Relatório Restrição e metilação

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR
AMANDA MELLO DA SILVA OLIVEIRA
RESTRIÇÃO E METILAÇÃO 
 31/10/2018
Outubro, 2018
SUMÁRIO 
1 – Introdução .................................................................................................. 3
2 – Objetivo ...................................................................................................... 4
3 – Materiais e Métodos .................................................................................. 4
 3.1 – Materiais ................................................................................ 4
 3.2 – Metodologia ........................................................................... 4
4 – Resultados e Discursão ............................................................................. 4
5 – Conclusão ................................................................................................... 5
6 – Referências ................................................................................................. 6
1 – INTRODUÇÃO 
Na década de 1950, ocorreu a primeira caracterização do sistema de restrição e metilação em bactérias. Nesses microrganismos esse sistema exerce a função de proteção contra bacteriófagos, vírus de bactérias. Esse sistema em procariotos é caracterizado como tipo I, tendo também os tipos II e III, sendo o sistema do tipo II o mais aplicado na engenharia genética. Em bactérias, enzimas de restrição funcionam como “tesouras” clivando genomas moleculares que não possuem em sua estrutura química um grupo metil, ou seja, genomas que não sofreram metilação.II 
Existem diversas enzimas de restrição sendo as mais conhecidas: Eco RI, Hind III, Bam H1 e Pst I. Algumas aplicações dessas enzimas no âmbito da biologia molecular são: Diagnósticos de doenças genéticas e mapeamento genético através de análises em RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism), clonagem e subclonagem de fragmentos para sequnciamento, expressão gênica, transformação de plantas e AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism) que é utilizado para análises de divergência genética e ainda para mapeamento genético.III 
A metilação do DNA fornece um mecanismo de alteração da estrutura do DNA de forma estável e, pode por essa via, ter um papel na regulação da atividade génica.I Esse processo suprime a transcrição de determinados genes e também promove a alteração da estrutura da cromatina para formas mais condensadas. Com uma grande variedade de aplicações, a metilação do DNA é utilizado em muitos estudos dentre eles estão: a influência deste processo nos fenómenos da inativação dos genes, da marcação parental do genoma, da diferenciação e do envelhecimento das células e organismos.IV
Utilizando o DNA extraído da bactéria Gluconacetobacter diazotrophicus, da primeira aula prática de extração do DNA, foi feito uma técnica de restrição usando a enzima EcoRi, uma enzima de restrição do tipo II usada em laboratórios que corta sítios de ligação mostrados na figura 1. Após o reconhecimento e a clivagem, a enzima forma um padrão específico produzindo extremidades com DNA fita simples. Seu corte ocorre na sequência de reconhecimento ou próximo a ela, sequência essa que é dita palindrómica e de 4 a 8 pb.III
 Figura 1: Sítio de clivagem da enzima EcoRi
2 – OBJETIVO
Realizar a clivagem do DNA bacteriano com a utilização da enzima EcoRi.
3 – MATERIAS E MÉTODOS 
3.1 – Materiais 
Microtubo;
Pipeta e tips;
Água ultra pura 7,8 µl;
DNA genômico (50 ng/µl) 10,0 µl ;
Tampão da enzima (10x)+ 2,0 µL ;
EcoRi (10 U/µl)++0,2 µl 5’ G | AATTC 3’ 
 3’ CTTAA | g 5’
Banho-maria 37ºC
– Metodologia
O procedimento foi dividido em etapas, onde na sua primeira parte foi pipetada em um microtubo as seguintes soluções: Água ultra pura 7,8 µl, DNA genômico (50 ng/µl) 10,0 µl, tampão da enzima (10x)+ 2,0 µl e EcoRi (10 U/µl)++0,2 µl (5’ G | AATTC 3’ / 3’ CTTAA | g 5’). Dando um volume total de 20,0 µl. 
Na segunda etapa o microtubo, com a solução, foi posto em banho-maria a 37ºC, no período de 1h.
– RESULTADOS E DISCURSÃO
Para a leitura dos resultados, fez-se necessário o uso de um marcador com peso molecular para que obtivesse conhecimento dos pares de bandas estabelecidas na eletroforese. O marcador utilizado foi o DNA Ladder DNA Marker for DNA RN que apresenta o seguinte gel de eletroforese: 
Figura 2: Eletroforese do marcador DNA Ladder DNA Marker
Ao final da eletroforese, tivemos os resultados mostrados na figura 3, onde todos os grupos apresentaram três bandas, sendo uma bem nítida e duas fracas. Porém, percebe-se que a primeira banda, forte e nítida, perde sua nitidez em ordem crescente, sendo o grupo A1 com a primeira banda mais nítida e o grupo B3 com a banda mais fraca em comparação aos outros.
Figura 3: Resultados da Digestão do DNA dos grupos.
5 – CONCLUSÃO 
Tendo em vista que o resultado esperado era a formação de três bandas, duas fracas e uma nítida, ao final da corrida do gel na eletroforese, concluímos que todos os grupos alcançaram o resultado esperado, tendo assim êxito nos procedimentos propostos na metodologia.
6 – REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS 
DNA methylation: molecular biology and biological significance / ed. by J. P. Jost; H. P. Saluz – Basel, Boston; Berlin: Birkhäuser, 1993.
Engenharia genética: conceitos básicos, ferramentas e aplicações / Maria Cristina Rocha Cordeiro – Planaltina, DF : Embrapa Cerrados, 2003.
Metzenberg, S. (2002). Lecture 5: Restriction endonucleases. Em Recombinant DNA techniques. Disponível em http://escience.ws/b572/L5/L5.htm.
RIBEIRO, M.M.A. (1994) - Expressão génica e metilação do DNA: causa ou consequência?. Agroforum: Revista da Escola Superior Agrária de Castelo Branco. ISSN 0872-2617. 15:19, p. 9-14.