Produção de enzimas 2

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Estratégias de Purificação e Análises de Proteínas
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Principais componentes moleculares da bactéria E. coli
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. 
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
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Métodos de Isolamento de Biomoléculas
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, foram desenvolvidas muitas metodologias de separação de proteínas.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)	
Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) 
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas:
Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
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O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas (1,0g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. 
Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequentemente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura. 
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Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação.
 Medida da atividade biológica
 - particular para cada proteína
 - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração.
 Medidas do conteúdo proteico (diversos)
 - absorbância de luz UV de 280 nm
 - métodos colorimétricos 
 (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
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Métodos para medida do conteúdo de proteína:
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, especialmente triptofano. 
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Ácidos nucléicos também absorvem luz UV – máximo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1
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4- BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
3- Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250
 Método baseado em uma mudança espectral do reagente - absorção máxima a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas.
Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina.
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul, 
1- Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato 
 Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 
 
1. Cu2+ é chelado pela proteína
 [Cu2+-proteina]
2. Reação redox 
 Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína] 
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul.
2- Método de Lowry
Métodos para medida do conteúdo de proteína
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Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). 
Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.
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Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmática e formam complexos solúveis com as proteínas.
Detergentes podem ser iônicos e não iônicos
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sangue centrifugado: separação de plasma e células
 A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus componentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. 
 Através de sucessivas etapas de centrifugação com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos.
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R$ 3.000
US$ 85,000
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
Força centrífuga
1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas
200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos
(necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração)
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Preço aproximado
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.
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Centrifugação em gradiente de densidade
A centrifugação em um meio com gradiente de densidade melhora a eficiência da separação. As partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando “bandas”.
Gradientes podem ser utilizados para separar diferentes tipos de células, organelas, ácidos nucléicos, complexos proteicos, etc.
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As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda “não são capazes de sedimentar” proteínas.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
	- adição de sais (precipitação salina)
	- adição de solventes
	- variação de pH (precipitação isoelétrica)
O gráfico ao lado ilustra o efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da hemoglobina.
Em baixa concentração salina, a solubilidade das proteínas aumenta, pois os íons ajudam a reforçar a camada de solvatação.
Em alta concentração salina, a solubilidade das proteínas diminui pois os íons competem pelas moléculas de água disponíveis para formar a sua própria camada de solvatação.
Sais com ânions divalentes são mais eficientes do que os monovalentes na precipitação de proteínas.
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Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.
Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observeo gráfico.
Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente em uma saturação de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante.
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Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. 
Os mais utilizados são etanol e acetona. 
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou 
 quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
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Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros 
 que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o tampão que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
início
final
Dt
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Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada.
Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento. 
Quando já houve redução significativa dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas.
Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação.
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Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
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 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
 Atividade específica (AE): é a razão entre a atividade biológica total e a quantidade total de proteínas presentes em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
 Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades específicas inicial (material de partida) e de cada etapa até a etapa final (proteína pura).
 Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado em cada etapa de purificação. Perda no rendimento é inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser processadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas que apresentam pouca atividade). 
	 
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse. 
 
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 Purificação da glicoquinase hepática de rato
A Unidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pré-estabelecidas
B Atividade específica: medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína
C Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação
D Índice de purificação: razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.
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Quadro de purificação – proteína pobrerase
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Uma coluna é um tubo cilíndrico aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contato desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
 
Os componentes da mistura são separados por interagirem diferentemente com a resina, com base em propriedades moleculares como:
 massa molecular
 carga elétrica
 solubilidade
 afinidade
 
Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.
Funcionamento básico de uma coluna cromatográfica 
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partículas (beads) da resina porosa 
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular 
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Absorbância a 280 nm
volume
Medida da ativ. biológica
Moléculas maiores
Moléculas menores
Kav
Massa molecular (kD)
 20 40 60 80 100 120 mL 
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. 
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Curva de calibração
Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao.
Ler a massa correspondente
Observar a escala log
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Moléculas pequenas
Moléculas pequenas
Proteínas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas
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Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. 
Ve – volume de eluição de uma certa proteína
Vt – volume total da coluna
Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com 
 massa acima da resolução da resina 
onde:
O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de 5.000 a 600.000 d.
Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a “sair” da parte linear da curva.
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração.
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Kav 
Log (PM)
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Cromatografia de troca iônica 
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
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DEAE-celulose - pH < 10
CM-celulose - pH > 4
Cromatografia de troca iônica 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
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Adsorção
Eluição
Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 
adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e a não retenção das proteínas com a mesma carga; 
eluição das proteínas adsorvidas.
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
Para aeluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. 
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.
Como funciona a cromatografia de troca iônica 
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Carboximetil-celulose
(trocadora de cátions)
Dietilaminoetil-celulose
(trocadora de ânions)
Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. 
As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).
Duas modalidades de cromatografia de troca iônica
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Tipos de Resina de troca Iônica
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3	
—CH2-SO3-	
 Tipos de resina de troca iônica 
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Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre
Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. 
Ex: cromatografia de imunoafinidade
A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). 
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1. Mono-específicos: ligação específica da molécula-alvo
	- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
	- agonistas ou antagonistas de receptores
	- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
	- ligantes para “tag” ou “marcação” ( ex: glutationa-S-transferase, 
 para um tag de poli-Histidina)
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP)
 Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade 
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Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, o que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. 
 A introdução de um braço espaçador diminui esse risco.
Preparo da resina de afinidade: 
Passo 1. Ativação da resina
				
			
	 
 Passo 2. Acoplar 
 o ligante 
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Cromatografia de partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico.
Consiste de 2 sistemas:
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Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas)
Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água
	- acetonitrila, metanol, propanol
Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C
Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila
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Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. 
Característica diferencial da cromatografia convencional: 
 partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) 
 aumento da eficiência da separação em função do número maior de partículas de resina em um mesmo volume da coluna 
 fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna
Desenho básico de um HPLC
Duas bombas permitem eluição em gradiente
Detector: índice de refração, absorbância UV ou Vis, fluorescência, etc.
Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluição diferencial na fase reversa
HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
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 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
 A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas.
	Fornece informações sobre a massa molecular e composição 	 	de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor.
A poliacrilamida é um polímero que forma um gel de malha porosa.
A poliacrilamida funciona como uma peneira, deixando passar através de seus poros as moléculas pequenas e retendo as grandes
 É formado a partir da reação de acrilamida e bisacrilamida.
 concentração de acrilamida variando de 5 a 20% determina o diâmetro dos poros
 uso de gradiente de acrilamida aumenta o poder de resolução
 o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na presença do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)
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Sódio dodecil sulfato
Desnaturação de proteínas por SDS + agente redutor no caso de proteínas oligoméricas
						Efeito do SDS
 desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através dos poros da poliacrilamida; 
 mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo;
 facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias
A porção hidrocarboneto do detergente interage com as regiões hidrofóbicas da proteína, dispondo o grupo sulfato carregado na superfície, em contacto com o meio aquoso. A repulsão entre os grupos 
sulfato desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a.
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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. 
Na cuba, o gel é polimerizado entre duas placas de vidro, afastadas 1 mm uma da outra. 
Antes da polimerização, um pente é colocado na parte superior do gel para formar os poços onde serão colocados de 5 a 20 microlitros de cada amostra, misturadas com azul de bromofenol, um indicador da corrida.
As partes superior e inferior do gel fazem contacto com recipientes de tampão, onde estão os eletrodos que estabelecerão o campo elétrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h).
Terminada a corrida, as placas são retiradas da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente retirado e corado para revelar as bandas de proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie Blue ou nitrato de prata.
catodo
anodo
tampão
Poços para as amostras
amostra
Placas de vidro
1 mm
tampão
gel
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Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a determinação do número de cadeias e tipo de ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas
Eletroforese em Meio Redutor
SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium
Direção da migração
Cada linha (banda) corada no gel representa uma proteína
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SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas
Mobilidade relativa = 
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida
Curva de calibração de SDS-PAGE
 A migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se proteínas padrões com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibração do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma proteína desconhecida na curva,pode-se estimar a sua massa molecular.
Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Mr
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Enzimas imobilizadas
Definição:
Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou quimicamente associada a um suporte ou matriz , usualmente sólida, insolúvel em água e inerte, que não seja essencial a sua atividade.
Objetivos da imobilização:
Reutilizar a enzima (enzimas são caras)
Aumento da estabilidade
 ***Remover a enzima que permanece contaminando o produto (custo extra de purificação)
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Vantagens e desvantagens do uso de enzimas imobilizadas
VANTAGENS
Desenvolvimento de sistemas contínuos
Maior estabilidade enzimática
Uso mais eficiente do catalisador através de reutilizações
Efluentes livres de catalisadores
Maior versatilidade na etapa de separação
DESVANTAGENS
1) Custo adicional do suporte, reagentes e da operação de imobilização
2) Perdas de atividade durante a imobilização
3) Técnica pouco adequada a substratos insolúveis ou de alta massa molar
4) Maiores riscos de contaminação na operação contínua de reatores
5) Restrições difusionais e impedimento estérico
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Suportes para Imobilização
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Métodos de imobilização
Os métodos de imobilização de enzimas podem ser classificados em quatro tipos básicos:
Separação por membranas
Entrelaçamento em Polímeros
Adsorção
Formação de ligações covalentes
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Separação por membranas
Este método a enzima encontra-se fisicamente separada do meio de reação, através de uma película (membrana) semipermeável, e que por sua vez pode ser subdividida em:
Encapsulamento (alginato de sódio/Ca)
Membranas fibrosas semipermeáveis (membrana semipermeável)
Microencapsulamento
Entrelaçamento em triacetato de celulose 
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Entrelaçamento em polímeros
Em linhas gerais consiste no aprisionamento das moléculas de enzima entre as malhas de um polímero geliforme, o qual é preparado da seguinte maneira: num recipiente adequado são colocados a enzima, um agente bifuncional (por ex., bisacrilamida) um monômero ( por ex., 2-hidroximetilacrilamida) e uma substância geradora de radicais livres (por ex., persulfato de amônio). Depois de um certo tempo ocorre a gelificação, e em seguida o gel é dividido em partículas de dimensões conhecidas. A eficiência do entrelaçamento, a permeabilidade do gel e sua resistência mecânica dependerão da composição da mistura reagente e da natureza do monômero utilizado.
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Ligação cruzada
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Imobilização de enzimas em glutaraldeído
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Adsorção
	Este método consiste da união entre a molécula enzimática e um suporte inerte através de ligações eletrostáticas, estabelecidas entre grupos de cargas opostas. É um processo simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo desprezíveis os efeitos difusionais. Os suportes para adsorção podem ser orgânicos (derivados da DEAE-celulose, Dowex) e inorgânicos (celite, bentonita e alumina)
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Formação de ligações covalentes
A enzima é ligada ao suporte inerte mediante ligações químicas covalentes, que são, normalmente, estabelecidas entre os aminogrupos primários e -OH fenólica dos aminoácidos constituintes da enzima com os grupos relativos do suporte (-CHO; -NCS ou SCN-, dentre outros). Em geral, as reações são feitas em meio aquoso, à temperatura entre 0ºC e 25ºC e o pH próximo à neutralidade. A escolha das condições irá depender da estabilidade da enzima e do suporte frente ao pH de formação das ligações covalentes, assim como da estabilidade das ligações suporte-enzima frente ao pH de utilização do sistema imobilizado.
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Ligação covalente em suporte
A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos do suporte, ativado ou não, com os grupos funcionais da enzima
ligação de grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, 
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Imobilização de enzimas em celulose
Imobilização de enzimas em matriz com grupo carboxílico
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Algumas observações....
A imobilização de uma enzima na presença de excesso de substrato ou de um inibidor competitivo impede que a imobilização ocorra pelo sítio ativo.
Lisina é o aminoácido mais apropriado para se ligar covalentemente ao suporte devido a sua alta reatividade, especialmente em soluções alcalinas. Ele também é pouco presente e envolvido no sitio ativo das enzimas.
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Tipos de Suportes
Na literatura existem inúmeros materiais inertes que podem ser usados para imobilizar enzimas. A natureza física desses produtos pode variar, desde materiais geliformes até superfícies sólidas (lâminas de aço, pérolas de vidro, por ex.), recobertas com alguma substância capaz de interagir com a enzima. A escolha do método de imobilização e do tipo de suporte dependerá, essencialmente de dois fatores: a) das características peculiares da enzima; b) das condições de uso da enzima imobilizada. Dado a variabilidade desses fatores, pode-se afirmar que não existe um método geral de imobilização e nem sempre um suporte universal. 
	Geralmente as condições de imobilização para uma dada enzima só poderão ser estabelecidas empiricamente. O procedimento consiste em se imobilizar a enzima em vários suportes por meio de diferentes métodos, avaliando-se , a seguir, a atividade do sistema imobilizado. 
	Logicamente o binômio suporte-método mais adequado será aquele que propiciar maior atividade após a imobilização.
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Efeitos difusionais
Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que difundir na solução através de um filme líquido estacionário presente nas superfícies do suporte e, se este é poroso, através dos poros até alcançar o sitio ativo das enzimas - pode restringir a taxa de reação
Velocidade de difusão do substrato < velocidade de transformação pela enzima - Vmáx mais baixa -não se atinge a saturação.
Efetividade (f) = (v’) / (v), f é função de [S]
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Resistência difusional
Efeitos difusionais Externos
 Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catalise,devendo, por conseguinte atravessar uma camada líquida, assim o consumo de substrato através da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de um gradiente.
Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de substrato, caso do reator pistonado (PFR).
Efeitos Difusionais Internos
 Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio catalítico. - difusão e reação ocorre simultaneamente
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Efeitos microambientais 
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz ou suporte possui carga. 
Os efeitos de circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produtos e cofatores entre a região vizinha ao sistema imobilizado e o resto da solução.
Efeitos acessibilidade
Resultado de impedimento físico, formado pelo suporte, ao acesso de moléculas grandes ao centro ativo da enzima.
Efeitos na estabilidade
Enzimas durante a imobilização apresentem mudanças na estabilidade térmica.
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Estabilidade térmica
(a 50, 55, 60 e 65 oC)
Perda de atividade a cada ciclo de uso da enzima devido a etapa de precipitação para recuperação da enzima imobilizada
imobilizada
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Lignocelulosico pre-tratado
Time-course of hydrolyses of non-treated (native) and pre-treated corncob powder (PCP) by the immobilized (solid lines) and free (dotted lines) S. olivaceoviridis E-86 xylanase. (), total sugar for PCP produced by immobilized enzyme; (), total sugar for PCP produced by free enzyme; (), extent of xylan hydrolysis (%) for PCP by immobilized enzyme; (◊), extent of xylan hydrolysis (%) for PCP by free enzyme; (), total sugar for native corncob powder produced by free enzyme; (), extent of xylan hydrolysis (%)for native corncob powder by free enzyme.
Substrato natural
Substrato pre tratado
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Table 2
Kinetic parameters of immobilized and free S. olivaceoviridis E-86 xylanases
Substrate Immobilized enzyme Free enzyme
 Km (mg ml!1) Vmax (mmol ml!1 min!1) Km (mg ml!1) Vmax (mmol ml!1 min!1)
Birchwood xylan 2.34 171.8 1.54 90.3
Beechwood xylan 2.07 122. 9 1.42 67.6
Soluble oat-spelt xylan 1.36 263.6 1.15 101.2
Enzymatic reactions were carried out at 50 8C for 5 min in 50 mmol l!1 McIlvaine buffer, pH 6.3.
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