Relatório de Microobiologia

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INSTITUTO FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CAMPUS DE ALEGRE
Danielle Marques Alvaristo Gabriella da Silva Aguiar Gleick Cruz Ribeiro
Helem Maria Rezende Patrick José de Moraes Silva
Relatório de aula prática
ALEGRE 2017
Danielle Marques Alvaristo Gabriella da Silva Aguiar Gleick Cruz Ribeiro
Helem Maria Rezende Patrick José de Moraes Silva
Relatório de Aula Prática
Trabalho apresentado como requisito parcial para a conclusão da disciplina de Microrganismos do Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo – Campus de Alegre, sob a orientação da Professor Atanásio Alves do Amaral.
ALEGRE 2017
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO
Rios, lagos e poços são fontes de água potável que constantemente podem sofrer contaminação microbiológica, uma vez que muitos resíduos são depositados ou podem infiltrar pelo solo contaminando fontes de água naturais. O esgoto doméstico ou sanitário é o grande poluidor das águas potáveis, além da contaminação com substâncias poluentes também é fonte de contaminação microbiológica, que está presente antes, durante e após o seu tratamento. É através da determinação dos tipos e quantidades de micro-organismos que é possível avaliar e controlar tanto a eficiência dos tratamentos quanto o grau de poluição das águas (DACACH, 1991).
Coliformes totais são compostos por bactérias da família Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de ácido e gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. São bastonetes Gram-negativos, não formadores de esporos, aeróbios ou anaeróbios facultativos (RAY, 1996). Segundo Franco; Landgraf (2003) pertencem a este grupo predominantemente de coliformes totais, bactérias dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destas, apenas a Escherichia coli tem como habitat primário o trato intestinal do homem e animais. Os demais - Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella – além de serem encontrado nas fezes, também estão presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella. Consequentemente, a presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos.
De acordo com Silva et al., (2000); Franco; Landgraf, (2003) coliformes termotolerantes, são as bactérias pertencentes ao grupo das coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas à temperatura de 44,5-45,5ºC. Nessas condições, ao redor de 90% das culturas de Escherichia coli são positivas, enquanto entre os demais gêneros, apenas algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella mantêm essa característica. Segundo Franco (2003), micro- organismos indicadores incluem espécies que quando presentes em um alimento ou na água podem indicar contaminação de origem fecal, possibilidade da presença de patógenos ou deterioração do alimento, bem como indicar falhas nas condições sanitárias, que podem ocorrer desde o processamento até o armazenamento. Afirma ainda que tais micro-organismos
indicadores são bastantes empregados como avaliadores da qualidade microbiológica da água, já que são facilmente detectáveis e sua presença pode indicar contaminação.
Atualmente, para avaliar a potabilidade da água quanto suas características biológicas, podemos fazer uso de inúmeras técnicas de ensaio, procurando detectar a presença de organismos patogênicos. O parâmetro mais empregado para tal é o número mais provável de coliformes, que é um importante indicador de comprovação do contato desta água com os microrganismos presentes nas fezes humanas, de forma que sua detecção seja uma boa indicação de que resíduos humanos estão sendo despejados na água. (TORTORA, 2002). Diante disso, para Vasconcellos; Aquino (1995) as inúmeras técnicas para avaliar a potabilidade da água foram desenvolvidas porque a água é uma substância de fundamental importância para todos os seres vivos, pois sua presença é vital para o funcionamento das atividades celulares e orgânicas, além de corresponder a dois terços da massa corporal humana. Segundo a Revista Dae (2012), em dezembro de 2011, o Ministério da Saúde publicou a portaria N° 2914, que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Esta nova portaria é a quinta versão da norma brasileira de qualidade da água para consumo que, desde 1977, vem passando por revisões periódicas, com vistas a sua atualização e a incorporação de novos conhecimentos, em especial fruto dos avanços científicos conquistados em termos de tratamento, controle e vigilância da qualidade da água e de avaliação de risco a saúde. Essas revisões acomodam, também, possibilidades técnicas e institucionais próprias de cada momento de revisão da norma. E, a cada revisão nota-se a preocupação do Ministério da Saúde e do setor do saneamento em inovar e aprimorar tanto o processo participativo de revisão como as exigências a serem apresentadas. Com base no exposto, os objetivos da prática foi estimar a população de coliformes totais e de coliformes termotolerantes nas amostras de águas de torneira, bebedouro e do poço do laboratório de química, além do estudo de contagem de bactérias feito com qualquer material escolhido, no caso do grupo foi trabalhado a contagem de bactérias de uma aliança cujo mesmo vive em contato com lugares altamente contaminado.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Amostra de água de poço, bebedouro ou torneira (no caso do grupo foi utilizado água do poço do laboratório de química); Tubos de Durhan; Béquer; Pipetas de 5 mL e 4ml; Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); Caldo Bili-lactose-verde-brilhante (BVB); Caldo Escherichia Coli (EC); Água fosfatada tamponada, pH 7,2; Estufa com temperatura de 36 ºC; Alça e agulha de inoculação; Bico de Bunsen; Algodão; Álcool 70 % para esterilização das mãos e da bancada para realização dos procedimentos.
Metodologia
A determinação do N.M.P de coliformes em uma amostra é efetuada a partir de aplicação da técnica de tubos múltiplos. Esta técnica é baseada no princípio de que as bactérias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitação, resultando em uma suspensão de células bacterianas, uniformemente distribuídas na amostra. Consiste na inoculação de volumes crescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma série de tubos. Através de diluições sucessivas da amostra, são obtidos inóculos, cuja semeadura fornece resultados negativos em pelo menos um tubo da série em que os mesmos foram inoculados e combinação de resultados positivos e negativos permite a obtenção de uma estimativa da densidade das bactérias pesquisadas, através da aplicação de cálculos de probabilidade. Para análises de águas, foi utilizado preferencialmente o fator 10 de diluição, sendo inoculados múltiplos e submúltiplos de 1 mL de amostra, usando-se series de tubos para cada volume a ser inoculado. Para determinação de coliformes totais se processa através de 2 etapas (ensaios presuntivo e confirmativo), de realização obrigatória para todos os tipos de amostras de água. A densidade de coliformes fecais é obtida a partir de um exame específico, aplicado paralelamente ao teste para confirmação de coliformes totais.
Na prova presuntiva que engloba os coliformes totais não é necessário realizar várias repetições, os recipientes com a água de poço, bebedouro ou torneira são higienizados com álcool 70% e em seguida, são inoculados de cada amostra quatro séries de três tubos de ensaio, contendo, em cada tubo, 9mL de caldo LST (Lauril-Sulfato-Triptose) e tubos de
Durhan invertidos no fundo. As inoculações foram 10mL, 1mL e 0,1mL. Os tubos com as inoculaçõesforam levados para estufa bacteriológica a 35°C por 24 a 48 horas. Neste caso, as amostras ficaram 48 horas e depois foram acondicionadas na geladeira até a próxima aula. Os tubos foram analisados se apresentassem turvação do meio e presença de gás (bolhas de ar dentro do tubo de Durhan). Com os tubos positivos foram feitos o teste confirmativo de coliformes totais e termotolerantes. Já na prova confirmatória de coliformes fecais e termotolerantes os tubos positivos da prova presuntiva foram replicados para os tubos de ensaio contendo BVB (bile verde brilhante) e EC (Escherichia coli). Foram inoculados dentro da capela e com o auxílio da agulha de inoculação, para isso, foram retirados uma alçada de cada tubo positivo no teste presuntivo e transferido para os devidos tubos contendo os meios de cultura BVB e EC. Os tubos com o meio de cultura BVB foram acondicionados em estufa bacteriológica regulada a temperatura de 35°C por 48 horas, e os tubos com meio EC foram colocados em banho-maria regulado a 45°C por 48 horas. Após este tempo, foram transferidos para geladeira e realizados as observações na aula seguinte. Os dois métodos foram apontados pelo grupo, tanto o de forma presuntiva como o de forma confirmatória e foi feito da seguinte forma, i- homogeneizamos o frasco o frasco contendo a primeira diluição; ii- com uma pipeta esterilizada captamos 10ml do frasco de amostra e inserimos no para um frasco contendo 9ml de diluição, com isso obtivemos a segunda diluição 10 -², onde 1mL da mesma corresponde a 0,01mL da amostra, na Figura 1 pode-se observar melhor o processo.
Figura 1: Diluição da amostra
Em outra etapa preparamos o tubo de ensaio com 9ml de caldo lactosado com a diluição já feita e inoculamos a 10 -¹, 10 -² e 10 -³ e colocamos o tubo Durhan invertido dentro do tubo de ensaio e devolvemos a estufa a 36ºC até completar 48 horas. No final dessa etapa após 48 horas foi observado que ocorreu turvação ou formação de gás em alguns tubos de ensaio que continha 10 -¹ e 10 - ² essa formação de gás estava presente dentro do tubo Durhan, significando então que o teste presuntivo estava positivo para a presença de bactérias, e os que não houveram turvação ou formação de gás durante o período de incubação significa que o
resultado é negativo. Para o ensaio confirmativo de coliformes fecais termotolerantes tomamos todos os tubos do ensaio presuntivo que deram positivos (turvação do meio e formação de gás) e todos os tubos negativos em que houve crescimento após 48 horas, na amostra direta e nas duas diluições transferimos, com alça de platina flambada e fria, uma porção para os tubos de ensaio contento o meio E.C, homogeneizar e deixar todos os tubos incubamos novamente na estufa a 36 ºC por mais 24 horas e se no final de 24 horas ou menos houver a formação de gás, está indicado a presença de coliformes de origem fecal.
RESULTADOS
A partir da análise feita no Laboratório das 12 amostras de água colhidas do viveiro no Ifes- Campus Alegre foi negativo para coliformes totais e E. coli. Em um estudo realizado por Moura et al. (2009), a ausência da contaminação fecal pode está associada à característica do solo, à profundidade dos poços e ao desnível do terreno.
Em relação à turbidez e cor das amostras conforme Paludo (2010) indicam presença de material sólido em suspensão, podendo ser um indício de presença de matéria orgânica e outros compostos, que podem servir de nutriente para o desenvolvimento de microrganismo.
Por fim, constatou- se que a água do poço encontra-se nos parâmetros estabelecidos pela legislação.
REFERÊNCIAS
PALUDO, Diego. Qualidade da água nos poços artesianos do Município de Santa Clara do Sul. Lajeado, 2010.
MOURA, Marisa H. G. BUENO, R.M. MILANI, Idel C.B.; COLARES, G.L. Análises das
águas dos poços artesianos do campus CAVG – UFPEL. 2ª Mostra de Trabalhos de Tecnologia Ambiental. Rio Grande do Sul: Pelotas, 2009.
DACACH, N.G. Tratamento primário de esgoto. Ed. EDC, Rio de Janeiro, 1991.
FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu: São Paulo, 2003. 182p.
SILVA, N.; SILVEIRA, N. F. A.; JUNQUEIRA, V. C. A.; CATANÚSIO NETO, R. Manual
de métodos de análise microbiológica da água. Campinas: ITAL/ Núcleo de Microbiologia, 2000. 99p. (Manual Técnico).
TORTORA, G. J. & FUNKE, R. B. & CASE L. C. Microbiologia. p. 729-730, ARTMED
Editora, 6ª ed, 2002.
VASCONCELOS, J. C.; AQUINO, J. S. de. Análise microbiológica (potabilidade) da água consumida em escolas públicas de conjuntos habitacionais da zona oeste de Manaus- Amazonas. Bol. CEPPA, Curitiba, v.13, p. 119-124, 1995.
REVISTA DAE. NOVA PORTARIA DE POTABILIDADE DE ÁGUA: Busca de consenso
para viabilizar a melhoria da qualidade de água potável distribuída no Brasil. Nº 189 - Maio/Agosto 2012.