Replicação do DNA e suas etapas

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GENÉTICA
RESPOSTAS - Lista de exercícios 05
1. A síntese de DNA requer um molde de DNA de fita única, trifosfatos de desoxirribonucleosídio (nucleotídeos de DNA), uma fita de nucleotídios crescente e um grupo de enzimas e proteínas. Descreva detalhadamente a replicação do DNA.
A duplicação dos cromossomos dos eucariotos começa em vários pontos da molécula de DNA, com a ação de enzimas helicase e girase separando a dupla fita e levando a formação de várias "bolhas de replicação". As enzimas de síntese de DNA, chamadas DNA polimerases, não conseguem iniciar produção de uma nova fita dessa molécula usando apenas o molde monofilamentar de DNA (uma das fitas abertas). Nesse caso, também é necessário que, aderido a esse molde, exista um pequeno segmento de RNA chamado primer ou
iniciador - sintetizado por uma RNA polimerase (ou, nesse caso, por uma primase) - e que oferece uma extremidade 3´-OH livre para que a DNA polimerase continue o processo de duplicação dessa nova fita. Posteriormente, esse primer é retirado e substituído por DNA.
Além de necessitar de uma fita molde (os novos nucleotídeos são complementares aos nucleotídeos da fita molde, ou seja, nucleotídeos com a base nitrogenada timina se ligam a nucleotídeos com a base nitrogenada adenina da fita molde, e assim por diante: adenina se liga timina, citosina a guanina e guanina a citosina) e de um primer, a DNA polimerase somente consegue sintetizar uma nova molécula de DNA acrescentando novos nucleotídeos ao carbono 3´ do açúcar (o carbono 5´ fica localizado na parte oposta a esse açúcar). Por isso se diz que a síntese dos ácidos nucléicos ocorre no sentido 5´ → 3´. Como cada fita da molécula de DNA corre em sentido inverso, a sua duplicação ocorre em direções opostas.
Pelo fato da molécula de DNA ser formada por duas fitas que correm em sentido antiparalelo, durante a abertura da forquilha de replicação, um dos filamentos vai sendo aberto no sentido 5' → 3' e o outro no sentido 3' → 5'. Assim, embora a progressão da síntese dessas duas fitas aconteça simultaneamente, a medida em que essa forquilha é extendida, em uma delas a DNA polimerase sempre terá uma extremidade 3´-OH livre para colocar o próximo nucleotídeo (a fita leading). Na outra, de tempos em tempos, será necessária a síntese de um novo primer, para que ela possa continuar esse processo (a fita lagging).
Um dos novos filamentos de DNA é sintetizado continuamente pela DNA polimerase III; o outro, precisa ser sintetizado em partes. Fragmentos de Okazaki são justamente os trechos curtos de primer + DNA (com cerca de 100 a 200 nucleotídeos, nos eucariotos) produzidos temporariamente na fita de replicação descontínua. Logo em seguida, os primers são removidos de ambas as fitas pela DNA polimerase I que, ao mesmo tempo, vai completando a síntese da fita de DNA no trecho liberado. Por fim, os filamentos adjacentes de DNA são unidos via ligação covalente pela DNA ligase.
2. Toda síntese de DNA é 5′ → 3′, o que significa que novos nucleotídios são sempre adicionados à extremidade 3′ da fita de nucleotídios crescente. Em cada forquilha de replicação, a síntese da fita líder segue de maneira contínua, e a da fita tardia segue de maneira descontínua.
A replicação descontínua é o resultado de qual propriedade do DNA?
a. Bases complementares.
b. Grupo fosfato carregado.
c. Fitas de nucleotídios antiparalelas.
d. Açúcar de cinco carbonos.
3. A replicação é iniciada em uma origem de replicação, onde uma proteína de iniciação se liga e faz com que um pequeno segmento do DNA se desenrole. A enzima DNA helicase rompe as pontes de hidrogênio em uma forquilha de replicação e as proteínas ligadoras de DNA de fita única estabilizam as fitas separadas.
A DNA girase reduz a tensão de torção que surge à medida que as duas fitas de DNA de dupla-hélice se desenrolam.
Ordene os seguintes componentes na sequência em que são usados durante a replicação: helicase, proteína ligadora de DNA de fita única, DNA girase, proteína de iniciação.
Proteína de iniciação, helicase, proteína ligadora de DNA de fita única, DNA girase.
4. A primase sintetiza um segmento curto de nucleotídios de RNA (primers), que fornece um grupo 3′-OH para a fixação dos nucleotídios de DNA para início da síntese de DNA. Os primers são sintetizados em que região na fita tardia?
a. Apenas na extremidade 5’ da fita recém-sintetizada.
b. Apenas na extremidade 3’ da fita recém-sintetizada.
c. No início de cada fragmento de Okazaki.
d. Em múltiplos locais dento do fragmento de Okazaki.
5. Após os primers serem removidos e substituídos, a ruptura na ligação açúcar-fosfato é fechada pela DNA ligase.
Qual enzima bacteriana remove os primers?
a. Primase.
b. DNA polimerase I.
c. DNA polimerase III.
d. Ligase.
6. A replicação é um processo muito exato, com menos de um erro por um bilhão de nucleotídios. O nível elevado de exatidão na replicação do DNA é obtido pela seleção dos nucleotídios, revisão e reparo de pareamento errado.
Qual mecanismo consegue diferenciar a fita recém-sintetizada da fita-molde do DNA?
a. Seleção de nucleotídios.
b. Revisão do DNA.
c. Reparo de pareamento errado.
d. Todas as opções anteriores.
Qualquer nucleotídio incorretamente pareado que permanece após a replicação produz uma deformação na estrutura secundária do DNA; a deformidade é identificada por enzimas que removem o nucleotídio incorreto e usam a fita
original de nucleotídios como molde para substituir esse nucleotídio. O reparo do pareamento errado requer a capacidade de distinguir entre as fitas antiga e nova de DNA, porque as enzimas precisam de uma maneira para determinar qual das duas bases incorretamente pareadas deve ser removida. Na E. coli, grupos metila (–CH3) são adicionados às sequências específicas de nucleotídios, mas apenas depois da replicação. Assim, imediatamente após a síntese do DNA, apenas a fita de DNA antiga é metilada. Ela pode ser diferenciada a partir da fita recém sintetizada, e o reparo do pareamento errado ocorre preferencialmente na fita de nucleotídios não metilada. Nenhum processo
isolado poderia produzir esse grau de exatidão; são necessários vários processos, e cada um deles identifica os erros não detectados pelos processos anteriores.
7. O DNA eucariótico tem muitas origens de replicação. Em cada origem, um complexo multiproteico de reconhecimento da origem se liga para iniciar o desenrolamento do DNA.
Em comparação com os procariotos, quais são as diferenças na estrutura do genoma das células eucarióticas que afetam a maneira como a replicação ocorre?
O tamanho dos genomas eucarióticos, a estrutura linear dos cromossomos eucarióticos e a associação do
DNA com as proteínas histonas.
Embora a replicação eucariótica lembre a replicação bacteriana em muitos aspectos, a replicação nas células eucarióticas apresenta muitos desafios adicionais. Primeiro, o tamanho muito maior dos genomas eucarióticos exige
que a replicação seja iniciada em múltiplas origens. Segundo, os cromossomos eucarióticos são lineares, enquanto os procarióticos são circulares. Terceiro, o molde de DNA está associado a proteínas histonas na forma de nucleossomos,
e a montagem dos nucleossomos deve ser feita imediatamente à replicação do DNA.
As origens da replicação de diferentes organismos eucarióticos variam muito na sequência, embora elas tenham vários pares de base A-T. Um complexo de multiproteínas, o complexo de reconhecimento da origem (ORC), liga-se às origens
e desenrola o DNA nessa região.
8. Existem muitas DNA polimerases diferentes nas células eucarióticas. As DNA polimerases α, δ e ε fazem a replicação na fita líder e na fita tardia. Outras DNA polimerases reparam o DNA. As polimerases translesão especializadas são usadas para contornar as distorções do molde de DNA que normalmente paralisam as principais DNA polimerases.
Algumas das DNA polimerases eucarióticas tendem a fazer erros na replicação. Por que uma célula usaria uma DNA polimerase suscetível a erro em vez de uma mais exata?
Porqueas DNA polimerases suscetíveis a erros conseguem contornar as lesões na hélice do DNA que paralisam as DNA polimerases exatas, de alta velocidade.
Algumas diferenças expressivas nos processos de replicação bacteriana e eucariótica são o número e as funções das DNA polimerases. As células eucarióticas têm várias DNA polimerases diferentes que atuam na replicação, na recombinação e no
reparo de DNA.
Três DNA polimerases fazem a maior parte da síntese do DNA durante a replicação: DNA polimerase α, DNA polimerase δ e DNA polimerase ε. A DNA polimerase α tem atividade primase e inicia a síntese de DNA nuclear ao sintetizar um primer de RNA, seguida por uma sequência curta de nucleotídios de DNA. Após a DNA polimerase α ter se estabelecido entre 30 e 40 nucleotídios, a DNA polimerase δ completa a replicação na fita tardia. Semelhante em estrutura e função à DNA polimerase
δ, a DNA polimerase ε replica a fita líder. Outras DNA polimerases participam da replicação e recombinação ou catalisam a
replicação do DNA de organela.
Algumas DNA polimerases, como a DNA polimerase δ e a DNA polimerase ε, são capazes de replicar o DNA em alta velocidade e com grande fidelidade (poucos erros) porque têm sítios ativos que acomodam de modo justo e exclusivo os quatro nucleotídios normais do DNA, os monofosfatos de adenosina, guanosina, citidina e timidina. Como resultado dessa especificidade, moldes destorcidos de DNA e bases anormais não são acomodados com facilidade dentro do sítio ativo da enzima. Quando esses erros são encontrados no molde de DNA, as DNA polimerases de alta fidelidade param e não conseguem contornar a lesão.
Outras DNA polimerases têm menor fidelidade, mas são capazes de contornar as distorções no molde de DNA. Essas DNA polimerases translesão especializadas têm um sítio ativo mais aberto e são capazes de acomodar e copiar moldes com bases
anormais, estruturas distorcidas e lesões volumosas. Assim, essas enzimas especializadas podem contornar tais erros, mas como seus sítios ativos são mais abertos e acomodados, elas tendem a produzir mais erros. Na replicação, as enzimas de alta velocidade e alta fidelidade são usadas até encontrarem um bloqueio da replicação. Nesse ponto, uma ou mais polimerases translesão assumem, contornam a lesão e continuam replicando uma seção curta de DNA, Então, as polimerases translesão se separam da forquilha de replicação e as enzimas de alta fidelidade encerram a replicação com alta velocidade e exatidão.
As enzimas de reparo de DNA reparam os erros produzidos pelas polimerases translesão, embora alguns desses erros possam escapar da detecção e levem a mutações.
9. As extremidades dos cromossomos eucarióticos são replicadas por uma enzima RNA-proteína chamada telomerase. Essa enzima adiciona nucleotídios extras à fita de DNA rica em G do telômero. Qual seria o resultado se a telomerase de um organismo sofresse mutação e se tornasse não funcional?
a. Não ocorreria replicação do DNA.
b. A enzima DNA polimerase ficaria parada no telômero.
c. Os cromossomos seriam encurtados com cada nova geração.
d. Não seria possível remover os primers de RNA.
10. Descreva as regras básicas da replicação do DNA.
A replicação bacteriana requer várias enzimas (ver quadro da aula 05), proteínas e sequências de DNA que trabalham juntas para sintetizar uma nova molécula de DNA. Esses componentes são importantes, mas não nos aprofundamos nos detalhes do processo para não nos perdermos dos princípios gerais da replicação.
1. A replicação é sempre semiconservativa.
2. A replicação sempre inicia em sequências chamadas de origens.
3. A síntese do DNA é iniciada por segmentos curtos de RNA chamados de primers.
4. O alongamento das fitas de DNA é sempre na direção 5′ → 3′.
5. O DNA novo é sintetizado a partir de dNTPs; na polimerização do DNA, dois grupos de fosfato são
rompidos a partir de um dNTP e o nucleotídio resultante é adicionado ao grupo 3′-OH da fita crescente de nucleotídios.
6. A replicação é contínua na fita líder e descontínua na fita tardia.
7. As fitas novas de nucleotídios são complementares e antiparalelas em relação a suas fitas molde.
8. A replicação ocorre em taxas muito elevadas e é muito precisa, graças à exata seleção de nucleotídios, revisão e reparo do pareamento errado.