de ácido tricloroacético 10% - Micropipeta p1000 -Banho e Maria -Centrífuga c/ adaptador para tubos Falcon Procedimentos: 1º Parte: Dispor de uma série de tubos de ensaio para cada tipo de amostra (no caso, leite), conforme tabela abaixo: Nº do tubo 0 1 2 3 4 5 6 Água destilada (mL) 4,5 4,4 4,3 4 3,5 2,5 0,5 Ác Acético 0,1 M (mL) 0 0,1 0,2 0,5 1 2 4 Sol. Protéica (mL) 1 1 1 1 1 1 1 Agitar todos os tubos vigorosamente; Deixar decantar por cerca de 20 minutos; Observar a turbidez e determinar o pH do tubo que apresentar maior precipitação; Indicar o pI aproximados das amostras utilizadas. 2º Parte: Experimento 1: Precipitação por sais Adicionamos, em dois tubos Falcon de centrífuga, 2 mL da solução proteica, leite; Em um dos tubos que continha a amostra do leite, adicionamos 2 mL da solução de sulfato de amônio (tubo 1-A); No outro tubo com amostra, adicionamos 2 mL de tampão fosfato (PBS)(tubo 1-B controle); Misturamos ambos por inversão; Colocamos na centrífuga a 3000 rpm por 10 min; Descartamos o sobrenadante e observamos o tamanho do pellet formado. Experimento 2: Precipitação por metais pesados Adicionamos, em dois tubos Falcon, 1 mL da solução proteica; Em um deles, adicionamos 1mL da solução de acetato de chumbo (tubo 2-A); No outro, adicionamos 1mL de tempão fosfato (tubo 2-B controle); Misturamos por inversão; Observamos e comparamos como ficaram os tubos. Experimento 3: Precipitação por ácidos forte Adicionamos, em um tubo Falcon, 1 mL da solução proteica; Adicionamos 1 mL da solução de ácido tricloroacético 10% (tubo 3-A); Misturamos por inversão; Observamos e comparamos com o tubo controle (tubo 2-B controle). Experimento 4: Precipitação pelo calor Adicionamos a um tubo de ensaio de vidro 3 mL de solução proteica; Colocamos em banho maria a 80°C por 15 min; Observamos. Resultados: 1º Parte: Amostras Tubo pI Leite integral 3 4 Leite integral dil 50x ---- Não precipitou Gelatina ---- Não precipitou Clara de ovo 3 4 ~ 5 Prot da soja ---- Não precipitou 2º Parte: Experimento 1: Tubo 1-A :O sobrenadante ficou bem branco e muito duro e o líquido de baixo ficou transparente, não pudemos observar a consistência já que não conseguimos retirar o sobrenadante endurecido e o líquido não passava por ele. Tubo 1-B: Não aconteceu nada Experimento 2: Tubo 2-A: Ficou com aparência de leite talhado, com gomos grandes. Tubo 2-B: Teve uma leve precipitação que ficou grudada nas paredes do tubo. Experimento 3: Tubo 3-A: Ficou com aparência de leite talhado, com gomos pequenos. Tubo 2-B: Teve uma leve precipitação que ficou grudada nas paredes do tubo. Experimento 4: Não aconteceu nada. Discussão: Parte 1: No ponto isoelétrico existe um equilíbrio entre as cargas positivas e negativas da proteína, e elas se anulam. Fazendo com que as forças de repulsão entre as moléculas de proteína e as forças de interação com o solvente sejam mínimas, mas aumentando a interação entre as moléculas da proteína, formando precipitado, como já mencionado na introdução. Conforme observado nos tubos de ensaio, ocorreu turbidez/formação de precipitado somente no tubo 3. Onde o pH foi de aproximadamente 4, característico da proteína do leite, a caseína, que na literatura tem seu pI em 4,7. Comparando as amostras de leite integral e a clara de ovo, observa-se que o houve precipitação no tubo 3 em ambas as amostras, e o pH varia entre 4 e 5, podemos afirmar que o valor do pI dessas amostras são próximos em condições ótimas. Já o restante das amostras não houve turbidez. O que pode ter ocorrido é preparo de pouca amostra para o experimento, erro de pipetagem e mistura das soluções na hora do preparo Parte 2: No experimento 1 foram dois grupos que usaram o leite como solução proteica e o resultado em ambos foram exatamente iguais, mas o sobrenadante não deveria ter ficado do jeito que ficou fazendo com que não pudéssemos ter um resultado correto do líquido abaixo do sobrenadante, acreditamos que o que fez o experimento sair errado foi que o leite já estava passado. No experimento 2 e 3 os resultados foram parecidos entre eles (Tubos 2-A e 3-A) e entre o outro grupo que fez usando a mesma solução de proteínas. Ficaram com aparência de leite talhado, pois houve precipitação das proteínas. No tubo 2-A por causa do acetato de chumbo, que é insolúvel em água e quando se combina com a proteína gera um precipitado. No tubo 3-A porque ácidos forte mudam o pH, fazendo com que haja muita interação entre os íons, desnaturando e precipitando a proteína. O tubo 2-B teve um leve precipitado que ficou grudado na parede do tubo, não deveria ter nenhum precipitado, pois é o tubo controle. No experimento 4 não aconteceu nada. Quando fervemos o leite em casa sempre podemos observar que cria uma “nata” como sobrenadante, deveria ter acontecido isso em nosso experimento. Como os dois grupos que usaram a mesma solução proteica obtiveram o mesmo resultado, o provável dos erros é que tenham acontecido por o leite não estava mais fresco. Bibliografia: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2004/constituintes_microorg/proteinas.htm http://bioquimica.ufcspa.edu.br/pg2/pgs/medicina/links/anamariamed/proteinas/ponto_isoeletrico_caseina.pdf http://books.google.com.br/books?id=9DTw-nE1dOQC&pg=PA86&lpg=PA86&dq=precipita%C3%A7%C3%A3o+de+prote%C3%ADnas+por+%C3%A1cidos+fortes&source=bl&ots=TQKC9W0zgx&sig=HOhesAwc7mnvktlolIzVriZ5Cgw&hl=pt-BR&sa=X&ei=IQdoU9D0MJSmsAS_3oDgCg&ved=0CDIQ6AEwAQ#v=onepage&q=precipita%C3%A7%C3%A3o%20de%20prote%C3%ADnas%20por%20%C3%A1cidos%20fortes&f=false Relatório ‘Reações de precipitação de proteínas’ Prof. Maurício Bogo e Prof. Luiz A. Basso. Relatórios VI e VII: DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS. Prática VIII – ATIVIDADE ENZIMÁTICA (HIDRÓLISE DO AMIDO) Introdução A reação enzimática simples pode ser representada pela seguinte sequência de reações químicas: E + S ES EP E + P E – enzima S – substrato P – produto ES – complexo enzima-substrato EP – complexo enzima-produto Para começarmos a entender o funcionamento das reações, é importante dizer que as enzimas são catalisadores biológicos, ou seja, aumentam a velocidade das reações sem alterar o equilíbrio da mesma. Para se compreender a cinética da reação é preciso conhecer a diferença na energia livre (estado final) e os reagentes (estado inicial) como a quantidade necessária para transformar o reagente em produto (energia de ativação). Este diagrama descreve as mudanças de energia ocorridas durante uma reação química. O eixo das abscissas mostra o progresso de uma dada reação enzimática, o que significa dizer as mudanças químicas que ocorrem para a transformação do substrato em produto. Já o eixo das ordenadas, mostra a energia livre dessa reação. O ponto de início e de término de uma reação é chamado de estado fundamental, no ponto máximo da curva, está o estado de transição que é relacionado com a quantidade de energia necessária para que o substrato seja transformado em produto. A diferença entre os níveis desses dois estados é chamada de energia de ativação. Assim, podemos dizer que catalisadores reduzem s barreira energética entre o substrato e o produto em um dado sistema, diminuindo a energia de ativação da reação. Existe vários fatores que podem alterar a velocidade da reação enzimática, tais como: - pH; - Temperatura; - Concentração de substrato; - Concentração da enzima. O pH interfere na velocidade da reação, uma vez que altera a distribuição de cargas elétricas da enzima influenciando a conformação do sítio ativo, consequentemente a interação com o substrato, assim diminuindo a velocidade de dada reação. Quando se aumenta a temperatura do meio, a velocidade da reação aumenta dentro de uma faixa que a mantém estável e em atividade integral. A maioria das enzimas humanas tem sua temperatura ótima entre 35° e 40°, faixa normal de temperatura corporal. Pois a agitação entre as moléculas e os números de colisões entre elas aumentam, e as chances de reação entre elas é maior. Porém se for ultrapassada certa temperatura, as colisões se tornam tão intensas que as ligações que estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompe e ela se desnatura. Já a concentração de substratos à medida que aumenta mais rápida será a reação. Desde que haja enzimas disponíveis para o substrato. Quando não há disponibilidade de enzimas que formem o ES, dizemos que há saturação da enzima, e a velocidade da reação se mantém constante. Assim, podemos afirmar que com o aumento da concentração da enzima, aumenta a velocidade da reação, desde que haja substrato disponível. A saliva possui uma enzima chamada amilase salivar, que quebra as moléculas de amido em glicose. A amilase salivar é uma enzima que atua provocando a hidrólise do amido, um polissacarídeo muito abundante na alimentação, estando presente, sobretudo, em alimentos de origem vegetal, nos quais constitui a principal substância de armazenamento. A digestão dos alimentos é iniciada na boca, onde se verifica, essencialmente, a mastigação, havendo a quebra das grandes partículas alimentares em outras de menores dimensões que vão em seguida ser deglutidas. Amido é o principal produto de reserva nutritiva vegetal, é geralmente encontrado em órgão de reserva nutritiva, como raízes do tipo tuberoso (mandioca, batata doce), caules do tipo tubérculo (batatinha), frutos e sementes. Constitui um polímero de glicose com ligação glicosídica. O soluto de lugol (iodo-iodeto de potássio) é um indicador para testar a presença de amido. O corante irá colorir o amido à medida que interage com a estrutura enrolada (forma helicoidal) do polissacarídeo, produzindo uma cor azul escura. Não reage com monossacarídeo (glicose), nem com dissacarídeo (sacarose). No experimento a seguir, observaremos a interação entre a enzima e substrato, assim como sua velocidade de reação. Objetivo: observar uma reação enzimática. Verificar a influência da concentração do substrato e da temperatura na atividade de uma enzima. Materiais: - 1 estante para tubos de ensaio - 6 tubos de ensaio de vidro grandes - 4 mL de saliva (de um colega) - 1 béquer de 10 mL para saliva - 11 mL de solução de amido 0,7% - 24 gotas de Lugol (aproximadamente 2,4 mL) - Banho-maria + termômetro. Procedimento: - A α-amilase será obtida através da saliva que deverá ser previamente preparada em um béquer (4 mL de saliva + 1 mL de água). 1) Preparar e marcar 10 tubos de ensaio. Tubos de 1 a 5 em duplicata. 2) Pipetar segundo a tabela abaixo. A enzima (0,2 mL ou 200 µL de saliva) deve ser adicionada por último (no fundo do tubo) e logo após, cada tubo deverá ser bem agitado. TUBO 1 2 3 4 5 Amido 0,7% (mL) 0 0,5 1 2 3 Água (mL) 3,8 3,3 2,8 1,8 0,8 Solução com enzima (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 3) Em um conjunto de tubos (de 1 – 5), coloque 3 gotas de lugol em cada tubo, agite e anote os resultados na tabela na parte de “Temperatura ambiente (T.A)”. 4) Colocar o outro conjunto de tubos (de 1 – 5) em banho-maria por 10 minutos a 37°C. Esperar o conteúdo dos tubos esfriar um pouco. Após, coloque 3 gotas de lugol em cada tubos e agitar. Anote a cor formada em cada tubo na tabela. Resultados: OBS: O amido produz coloração azul quando em contato com o iodo, já a dextrina superior (polissacarídeo) produz coloração violeta, enquanto a maltose não produz nenhuma cor em contato com o iodo. Dextrinas são compostos polissacarídeos formados como produtos intermediários na quebra do amido. Por exemplo, esses produtos incluem uma forma inicial chamada eritrodextrina porque se tornam vermelhos com o iodo. DADOS DA HIDRÓLISE DO AMIDO TUBO 1 2 3 4 5 Amido 0,7% (mL) 0 0,5 1 2 3 Água (mL) 3,8 3,3 2,8 1,8 0,8 Solução com enzima (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Coloração formada (T.A) Coloração formada (37°) Discussão: No tubo 1, é observado coloração amarela, pois não havia substrato para a enzima reagir, pode se dizer que a coloração é apenas do corante na solução. No tubo 2 já foi possível visualizar uma diferença na coloração pois havia uma quantidade de substrato suficiente, uma coloração amarelo mais escuro principalmente no tubo que foi aquecido a 37 °C, já que neste tubo foi adaptado para que se dê a temperatura ótima da enzima. É preferível usar enzimas que suportam alta temperatura para permitir aumento da cinética da reação, consequentemente a velocidade desta reação foi mais rápida. No tubo 3 houve um aumento de substrato, o que na temperatura ambiente pode se observar a interação da enzima-substrato que se dar a uma coloração mais escura. Comparando os tubos 2 e 3, é possível concluir que a medida que se aumenta o substrato, a velocidade da reação também aumenta, e ainda fazendo uma segunda comparação é claramente observado que na temperatura ótima a 37°, a velocidade da reação é mais rápida do que no tubo a temperatura ambiente. Nos tubos 4 e 5, é observado uma coloração mais escura, pois a medida que se aumenta o substrato, a interação com a enzima aumenta. Concluímos que nos tubos com temperatura ambiente a reação foi mais lenta, enquanto que no tubo aquecido a 37° foi mais rápido. Fazendo as comparações entre os grupos, os resultados foram bem variados. Bibliografia: - Relatório de aula prática “Atividade Enzimática (Hidrólise do Amido)” do dia 29/04/2014. -http://pt.scribd.com/doc/19194724/Relatorio-Factores-Que-Influenciam-a-Actividade-Enzimatica Acesso em 12/05/2014. -http://www.sobiologia.com.br/conteudos/quimica_vida/quimica12.php Acesso em 12/05/2014. - Lehninger, A; L. Bioquímica. 2°. ed. São Paulo: Editora Edgard Blucher, 1976. Prática IX e X – IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS Objetivo: Identificar a presença de pentoses e açúcares redutores através de testes qualitativos; Utilizar um método espectrofotométrico de quantificação de carboidratos. Determinar a concentração de açúcares redutores em uma amostra biológica pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (ADNS). Material por grupo: Prática 1 - 4 estantes para tubos de ensaio. - 2 mL de cada solução dos açúcares a 1% (glicose, sacarose, frutose, lactose e amido). - 8 mL de cada solução dos açúcares a 2% (glicose, sacarose, xilose, frutose, lactose e amido). - Reativo de Bial (7 mL), Reativo de Molisch (5 mL), reativo de Benedict (15 mL) e ácido dinitrosalicílico (7 mL). - 21 tubos de ensaio grandes. - 5 mL de Ácido Sulfúrico concentrado. - Banho Maria. - 7 Pipetas de vidro de 1 mL (1 para cada açúcar). - 2 Pipetas de vidro de 5 mL/ 2 Pipetas de vidro de 10 mL Prática 2 - 300 uL Leite (diluído 40 X). - 5 mL Solução padrão de glicose 5 mg/mL. - 15 mL de reagente ADNS (75 g de tartarato duplo de sódio e potássio, 0,25 g de ácido dinitrosalicílico e 50 mL de NaOH 2 M). - 06 tubos de ensaio grandes. - Estantes ara tubos de ensaio. - 13 tubos eppendorf. - Micropipeta de 100-1.000 uL e de 20-200 uL. - Ponteiras grandes e pequenas. - 1 pipeta de vidro de 5 mL para o ADNS. - Banho Maria. - Espectrofotômetro. Introdução: Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na face da terra. Apresentam estruturas muito parecidas entre si, o que os torna quase impossíveis de serem identificados. Assim, o que se pode fazer é caracterizar grupos de carboidratos utilizando suas propriedades químicas comuns. Monossacarídeos Na natureza, os monossacarídeos mais abundantes são as hexoses (6 carbonos), embora também estejam muito presentes nas plantas aqueles constituídos por outros números de carbonos (3 carbonos, trioses; 4 carbonos, tetroses; 5 carbonos, pentoses), assim como compostos derivados. Os representantes típicos são a glicose, a frutose e a galactose. Oligossacarídeos São polímeros constituídos por número variável de monossacarídeos (de 2 a 20). Portanto, o número dos possíveis oligossacarídeos é muito grande, e sua natureza, diversa; porém, são poucos os que se encontram em grandes quantidades nos alimentos, sendo que vários deles são o resultado da hidrólise dos polissacarídeos; são compostos normalmente por glicose, galactose e frutose. Os mais comuns são: sacarose, galactose, maltose, trealose (dissacarídeo), rafinose (trissacarídeo) e estaquiose (tetressacarídeo) Polissacarídeos São polímeros formados por mais de 20 monossacarídeos dispostos de forma linear ou ramificada. Se todos os monômeros constituintes são do mesmo açúcar, os polissacarídeos denominam-se homoglicanas (celulose, amilose, amilopectina). Quando são de diferentes açúcares, denominam-se heteroglicanas. A consequente diversidade de polissacarídeos quanto à sua composição faz com que as propriedades dessas moléculas de alto peso molecular sejam muito distintas daquelas dos monossacarídeos que as constituem; assim, dissolvendo-se com mais dificuldade. Polímeros insolúveis de carboidratos funcionam tanto como elementos estruturais quanto de proteção nas paredes celulares bacterianas e vegetais e nos tecidos conjuntivos de animais. Outros polímeros de carboidratos agem como lubrificantes das articulações esqueléticas e participam do reconhecimento e coesão entre as células. Polímeros mais complexos de carboidratos, ligados covalentemente a proteínas ou lipídios, agem como sinais que determinam a localização intracelular ou o destino metabólico destas moléculas híbridas. Identificação qualitativa de carboidratos Reação de Bial - O teste de Bial é uma reação colorida especifica para as pentoses. Em condições controladas as pentoses desidratam rapidamente transformando em furfural. Na presença do ion férrico, o orcinol e o furfural condensam-se rapidamente dando produto azul. Reação de Molisch - Quando aldeídos desidratam em furfurais ou hidroximetilfurfurais, ao se complexarem com fenóis e seus derivados, produzem substâncias coradas em violeta. Assim, a reação de Molisch é utilizada para a detecção qualitativa de glicídios em geral que formam furfurais (pentoses) ou hidroximetilfurfurais (hexoses) pela ação desidratante de ácidos concentrados na presença de alfa-naftol. Reativo de Benedict - O teste de Benedict é baseado na redução do Cu2+ a Cu+ devido ao poder redutor das carbonilas em solução alcalina. O íon cuproso (Cu+) produz o Cu2O, composto de cor vermelho-tijolo. Todos os monossacarídeos reagem positivamente, logo, frutose e glicose reação. Os dissacarídeos dependem da presença de uma extremidade redutora, fato que não ocorre no caso da sacarose. Identificação de açúcares redutores com o ácido dinitrossalicílico - (ADNS) O método do DNS é um método onde ocorre a oxidação do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ácido dinitro-salicílico; sal de Rochelle, (solução de tártaro de sódio de potássio) que serve para prevenir o reagente da ação do oxigênio dissolvido; fenol, que é utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que é um estabilizante da cor obtida na presença do fenol; hidróxido de sódio, que é o redutor da ação da glicose sobre o ácido dinitro- salicílico. No método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (ADNS), usado para quantificar açúcares redutores, ocorre uma reação, em meio alcalino, com o referido ácido convertendo-se em ácido 3-amino-5-nitrossalicílico por ação dos açúcares redutores, dando origem a um complexo tijolo, que por sua vez é quantificado espectrofotometricamente. Procedimentos: Prática 1 Experimento 1 1. Pipetamos conforme a tabela abaixo. TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUB0 5 1mL de: Glicose 2% Sacarose 2% Xilose 2% Amido 2% Água Reativo de Bial (mL). Este procedimento deve ser realizado em capela de exaustão 1 mL 1mL 1mL 1mL 1mL 2. Aquecemos em banho-maria fervente por 5 minutos. Experimento 2 1. Pipetamos conforme a tabela abaixo. 2. Após adicionamos 1 mL do reativo e agitar os tubos. TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 1mL de: Glicose 1% Frutose 1% Sacarose 1% Amido 1% Água Reativo de Molisch 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL Ácido sulfúrico conc. 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL *Observação: Na capela: O ácido sulfúrico concentrado deve ser o último: Adicionar cuidadosamente em cada tubo 1 ml de ácido sulfúrico concentrado (não agitar), inclinando-o e deixando o ácido escorrer lentamente pelas paredes do tubo. Deixar os tubos em repouso e observar a formação de um anel de cor violeta. Experimento 3 1. Pipetamos conforme a tabela abaixo. TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 1mL de: Glicose 2% Sacarose 2% Lactose 2% Água Reativo de Benedict 2mL 2mL 2mL 2mL 2. Aquecemos em banho-maria fervente por 3 minutos. Experimento 4 1.Pipetamos conforme a tabela abaixo. TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 1mL de: Glicose 2% Sacarose 2% Lactose 2% Água ADNS 1mL 1mL 1mL 1mL 2. Aquecemos em banho-maria fervente por 5 minutos. Prática 2 - Diluimos a amostra (leite) 40X. - Pipetamos a curva padrão em uniplicata conforme tabela abaixo: Concentração final de glicose (mg/mL) Volume glicose a 5 mg/mL (mL) Água (mL) 1,0 1000uL 0,0 0,8 800uL 0,2 0,6 600uL 0,4 0,4 400uL 0,6 0,2 200uL 0,8 0 0 1,0 - Identificamos 13 tubos de ensaio pequenos com a respectiva concentração da curva padrão + 2 tubos identificados como “amostra”. - Pipetamos 1000 µL (1 mL) da solução de ADNS para tubos previamente identificados. - Transferimos 100 µL de cada ponto da curva para os tubos contendo o ADNS (11 tubos). - Pipetamos 100 µL da amostra (leite diluído 40 X) em 2 dos tubos (identificados como “amostra”) contendo o ADNS. - Aquecemos a mistura em banho-maria, com água fervente, por 10 minutos. - Resfriamos as soluções até temperatura ambiente. - Zeramos o espectrofotômetro com o branco. Determinamos as absorbâncias a 570 nm (A570). - Anotamos as absorbâncias na tabela abaixo. - Calculamos o FCM (Fc= Q / A) a partir dos dados da curva padrão. - Calculamos a concentração de açúcares redutores do leite (C = A X FCM) Resultados: Prática 1: 1º Reativo de Bial 2º Reativo de Molisch 3º Reativo de Benedict 4º ADNS Prática 2: Curva Padrão glicose (mg/mL) ABS 1,0 0,402 0,8 0,354 0,6 0,235 0,4 0,151 0,2 0,077 0 Branco Amostra 1 0,520 Amostra 2 0,533 Cálculo FC: 1,0/0,402 = 2,48 0,8/0,354 = 2,25 0,6/0,235 = 2,55 0,4/0,151 = 2,64 0,2/0,077 = 2,77 Cálculo FCM: 2,48 + 2,25 + 2,55 + 2,64 + 2,77 = 12,69/5 = 2,538 Amostra 1 – 0,520 x 2,538 = 1,319 Amostra 2 – 0,533 x 2,538 = 1,352 Concentração média = 1,319 + 1,352 = 2,671/2 = 1,3355 x 40 (diluição feita do leite) = 53,42mg/mL. Discussão: Na prática 1, obervamos 4 métodos de identificação de pentoses, hexoses e açucares redutores. O primeiro teste realizado foi reação de Bial, esse teste é para identificar pentoses. Usamos glicose (C6H12O6), sacarose (C12H22O11), xilose (C5H10O5), amido (C6H10O5) e água. O único que reagiu foi a xilose. O segundo procedimento foi a reação de Molish. Serve para identificação de pentoses ou hexoses. Usamos glicose (C6H12O6), frutose (C6H12O6), sacarose (C12H22O11), amido (C6H10O5) e água. Reagiu frutose, sacarose e o amido. Mas, não entendemos porque a glicose não reagiu e a sacarose sim, acho que trocamos os tubos glicose-sacarose! O terceiro e o quarto experimento foi com o reativo de Benedict e ADNS, ambos para identificação de açucares redutores. Usamos glicose, sacarose, lactose e água. Pudemos confirmar que glicose e lactose são açucares redutores e sacarose não é. Prática 2 235 mL de leite _ 12g de carboidratos 1 mL de leite _ Xg de carboidratos = 0,051g ou 51mg/mL Nosso grupo chegou num resultado muito próximo do esperado, já que uma porção de leite (235 mL) tem aproximadamente 12g de carboidratos, isto é 1mL teria em média 51mg/mL, e nos encontramos o valor de 53,42mg/mL. Referências Protocolo da aula prática – Identificação de carboidratos Protocolo da aula prática – Quantificação de carboidratos http://www.ehow.com.br/leite-aumentar-niveis-glicemicos-sobre_8141/ http://www.ebah.com.br/content/ABAAABt54AF/bioquimica-relatorio-carboidratos http://adamogama.blogspot.com.br/2012/07/teste-de-bial.html Prática XI – SAPONIFICAÇÃO DE LIPÍDIOS Introdução Lipídios são um grupo de moléculas orgânicas caracterizadas pela baixa solubilidade em água e outros solvente polares e alta solubilidade em solventes apolares. Os ácidos graxos podem sofrer reações de hidrogenação, halogenação, saponificação esterificação e oxidação. Os lipídios complexos quando hidrolisados em meio alcalino produzem glicerol e sais de ácidos graxos. A reação de saponificação é um tipo de reação química que ocorre entre um éster e uma base inorgânica, formando como produtos finais um sal orgânico (o sabão) e um álcool (o glicerol ou glicerina). O nome saponificação se deve ao fato de que, quando se utiliza um éster derivado de um ácido graxo em reações desse tipo, produz-se o sabão. A principal fonte natural de ácidos graxos são gorduras e óleos, e suas hidrólises alcalinas são os principais processos aplicados à produção de sais de ácidos graxos, popularmente conhecidos como sabões. As bases mais utilizadas nas reações de saponificação são o hidróxido de sódio (NaOH), que produz um sabão mais consistente, e o hidróxido de potássio (KOH), que dá origem a um sabão mais mole, conhecidos como sabões potássicos. Outro produto da reação de saponificação é o glicerol, um composto orgânico que faz parte do grupo dos alcoóis. Devido a isso, as indústrias de sabão produzem também a glicerina, forma comercial do glicerol com 95% de pureza. Essa substância tem propriedades umectantes, ou seja, é capaz de manter a umidade, sendo, por isso, aplicada à produção de cremes e loções de pele, sabonetes e produtos alimentícios. Objetivo: - Conceituar saponificação e conhecer as reações necessárias para formação de sabões. - Conhecer o comportamento dos sabões em soluções aquosas com e sem a presença de gorduras. Materiais: 5 mL de óleo de soja 10 mL de solução alcoólica de hidróxido de sódio a 10% bico de bunsen sobre uma tela de amianto 1 mL de Ácido clorídrico 1 M concentrado (deverá ser manipulado na capela de exaustão) 60 mL de água destilada 1 béquer de 100 mL 2 pipetas de 10 mL, 1 pipeta de 1 mL, 1 bastão de vidro 1 estante para tubos de ensaio 6 tubos de ensaio de vidro grandes Procedimentos: Saponificação de lipídeos Inserir em um béquer ou em um erlenmeyer pequeno, 2 mL de óleo de soja. Adicionar 10 mL de solução alcoólica de NaOH. Aquecer em bico de bunsen, sobre uma tela de amianto, com agitação contínua até a completa saponificação, isto é, até que a fase líquida desapareça e seja formada uma camada levemente endurecida. A agitação deverá ser feita com bastão de vidro. Acrescentar 50 mL de água destilada e agitar até a completa dissolução do sabão. Estabilização de uma emulsão Numerar dois tubos de ensaio. Agitar vigorosamente os tubos por inversão. Observar e anotar os resultados imediatamente. Deixar em repouso por 10 minutos e anotar os resultados. Precipitação de sabões e liberação de ácidos graxos Numerar três tubos de ensaio Misturar por agitação Deixar em repouso por 10 minutos, Observar a presença de precipitado e anotar os resultados. Resultados: Procedimento 1: Seguindo o protocolo, o procedimento foi feito. Entre agitarmos por inversão e aguardar por 10 min não foi notado tanta diferença nos resultados. No tubo 1 observamos uma boa precipitação (de cor diferenciada, ou seja, de óleo) por ser uma “mistura” de água e óleo; no tubo 2 tivemos uma grande camada de espuma por conter sabão, houve uma mistura entre os reagentes Procedimento 2: Seguindo o procedimento, foram numerado três tubos de ensaio. Tubo 0 (zero), contendo NaCL (gotas) e sabão, foi observado que houve uma mudança, o mesmo ficou em uma cor mais opaca. Tubos 1 e 2 aparentemente iguais, o tubo 1 contendo sabão e HCL (gotas) e o tubo 2 apenas sabão. Conclusão: Analisando o que foi pedido “reações necessárias para formação de sabões”, no tubo 1 observamos uma boa precipitação, e o precipitado foi o óleo. Não houve uma interação entre os reagentes. No tubo 2 onde foi acrescentado sabão, tivemos uma camada de espuma, houve uma mistura entre os reagentes, o que podemos dizer que houve interação e se houve pode ser feito a formação. No segundo procedimento, comportamento dos sabões em soluções aquosas com e sem a presença de gorduras. No tubo 0 (zero) onde foi adicionado NaCL e sabão, ficou em uma cor opaca resultando um grande nível de gordura, no tubo 1 (HCL e sabão) e tubo 2 (sabão), aparentemente iguais, ou seja, resultados visualmente parecidos. Sem nível de gordura. Comparando com os resultados dos colegas, observamos que aparentemente foram bem parecidos, ou até, iguais (imagens abaixo). Resultados dos demais grupos: Bibliografia: Protocolo Prática XII – ACIDEZ DE LIPÍDIOS Introdução Os lipídios são caracterizados pela baixa solubilidade em água e outros solvente polares e a alta solubilidade em solventes apolares. São conhecidos como gorduras e suas propriedades físicas estão relacionadas com a natureza hidrófoba, das suas estruturas. Todo o processo do metabolismo lipídico vem desta característica hidrófoba das moléculas, que não é uma desvantagem biológica (possui cerca de 60% de água). Justamente por serem insolúveis, os lipídios são fundamentais para estabelecer uma interface entre o meio intracelular e o extracelular, francamente hidrófilos. O iodo exibe determinadas propriedades de metais, além de combinar-se com muitos outros elementos, sendo porém menos ativo que os demais elementos halogênios, que o removem dos iodetos. O teste do iodo a presença de ácidos graxos insaturados devido a reação de halogenação. Na presença de ligações duplas, o iodo será consumido e a coloração característica de solução de iodo diminuirá a sua intensidade. Além as insaturações, a determinação de acidez pode fornecer um dado importante na avaliação do estado de conservação e qualidade de um determinado óleo. A decomposição os triglicerídeos, seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, é acelerada por aquecimento e pela luz, sendo acompanhada pela formação de ácidos graxos livres. Estes são expressos em termos de índice de acidez (IA), que corresponde a quantidade (em MG) de base (KOH ou NaOH) necessária para neutralizar os ácidos graxos livres presentes em 1g de gordura. Limites aceitáveis de acidez de óleos comestíveis são de 0,07 a 0,7%. Objetivo: - Reconhecer a ocorrência de fixação de halogênios nas ligações duplas dos ácidos graxos insaturados e sua importância no estudo destes compostos; - Determinar a acidez de óleos vegetais. Materiais: 25 mL de óleo de cozinha reciclado filtrado, 5 ml de óleo de oliva, 5 ml de óleo de soja. 3 tubos de ensaio de vidro 24 gotas de lugol (1,5 ml) Banho Maria Bureta de 10 ml e suporte 20 ml de solução de hidróxido de potássio (KOH) 0,1 M 15 gotas de fenolfetaleína 02 erlenmeyer de 250 ml. Procedimentos: Fixação do iodo Foi utilizado 3 tubos, o “tubo 1” com 4 ml de óleo reciclado, o “tubo 2” 4 ml de óleo de oliva e no “tubo 3” 4 ml de óleo de soja. Logo após foi inserido 4 ml das amostras em um tubo de ensaio, adicionado 8 gotas de lugol a cada uma delas, em seguida aquecido em banho Maria (fervendo até o desaparecimento da cor) e foi observado as mudanças da coloração rósea persistente (que deveria permanecer por 30s). Determinação da acidez de óleos vegetais -Alterar a propriedade do óleo liberando os ácidos graxos alterando a acidez. Passo 1: Foi pesado 20 ml de óleo para serem testados e anotados em gramas. Passo 2: Inserir 20 ml de óleo a ser testado em um erlenmeyer de 250 ml. Passo 3: adicionado 5 gotas de fenoftaleína e a foi agitado. Passo 4: Foi titulado com o KOH até o aparecimento da primeira coloração rósea persistente. Passo 5: Anotar o volume de KOH utilizado e proceder o cálculo de índice de acidez (IA) O cálculo de índice de acidez (IA) é feito através da fórmula: IA = mg de base /g de gordura. Ex. Mg de base: 0,1 mol – 1000 ml de base (pois a base utilizada é 0,1 M) X mol – 15 ml para neutralizar (hipotético) = 0,0015 mol 1 mol – 56 000 mg (56 g de KOH) 0,0015 mol – x MG de base = 84 mg de base /59 g de gordura = 1,42 mg de base /g de gordura (ou 0,14%). Cor pH ácido: Incolor Cor pH básico: Vermelho Zona de viragem: 8,0 - 10 Resultados: Procedimento 1: Foi inserido nos tubos de acordo com o procedimento, na utilização no Tubo 1 - óleo de soja reciclado, tubo 2 óleo de oliva, tubo 3 óleo de soja. Comparando os demais colegas e utilização de óleos diferentes, vimos que alguns resultados ficaram com cores vermelhadas quase no tom de marrom, todos os tubos com cores semelhantes. Mas no experimento com óleo de soja obtivemos o resultado como mostra na imagem abaixo, tubos 1 e 2 com cores semelhantes e tubo 3 em um tom mais claro. Procedimento 2: como determina do no procedimento (determinação de acidez de óleos vegetais), utilizado óleo de soja reciclado, seguindo todos os passos. Obtivemos na primeira tentativa um rosa muito escuro, em outra tentativa chegamos a um rósea mais claro, porém quase um beje (como mostra na imagem). Valor da acidez foi de 0,065%. Calculo: 1 mol – 56 000 mg (56 g de KOH) 0,0015 mol – x MG de base = 84 mg de base /59 g de gordura = 1,42 mg de base /g de gordura (ou 0,14%). 1 mol – 56 000 mg 0,0021 - X X= 11,76 mg = 0,011769 mg = 0,0065 g = 6,5mg 18,01 g 18,01 g 6,5 mg = 0,065% 100 Conclusão: Na ocorrência de reconhecer a fixação de halogênios nas ligações duplas dos ácidos graxos, nossa prática teve como resultado e nos mostrou modificação e fixação do iodo nos tubos 1 e 2, considerando a base de acidez diríamos que temos um mais básico e dois mais ácido. No segundo procedimento, onde analisamos a acidez obtivemos dois resultados, por ter repetido o procedimento. Depois de adicionar fenolftaleína e feito a titulação, era para aparecer uma primeira coloração rósea persistente (por 30s), mas a mesma permaneceu, considerando essa ser ácida, repetimos do mesmo modo o procedimento e finalizamos em uma solução mais clara (tom de rosa quase bege), considerando mais ácido que o primeiro. Bibliografia: Protocolo http://www.infoescola.com/elementos-quimicos/iodo/ Prática XIII – CONTROLE DO ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO DOS VEGETAIS Introdução: O escurecimento observado quando a maioria das frutas e dos vegetais é amassada, cortada ou triturada, é oriunda de reações catalisadas pela enzima polifenoloxidase. A ação dessa enzima em várias frutas e vegetais in natura acarreta perdas econômicas consideráveis, além de diminuição da qualidade nutritiva e alteração do sabor. Essas reações podem ser oxidativas ou não oxidativas, sendo escurecimento oxidativo ou enzimático. A inativação enzimática, através do tratamento térmico, é uma das soluções encontradas pela indústria alimentícia, sendo esse recurso utilizado principalmente na conservação do produto, em seu período de elaboração e armazenamento, podem ainda ser usados ácidos orgânicos para retardar a ação enzimática. Objetivo: observar o escurecimento enzimático em vegetais e como alguns agentes podem influenciar na velocidade do mesmo. Material: - Batata e maça cortados em fatias - 50 mL de solução de metabissulfito de sódio 0,25% - água gelada - 6 béqueres de vidro de 50 mL - Banho Maria (em temperaturas diferentes) - termômetro Procedimento: - a metade dos grupos trabalhará com fatias de maça e a outra metade com fatias de batata. - cortar o seu respectivo vegetal em 2 fatias médias. - marcar 6 béqueres com os tratamentos descritos. - seguir os tratamentos abaixo. Cuidar para que a partir do tratamento 2, estes sejam realizados com 10 minutos de intervalo. 1. Controle: deixar as fatias expostas ao ambiente por 30 minutos. 2. Estoque em água a temperatura ambiente. Deixar o material imerso em um béquer com água a temperatura ambiente por 30 minutos. A água deve cobrir todo material. Transcorrido o tempo, observar o escurecimento e anotar o observado. 3. Inativação da enzima pelo frio. Imergir o material em água gelada por 1 minuto, retirar e aguardar por 30 minutos. Transcorrido o tempo, observar o escurecimento e anotar o observado. 4. Inativação da enzima pelo calor 1. Imergir o material em água a temperatura de 50°C por 1 minuto, retirar e aguardar 30 minutos. Transcorrido o tempo, observar o escurecimento e anotar o observado. 5. Inativação da enzima pelo calor 2. Imergir o material em água a temperatura de 70°C por 1 minuto, retirar e aguardar 30 minutos. Transcorrido o tempo, observar o escurecimento e anotar o observado. 6. Inativação da enzima por agente químico. Imergir o material em uma solução de metabissulfito de sódio por 1 minuto, retirar e aguardar 30 minutos. Transcorrido o tempo, observar o escurecimento e anotar o observado. Resultados: Fatias de batata divididas conforme procedimento: A fatia exposta a temperatura ambiente (b1) demonstrou maior escurecimento em menor tempo. A fatia em B5 foi a que teve um menor escurecimento comparado aos demais. Discussão: No experimento B1 onde a amostra estava em temperatura ambiente o escurecimento foi maior e em menor tempo, pois o ambiente estava propicio para a atividade ótima da enzima polifenoloxidase, agindo de forma efetiva no vegetal. Comparando o mesmo experimento, porém com a amostra de maça, notou que o escurecimento se deu em menor tempo que a batata, o que pode ter influencia na presença maior de taninos na maça, que favorecem a reação de escurecimento. No experimento B3, na inativação da enzima pelo frio, foi observado que houve a inibição, mas não tão eficaz quanto B4 e ainda mais em B5. Podemos concluir que ambientes com temperaturas baixas reduzem a velocidade da enzima, mas somente temperaturas elevadas a inibem, através da ação de desnaturação. No experimento B6, na inativação da enzima por agente químico houve um escurecimento, o que não era esperado, pois quando se é adicionado, estaríamos diminuindo o pH do meio, inibindo a atividade da enzima através também de sua desnaturação. Pode ter ocorrido um erro na quantidade do agente químico necessário para a inibição das enzimas que continham na amostra. Referências: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABaRoAG/relatorio-escurecimento-enzimatico Acesso em 01/07/2014 http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc35_1/05-RSA-104-11.pdf Acesso em 01/07/2014 Protocolo de aula prática “Controle do escurecimento enzimático dos vegetais”. Realizada no dia 10/06/2014. Prática XIV – DETERMINAÇÃO DE
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