BIOQ SEM 08

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SISTEMAS ORGÂNICOS INTEGRADOS I (SOI) 
LABORATÓRIO MORFOFUNCIONAL INTEGRADO 
CURSO: MEDICINA / PERÍODO: 1º 
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA DATA: 19/09/2018 
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 
PROTOCOLO EXPERIMENTAL 
 
Tema: Centrifugação de amostra do sangue e Tempo de coagulação. 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
A hemostasia é a capacidade que o organismo tem de impedir a perda sanguínea 
frente à lesão vascular e de manter a fluidez do sangue no interior dos vasos. Assim que 
um vaso sanguíneo é lesado, imediatamente, ocorre uma vasoconstrição, adesão e 
agregação plaquetária no local da lesão, seguindo-se a formação do coágulo. 
Informações globais a respeito da participação das paredes vasculares e da atividade 
plaquetária, principalmente desta, em realizar a ação hemostática, são obtidas com o 
tempo de sangria (TS). 
Fragilidade capilar aumentada surge nas plaquetopenias, alterações funcionais 
das plaquetas e alterações vasculares, no escorbuto, diabete melito, em certos processos 
infecciosos e alérgicos, na hipofibrinogenemia e em tratamentos prolongados com 
anticoagulantes. A manifestação inicial de fragilidade vascular é o aparecimento de 
petéquias (pontos hemorrágicos) na pele e mucosa. Detecções de aumento dessa 
fragilidade pode ser obtida pela prova da fragilidade vascular também chamada prova 
do laço (PL). 
A suspeita de uma plaquetopenia pode ser confirmada ou rejeitada mediante a 
contagem de plaquetas por mm
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de sangue, cujo valor normal se situa entre 140.000 a 
440.000 por mm
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 de sangue. Quanto à diminuição da atividade plaquetária, seja por 
plaquetopenia, seja por alteração funcional, pode ser detectada pela prova de retração do 
coágulo. 
Para uma avaliação global do mecanismo da coagulação há vários métodos. O 
método de Sabrazés ou do tubo capilar para determinação do tempo de coagulação (TC) 
é de fácil execução, embora seja pouco sensível. Maior sensibilidade nos oferece o TC 
pelo método de Lee e White. 
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO 
 
O sangue utilizado é colhido em tubos cônicos com citrato de sódio 3,8% na 
proporção na proporção de 1 mL para de 10 mL de sangue. O citrato de sódio é um 
anticoagulante que se combina com o cálcio iônico plasmático tornando o sangue 
 
 
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incoagulável. O cálcio iônico é indispensável como cofator em várias reações em cadeia 
que resulta na formação de fibrina. Tanto pela via intrínseca como pela via extrínseca. 
Esse efeito com anticoagulante pode ser revertido instantaneamente pela simples adição 
de cloreto de cálcio, que retorna ao sangue a potencialidade de coagulação. 
 
O papel principal do citrato de sódio é formar um quelato com o cálcio, ou seja, 
ele se liga aos íons cálcio da amostra e a cascata da coagulação é interrompida. Um 
quelato é a associação de um íon metálico (no nosso caso o cálcio), com cadeias 
orgânicas (no nosso caso o citrato de sódio) através de ligações covalentes na forma de 
uma estrutura heterocíclica, que neutralizam a reatividade química do íon metálico. 
Agente quelante = citrato de sódio 
Íon metálico = cálcio 
Quelato = citrato de sódio + cálcio 
Vale ressaltar que essa associação é facilmente reversível, através da adição de 
íons cálcio na amostra. Justamente por causa dessa propriedade é que ele é o 
anticoagulante usado nos testes de coagulação. 
OBJETIVO: Determinar o tempo de coagulação. 
MATERIAL, EQUIPAMENTOS E INSUMOS OPERACIONAIS 
 
 2 Kits APTT hemostasis 
 15 mL de sangue coletado em tubo com anticoagulante (citrato de sódio) 
 6,5 mL de plasma 
 5 mL de solução fisiológica 0,9% 
 80 tubos de ensaios de 5 mL, 
 4 Pipetas de 100 a 1000 µL ou de 10 a 100 µL (pomteiras para os respectivos 
pipetadores). 
 Gelo, banho-maria, relógio ou cronômetro. 
 Caneta, pincel 
 4 béqueres de 250 mL e 1 béquer de 500 mL para descarte. 
 
COLETA E OBTENÇÃO DE PLASMA 
 
1- Obter o sangue por punção venosa e evitar garroteamento prolongado. 
 
 
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2- Coletar a amostra com seringa de plástico e centrifugar em tubos de plástico. 
 
3- Misturar 9 partes de sangue com 1 parte de citrato. Homogeneizar 3 ou 4 vezes por 
inversão suave. 
 
4- Centrifugar até 1 hora após a coleta a 3000 rpm ou 1500 g durante 15 minutos. Não 
é necessário remover o plasma do tubo. 
 
OBS: Manter o tubo tampado até a execução do teste para evitar mudança do pH da 
amostra, que pode interferir nos resultados. 
 
5- Manter as amostras entre 2 – 24 °C e realizar o TTPA até 4 horas após a coleta. O 
plasma separado das células, pode ser congelado a 20 °C negativos por 2 semanas 
ou 70°C negativos por 6 meses. Sugerimos congelar o material em alíquotas de 0,5 
ml. 
 
6- A presença de coágulos implica na rejeição da amostra. 
 
PROCEDIMENTO 
Tempo de tromboplastina parcial ativada TPPA 
1- Realizar o teste utilizando tubos de vidro rigorosamente limpos. 
 
2- A temperatura do banho-maria deve estar entre 36 – 38 °C. 
 
3- Pré-aquecer o Reagente 2 (20 mmol/L a 37 °C) 
 
4- Incubar a 37 °C, 0,1 mL do plasma a ser medido (controle ou paciente) 
Por no mínimo um minuto e no máximo 10 minutos. 
5- Adicionar 0,1 mL do Reagente 1, homogeneizar e incubar a 37 °C por 
3 e 5 minutos (tempo de ativação). 
 
OBS: Para obter resultados reprodutíveis o tempo de ativação deve ser padronizado 
para todas as amostras. 
 
6- Adicionar 0,1 mL do Reagente 2 (previamente aquecido a 37 °C) e disparar 
simultaneamente o cronômetro. Misturar suavemente e manter no banho-maria a 37 
°C por 15 a 20 segundos. 
 
7- Remover o tubo, incliná-lo sucessivamente em intervalos menores que 1 segundo e 
observar a formação de um coágulo que interrompe a movimentação do líquido. 
Parar imediatamente o cronômetro e registrar o tempo. 
 
 
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INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA COAGULAÇÃO 
2. Tubo na temperatura ambiente: 
 Realizar os passos de 4 a 7, com incubação em temperatura ambiente. 
3. Tubo em temperatura baixa: 
 Realizar os passos de 4 a 7 com incubação em gelo. 
Teste / Controle Reagentes Tempo de coagulação 
A- Tubo em temperatura de 37 
o
C a 40 
o
C 
0,1mL de soro + 0,1mL de 
reagente 1 + 0,1mL de 
reagente 2 
 
B-Tubo na temperatura 
ambiente 
0,1mL de soro + 0,1mL de 
reagente 1 + 0,1mL de 
reagente 2 
 
C- Tubo em temperatura baixa 0,1mL de soro + 0,1mL de 
reagente 1 + 0,1mL de 
reagente 2 
 
 
VALORES DE REFERÊNCIA 
Idade Intervalo (segundos) 
2 meses 26,3 - 47 
5 meses 26,1 - 46 
Crianças a partir de 6 meses e adultos 27,7- 37,6 
 
DISCUSSÃO 
Sobre o significado diagnóstico responda as seguintes questões: 
1. Qual o significado da diferença de tempo de coagulação? 
2. Qual o papel da temperatura? 
REFERÊNCIAS 
MARRONI, Norma Possa.; CAPP, Edson. Fisiologia Prática. Canoas: Ed. Ulbra, 2001.