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1UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP Curso de Farmácia e bioquímica - Imunologia Básica – 2009 Aula 4: Geração da diversidade dosreceptores TCR e BCR Maturação dos linfócitos B na medula óssea Nesta aula falamos sobre a estrutura e os genes dos receptores para antígenos encontrados nos linfócitos B (anticorpos ou imunoglobulinas de superfície) e, como estas células adquirem estes receptores durante sua maturação na medula óssea. Vimos também que os linfócitos B que reconhecem moléculas expressas em células da medula óssea são eliminados. O receptor para antígeno dos linfócitos B é a molécula de anticorpo ou imunoglobulina de superfície (sIg). No caso das células B virgens (que nunca encontraram o antígeno), estes anticorpos são da classe IgM ou IgD. Quanto à sua estrutura básica, estas moléculas são compostas por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, iguais entre si, e unidas por pontes dissulfídicas. A cadeia pesada (ou cadeia H de heavy chain) possui três domínios (globulares) constantes (CH1, CH2 e CH3) e um variável (VH). A cadeia leve (ou cadeia L de light chain) pode ser de dois tipos ( ou ), mas as duas cadeias leves da molécula são sempre do mesmo tipo. A cadeia leve possui um domínio globular constante (CL) e um variável (VL). A molécula possui ainda uma região hidrofóbica que permite seu ancoramento na superfície celular. O reconhecimento do antígeno se dá pela estrutura formada pela associação das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas. Assim, cada molécula possui dois sítios de ligação com o antígeno que são idênticos entre si. Os domínios globulares que caracterizam o anticorpo também são observados em outras moléculas do sistema imune, denominadas moléculas da superfamília das imunoglobulinas. Filogeneticamente, o aparecimento destas moléculas está associado ao desenvolvimento do sistema imune. Acredita-se que estes domínios globulares possam permitir maior variabilidade à molécula uma vez que alterações nessas regiões não afetariam a estrutura geral da molécula. Os linfócitos B tornam-se maduros no fígado fetal, mas após o nascimento estas células amadurecem exclusivamente na medula óssea. Novos 2UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP linfócitos B são gerados durante a vida inteira do indivíduo. A maturação dos linfócitos B na medula óssea depende de contato com as células do estroma (uma palavra grega que significa colchão), com as quais interagem através de moléculas de superfície e fatores protéicos solúveis (citocinas ou interleucinas). No seu estágio mais imaturo, as células que vão dar origem aos linfócitos B são chamadas de linfócitos pró-B. Estas células não possuem nenhuma das cadeias da molécula de anticorpo na sua superfície. É nesse período do desenvolvimento celular que ocorre o rearranjo dos fragmentos VDJ, gerando o gene que irá codificar as porções variável (VDJ) e constante (C) da cadeia pesada. O gene que codifica a cadeia pesada da molécula de anticorpo é composto por inúmeros fragmentos V, D e J, seguidos do(s) fragmento(s) que codifica(m) a região constante (C) da molécula. O rearranjo gênico implica em aproximar um dado fragmento V, de um dado fragmento D, de um dado fragmento J, e colocar esse conjunto ao lado do fragmento C (veja o esquema dado na aula). Esse processo ocorre ao acaso e depende de um complexo enzimático que promove a recombinação do gene. Nessa fase do desenvolvimento celular, também observa-se a síntese da enzima TdT (transferase deoxinucleotidil terminal) que introduz nucleotídeos nas regiões de união entre os fragmentos V, D e J, aumentando a diversidade das moléculas de anticorpo. Os rearranjos gênicos que dão origem às moléculas de anticorpo acontecem de forma sequêncial. Primeiro, um dos genes para a cadeia pesada é rearranjado (lembrando que cada célula tem dois genes, um de origem materna e outro paterna). Se esse gene codificar um produto estável não haverá o rearranjo do outro gene para a cadeia pesada. Mas se o produto for instável, o segundo gene para cadeia pesada será rearranjado. Caso este segundo rearranjo não der certo a célula será eliminada. Os sinais que impedem a expressão de duas cadeia pesadas diferentes em um única célula não são totalmente conhecidos. Sabe-se porém, que é essencial a presença na membrana da célula, de uma molécula formada apenas por duas cadeias pesadas. Curiosamente, essa molécula vai para a superfície celular associada a moléculas que parecem muito com a cadeia leve, denominadas cadeias leves substitutas. As cadeias leves substitutas são formadas de duas proteínas associadas, V-pré B e 5, que são semelhantes às porções variável e constante da cadeia leve, respectivamente. A presença da molécula formada pelas cadeias pesadas e leves substitutas, na superfície da célula, desliga os mecanismos responsáveis pelo rearranjo gênico da cadeia pesada e induz a proliferação celular. Acredita-se que as cadeias leves 3UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP substitutas sejam importantes para checar a estrutura das cadeias pesadas. As células que expressam cadeias pesadas e leves substitutas na membrana são chamadas de linfócitos pré-B. Estas células passam a produzir quantidades grandes de cadeias pesadas que se acumulam no citoplasma. A próxima etapa da maturação dos linfócitos B é o rearranjo do gene que codifica as cadeias leves, que ocorre ainda nos linfócitos pré-B. Esse processo é semelhante ao descrito para as cadeias pesadas, no entanto, nesse caso só existem fragmentos V e J (não tem D). Além disso, existem quatro possibilidades para que ocorra um rearranjo produtivo (dois genes para a cadeia leve e dois genes para a cadeia leve ). Primeiro, os genes que codificam as cadeias leves são rearranjados e, só se não der nenhuma molécula “boa”, é que os genes que codificam as cadeias leves vão rearranjar. Nesse caso, os mecanismos de recombinação vão ser desligados quando a molécula de IgM é expressa na superfície da célula (sIgM). A diversidade das moléculas de anticorpo deve-se: a) às inúmeras possibilidades de combinação entre os diversos fragmentos VDJ e VJ. b) ao fato de que a junção entre estes fragmentos ocorre de forma imprecisa. c) à inserção de nucleotídeos pela enzima TDT. d) ao fato de que o sítio de ligação com o antígeno é formado pela combinação entre a porção variável da cadeia leve ( ou ) e pesada. Cálculos aproximados estimam o número de anticorpos possíveis ao redor de 1016, várias vezes maior que o número de linfócitos B que um homem possui. Os linfócitos B da medula óssea que apresentam apenas moléculas de IgM na superfície são ainda imaturos. Se, por acaso, estes linfócitos reconhecerem antígenos, eles serão eliminados por apoptose (morte celular programada). Esse processo é denominado “seleção negativa”, pois através dele são eliminadas algumas das células B que reconhecem constituintes próprios. Os linfócitos B maduros possuem na superfície, além das moléculas de IgM, moléculas de IgD. Como vimos anteriormente estas moléculas possuem a mesma região variável e, portanto, a mesma especificidade. Os linfócitos B maduros saem da medula óssea e migram para os órgãos linfóides secundários, onde localizam-se nos folículos linfóides (zona B). 4UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP Maturação dos linfócitos T no timo (geração do TCR) Nessa aula falamos sobre os receptores para antígenos (peptídeos) encontrados nos linfócitos T (TCR – T cell receptor), que são gerados no timo por um processo de recombinação gênica, semelhante ao que acontece nos linfócitos B. Estes receptores dão especificidade aos linfócitos T, uma vez que cada célula apresenta um tipo único de receptor. A molécula de TCR é formada por duas cadeias ( e ). Alguns linfócitos T, que serão pouco abordados nesse curso, utilizam um receptor formado por outras duas cadeias ( e ). Estas moléculas pertencem à superfamília das imunoglobulinas, pois como os anticorpos, elas também são formadas por domínios globulares. Cada uma das cadeias do TCR possui dois domínios globulares, um constante (C ou C) e um variável (V ou V). O sítio de ligação da molécula é formado pelas duas regiões variáveis (V e V). As cadeias do TCR também têm porções hidrofóbicas que ancoram a molécula na superfície celular. Os linfócitos T são gerados na medula óssea, mas só no timo amadurecem e adquirem especificidade (TCR). A maturação dos linfócitos T depende da interação, através de receptores e fatores solúveis, com várias células presentes no timo, tais com; células epiteliais corticais (de origem ectodérmica); células epiteliais medulares (de origem endodérmica); células dendríticas e macrófagos (originados na medula óssea). Durante a maturação dos linfócitos T no timo, além de passarem a expressar o TCR na membrana, estas células adquirem moléculas de superfície que são importantes na ativação celular (CD4 e CD8). Estas moléculas também servem como marcadores pois caracterizam tipos diferentes de linfócitos T. Após a entrada no timo, as células precursoras dos linfócitos T localizam-se inicialmente na região cortical. Estas células possuem o fenótipo CD4-CD8- (células duplo-negativas). Ao longo do seu desenvolvimento, que acontece durante o percurso em direção à medula do timo (não confundir com medula óssea), estas células adquirem o fenótipo CD4+CD8+ (células duplo positivas) e, mais tarde, tornam-se células CD4+ ou CD8+. Assim como acontece na geração dos anticorpos, o TCR é gerado por recombinação (somática) de fragmentos gênicos. O rearranjo dos genes que codificam o TCR acontece no cortex, iniciando-se quando as células possuem o 5UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP fenótipo duplo-negativo e terminando quando elas apresentam os dois marcadores na superfície (células duplo-positivas). O gene que codifica a cadeias do TCR possui fragmentos V, D e J, de forma semelhante àquele que codifica a cadeia pesada dos anticorpos. Por outro lado, o gene que codifica a cadeia possui apenas fragmentos V e J, ou seja, é parecido com aquele que codifica a cadeia leve dos anticorpos. O primeiro gene a ser rearranjado é o que codifica a cadeia (lembrando que cada célula tem dois genes, um de origem materna outro de origem paterna). Caso haja a produção de uma cadeia estável, esta molécula vai para a superfície com uma cadeia substituta (chamada pT), que inibe o rearranjo do segundo gene. Se a cadeia formada for anômala, ainda existe a possibilidade do rearranjo do gene presente no outro cromossomo. A seguir, ocorre o rearranjo da cadeia , gerando a molécula de TCR completa. Como também existem dois genes para a cadeia (um de origem materna outro de origem paterna), se este rearranjo não produzir uma molécula compatível com a cadeia , ainda existe uma segunda chance. Todo este processo é acompanhado de vigorosa proliferação e morte celular. A diversidade das moléculas de TCR deve-se a fatores semelhantes aos descritos para os anticorpos: a) às inúmeras possibilidades de combinação entre os diversos fragmentos VDJ e VJ. b) ao fato de que a junção entre estes fragmentos ocorre de forma imprecisa. c) à inserção de nucleotídeos pela enzima TDT. d) ao fato de que o sítio de ligação com o antígeno é formado pela combinação entre a porção variável das cadeias e . O NÚMERO ESTIMADO DE TCRS ENCONTRA-SE AO REDOR DE 1016 MOLÉCULAS DIFERENTES, DA MESMA ORDEM DE GRANDEZA DOS ANTICORPOS.
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