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Toxicologia II (Toxicologia de Alimentos) Departamento de Farmácia FFOE UFC Profª Drª Janete Eliza Soares de Lima Considerações Gerais: Sustância química agente tóxico. Limite de tolerância (LT). Interação entre agente químico e organismo vivo (idade, sexo, variação biológica e condições de saúde e nutrição do organismo) efeito tóxico tecidual ou celular. Profª Janete Eliza Soares de Lima 2 Considerações Gerais Dano ou efeito adverso alteração anormal, indesejável ou nociva: Morte no consumo de alimento no peso corpóreo ou de órgãos anátomo-patológicas nos níveis enzimáticos Profª Janete Eliza Soares de Lima 3 Considerações Gerais: HOMEOSTASIA dificuldade de distinção entre efeito adverso (efeito patológico) e a adaptação (efeito fisiológico e bioquímico). DOSE: administrada ou absorvida toxicocinética e vias de exposição. Profª Janete Eliza Soares de Lima 4 Considerações Gerais: DOSE: quantidade da substância por animal. ◦ Exemplo: mg/animal DOSAGEM: quantidade da substância por parâmetro escolhido do animal. ◦ Exemplo: mg/kg ou mg/cm2 CONCENTRAÇÃO: quantidade da substância dissolvida ou dispersa em meio (líquido, semissólido ou gasoso). ◦ Exemplo: mg/mL; g/L; mg/cm3 Profª Janete Eliza Soares de Lima 5 Profª Janete Eliza Soares de Lima 6 Espécie Peso (g) Dosagem (mg/kg) Dose (mg/animal) Área de superfície (cm2) Dosagem (mg/cm2) Camundongo 20 100 2 46 0,043 Rato 200 100 20 325 0,061 Porquinho da China 400 100 40 565 0,071 Coelho 1500 100 150 1270 0,118 Gato 2000 100 200 1380 0,145 Macaco 4000 100 400 2980 0,134 Cão 12000 100 1200 5770 0,207 Ser humano 70000 100 7000 18000 0,388 *Superfície de área do animal é obtida aproximadamente pela fórmula: SA = 10.5 × (Peso corporal, em gramas)2/3 Área de superfície corporal é aproximadamente obtida segundo a fórmula: AS = 10.5 × (massa corporal em g)2/3 Profª Janete Eliza Soares de Lima 7 Peso do homem 3.500 x rato Profª Janete Eliza Soares de Lima 8 Área de superfície do homem 390 x rato Dosagem: quantidade de substância/cm2 extrapolação mais confiável uso para substâncias com alta toxicidade. Fatores que mais influenciam a toxicidade em relação a um local específico: ◦ Duração e frequência de exposição. Frequência de exposição ao Agente tóxico (Casarett) Classificação Período Aguda 24 horas Subaguda ≤ 1 mês Subcrônica 1 a 3 meses Crônica ≥ 3 meses Profª Janete Eliza Soares de Lima 9 Fatores que mais influenciam a toxicidade em relação a um local específico: ◦ Via de administração: Exposição aguda: intraperitonial, intravenosa, e injeção subcutânea; intubação oral; e aplicação dérmica; inalação (contínua por 4 horas). Exposições repetidas (subaguda, subcrônica e crônica): qualquer via (preferência é a oral através de alimento, seguida da via inalatória). Profª Janete Eliza Soares de Lima 10 Profª Janete Eliza Soares de Lima 11 Avaliação da Toxicidade Injeção na veia da cauda: Usando seringa ou tubo de alimentação: Profª Janete Eliza Soares de Lima 12 Avaliação da Toxicidade Sonda nasogástrica em macaco: Profª Janete Eliza Soares de Lima 13 Avaliação da Toxicidade Injeção intravenosa em macaco Rhesus: Profª Janete Eliza Soares de Lima 14 Avaliação da Toxicidade Macaco Cynomolgus com jaqueta de infusão (acesso vascular na região torácica dorsolateral): Relação dose-resposta ou concentração- resposta: ◦ Descreve a relação entre as características de exposição e o espectro de efeitos tóxicos. ◦ Curva gaussiana teórica e curva sigmóide. ◦ Mortalidade ou outro efeito tóxico após a exposição a dose/conc. da substância testada. ◦ Serve para calcular vários índices: DL50 ou CL50, a dose ou concentração limite (mín. p/ produzir uma resposta detectável), NOEL ou NOAEL (dose em que não se observam efeitos tóxicos). ◦ Índices classificar e comparar a toxicidade entre as substâncias. Profª Janete Eliza Soares de Lima 15 Profª Janete Eliza Soares de Lima 16 Dose ou Concentração Representação hipotética da relação frequência-resposta através da administração de um agente químico a uma população uniforme de espécimes biológicos. Profª Janete Eliza Soares de Lima 17 Dose ou concentração (escala logarítmica) Relação hipotética doses-resposta para um medicamento administrado a uma população uniforme de animais. Cada ponto representa a resposta de um animal. *Hiporreativo e hiperreativo. Profª Janete Eliza Soares de Lima 18 Efeito da morfina em camundongos: postura anormal da cauda e das extremidades Porte normal Porte anormal Profª Janete Eliza Soares de Lima 19 Profª Janete Eliza Soares de Lima 20 Relação dose-freqüência: Profª Janete Eliza Soares de Lima 21 Profª Janete Eliza Soares de Lima 22 Dose ou concentração (escala linear) Curvas doses-resposta hipotéticas para agentes químicos (A e B) administrados a uma população uniforme de espécimes biológicos Profª Janete Eliza Soares de Lima 23 Dose ou concentração (escala linear) Curvas doses-resposta hipotéticas para agentes químicos (C e D) administrados a uma população uniforme de espécimes biológicos Profª Janete Eliza Soares de Lima 24 Dose ou concentração (escala logarítmica) Curvas doses-resposta hipotéticas para agentes químicos (G, F e E) administrados a uma população uniforme de espécimes biológicos Índice terapêutico: ◦ DL50/DE50 ou ◦ DL1/DE99 Profª Janete Eliza Soares de Lima 25 Dose ou concentração (escala logarítmica) Curvas doses-resposta hipotéticas correspondente a um medicamento administrado a uma população uniforme de espécimes biológicos. Curva A representa o efeito terapêutico (por exemplo anestesia) e curva B o efeito letal. Tipos de Testes Toxicológicos: ◦ Fármacos: triagem farmacológica testes de toxicidade. ◦ Agentes químicos testes de toxicidade. ◦ Testes toxicológicos: Informações preliminares Curva dose/conc.-resposta Toxicidade aguda, sub-crônica e crônica Toxicocinética Mutagênese e carcinogênese Reprodução e teratogênese Efeitos locais sobre a pele e olhos Sensibilidade cutânea Ecotoxicidade Profª Janete Eliza Soares de Lima 26 Princípios para testes toxicológicos em animais: ◦ Efeitos produzidos pela substância no animal de laboratório deve ocorrer no homem. Exemplo: tetracloreto de carbono: homem (hepatoxico), frangos (não hepatóxico). ◦ Exposição de animais a doses de um agente químico descobrir efeitos danosos no homem. Profª Janete Eliza Soares de Lima 27 Informações preliminares da substância: ◦ Quimicamente caracterizada. ◦ Impurezas conhecidas quali e quantitativamente: TCDD (tetraclorodibenzodioxina) com DL50 = 25-50 mcg/Kg, impureza do praguicida pentaclofenol (DL50, VO, = 150-200 mg/Kg). ◦ Propriedades físico-químicas. ◦ Níveis de exposição da população à substância. ◦ Ajudam a predizer a mobilidade da substância ambiente. Profª Janete Eliza Soares de Lima 28 Toxicidade Aguda: ◦ Quantidade de animais mortos. ◦ Observar o início, a natureza e duração da intoxicação. ◦ Observações clínicas. ◦ Exames anátomo-patológicos. ProfªJanete Eliza Soares de Lima 29 Toxicidade Aguda: ◦ Dose única ou múltipla em 24 horas. ◦ Via Oral (VO) e outras. ◦ Objetiva caracterizar a relação dose-resposta que conduz ao cálculo da DL50 ou CL50. ◦ Delinear o estudo de toxicidade sub-crônica. Profª Janete Eliza Soares de Lima 30 DL50 ou CL50: ◦ Fazer referência à via de exposição, aos excipientes, à espécie animal utilizada. ◦ Obtenção da curva: resposta devida à administração da substância, relacionada com a dose ou conc., avaliadas por métodos quantificáveis e expressando exatamente a toxicidade. ◦ Desvantagens da informação apenas da DL50 ou CL50: sem informação sobre a curva de origem, grande nº de animais, dose/conc. limites para substâncias com DL50 ou CL50 (mecanismos de ação diferentes). Profª Janete Eliza Soares de Lima 31 DL50 : ◦ Em geral, ratos albinos ≥ 10 por dose: machos e fêmeas. ◦ Mínimo de 4 doses crescentes. ◦ Menor dose: nenhuma morte. ◦ Maior dose: 100% de mortes. ◦ Temperatura: 22 ± 3º C. Profª Janete Eliza Soares de Lima 32 DL50 : ◦ Dose (dosagem): mg/kg em peso corpóreo, ou por cm2 de área de superfície corpórea. ◦ Intervalo válido: 1-5000 mg/kg de pc. ◦ Ou limite máximo: 2000 mg/kg de pc. ◦ Interferentes na determinação da DL50: variáveis concernentes aos animais, às substâncias e às instalações, além dos fatores periódicos. Profª Janete Eliza Soares de Lima 33 Variáveis interferentes da DL50 relativas aos (às) Animais Espécie, linhagem, idade, sexo, estado nutricional, estados patológicos. Substâncias Via, veículo, volume, velocidade de administração. Instalações Tipo de gaiola, temperatura ambiente, umidade relativa do ar. Fatores periódicos Duração do período de adaptação, ciclo dia e noite, qualidade da ração animal. Profª Janete Eliza Soares de Lima 34 Avaliação da Toxicidade Toxicidade aguda oral do carbaril em diferentes animais Animais DL50 (mg/kg) Cobaia 280 Camundongo 360-590 Rato 540-720 Coelho 710 Profª Janete Eliza Soares de Lima 35 Avaliação da Toxicidade DL50 Condições Via Oral Teste de 2 semanas. Via Dérmica Teste de 2 semanas. Aplicação no dorso do animal. Profª Janete Eliza Soares de Lima 36 Avaliação da Toxicidade CL50 Condições Via Respiratória Curto prazo: concentrações por 4 horas. Exposições repetidas: exposição diária de 6 horas durante 28 dias. Temperatura: 22 ± 3º C. Substância com diâmetro ≤ 3 m. Profª Janete Eliza Soares de Lima 37 CL50 Unidade mg/m3 ou ppm mg/m3 = ppm MM / 24,45* ppm = mg/m3 24,45*/ MM * Volume (L) de 1g da substância a 25º C em 1 atm. Profª Janete Eliza Soares de Lima 38 Classificação de toxicidade* Classificação DL50 (mg/kg de pc, VO em ratos) Muito tóxico menor que 25 Tóxico de 25 a 200 Nocivo 200 x ≤ 2000 Profª Janete Eliza Soares de Lima 39 Comunidade Européia (OGA, 2008) Contaminantes Ambientais Classificação CL50 (ppm, 4 horas) Extremamente tóxicos x ≤ 50 Altamente tóxicos 50 x ≤ 100 Moderadamente tóxicos 100 x ≤ 1000 Pouco tóxicos 1000 x ≤ 10.000 Praticamente atóxicos x 10.000 Profª Janete Eliza Soares de Lima 40 Classificação de Toxicidade Aguda: Profª Janete Eliza Soares de Lima 41 Administração Denominação DL50 - Dose oral única (rato) DL50 - Dose cutânea única (coelho) CL50* - Inalação de vapor / 4 h (rato) Possível dose oral letal a um homem adulto Extremamente tóxico < 1 mg/Kg < 5 mg/Kg 10 1 gota, 1 pedaço Altamente tóxico 1-50 mg/Kg 5-50 mg/Kg 10-100 1 colher (4 mL) Moderadamente tóxico 50-500 mg/Kg 50-350 mg/Kg 100-1.000 30 g Ligeiramente tóxico 0,5-5 g/Kg 0,35-0,3 g/Kg 1.000-10.000 250 g Praticamente não tóxico 5-15 g/Kg 3-25 g/Kg 10.000-100.000 1 L Relativamente inócuo > 15 g/Kg 25 g/Kg > 100.000 > 1 L *Concentração letal média, expressa em ppm. Teste de dose fixa: ◦ Proposta de teste para substituir a DL50 ou CL50. ◦ Doses fixas específicas (5, 50 e 500 mg/kg de pc por VO), 14 dias de observação, em 10 animais (5 machos e 5 fêmeas). ◦ Correlação entre as doses de com toxicidade sem morte, e as DL50 da classificação de toxicidade da Comunidade Européia: 80-90% dos compostos correspondente. Profª Janete Eliza Soares de Lima 42 Teste de dose fixa: Profª Janete Eliza Soares de Lima 43 500 mg/kg de pc (VO) em ratos Sem sinal de toxicidade sinal de toxicidade sem morte Sem classificação Nociva toxicidade com morte 50 mg/kg de pc (VO) em ratos toxicidade com morte sinal de toxicidade sem morte Tóxica 5 mg/kg de pc (VO) em ratos sinal de toxicidade e ou morte Muito tóxica Testar 2000 mg/kg de pc (VO) em ratos Toxicidade Subcrônica: ◦ 21 - 90 dias. Pelo menos em 2 espécies, sendo uma não- roedora. Pelo menos 3 doses. Pelo menos um exame diário. ◦ Muitas vezes único teste com doses repetidas. ◦ Objetiva: observar os efeitos tóxicos, identificar e caracterizar os órgãos afetados e a severidade da intoxicação pós-exposição, reversibilidade dos efeitos, acúmulo da substância ou não. Delinear o estudo de toxicidade crônica. ◦ Avaliações hematológicas e bioquímicas do sangue, exames de urina: início, meio e final do teste. ◦ No final avaliação: anatomopatológica. Profª Janete Eliza Soares de Lima 44 Toxicidade Crônica: ◦ Mais de 90 dias. Pelo menos em 2 espécies. 50 animais para cada dose e sexo. Pelo menos 3 doses. Pelo menos um exame diário. ◦ Objetivo: também investigar efeitos carcinogênicos, mutagênicos e teratogênicos. ◦ Avaliações hematológicas e bioquímicas do sangue, exames de urina: início, aos 6 meses e final do teste. ◦ No final avaliação: anatomopatológica. Profª Janete Eliza Soares de Lima 45 Toxicidade Crônica: toxicidade acumulada de um agente tóxico Curto Prazo Mín. de 3 doses diárias, por via oral, dérmica e respiratória por 28 dias. Maior dose ≤ dose c/ 10% de mortes. Menor dose sem sinais e sintomas. Profª Janete Eliza Soares de Lima 46 Toxicidade Crônica: Médio Prazo Período de tempo ≤ 10% da vida média do animal. Via oral e respiratória, 3 meses a 1 ano. Via dérmica, período menor. Mín. de 3 doses diárias. 20 animais por dose (10 machos e 10 fêmeas). Maior dose permita observações histológicas e dos parâmetros bioquímicos. Profª Janete Eliza Soares de Lima 47 Toxicidade Crônica: Longo Prazo Período de tempo mín. de 1 ano. Via oral preferível. Via respiratória, contínua ou intermitente. 40 animais por dose testada. Maior dose permita observações histológicas e dos parâmetros bioquímicos (renal e hepático). Profª Janete Eliza Soares de Lima 48 Exposição ao agente tóxico e efeitos (Casarett) Exposição aguda Exposição crônica Efeito tóxico agudo (imediato) Efeito tóxico crônico Efeito tóxico similar a exposição crônica Efeito tóxico similar a exposição aguda Ex.: Manifestação tóxica aguda primária do benzeno = depressão do SNC. Exposição crônica ao benzeno = leucemia. Profª Janete Eliza Soares de Lima 49 Estudos de mutagênese e carcinogênese: ◦ Mutagênese: no material genético das células, transmitidas às novas células durante a divisão. ◦ Testein vitro de mutagênese: cepas mutantes de Salmonella typhimurium (sem fosforibosil ATP sintetase que produz a histidina). Uso de meio de reação de suspensão de microssoma hepático de rato. Profª Janete Eliza Soares de Lima 50 Teste de Ames: Profª Janete Eliza Soares de Lima 51 Estudos de mutagênese e carcinogênese: ◦ Teste in vivo de mutagênese: observação de danos aos cromossomas de células da medula óssea em metáfase, aparecimentos de micronúcleos de linfócitos de sangue periférico e teste do dominante letal. Profª Janete Eliza Soares de Lima 52 Micronúcleos Teste do dominante letal: Profª Janete Eliza Soares de Lima 53 Estudos de mutagênese e carcinogênese: ◦ Carcinogênese: mecanismos genotóxicos (mutagênese), e não genotóxicos (citotoxicidade com regeneração, junto com da síntese de DNA; desbalanços hormonais; imunossupressores e promotores da expressão de oncogenes). ◦ Uso da maior dose tolerada: não leve a morte no período de vida média do animal e com de peso 10 %. Profª Janete Eliza Soares de Lima 54 Estudos de desenvolvimento, teratogênese e reprodução: ◦ Teratogênese: entre a concepção e o nascimento. ◦ Avaliação da fertilidade e desempenho na reprodução, potencial teratogênico, toxicidade peri- e pós-natal e efeitos sobre o sistema reprodutor. ◦ Altas doses no período da organogênese: TERATOGÊNESE. ◦ Doses menores durante a gestação: EMBRIOTOXICIDADE ou FETOTOXICIDADE. Profª Janete Eliza Soares de Lima 55 Estudos de toxicocinética: ◦ A abrangência: todas as etapas da toxicocinética. ◦ As diferenças entre os diversos animais testes e o homem. Estudos de efeitos locais sobre a pele e olhos: ◦ Abrangência: cosméticos e exposições acidentais. ◦ Animais: coelho e cobaia. ◦ Parâmetros: eritema, escara, edema e corrosão. Profª Janete Eliza Soares de Lima 56 Profª Janete Eliza Soares de Lima 57 Estudos de efeitos locais nos olhos: ◦ Irritação ocular na córnea (opacidade) Profª Janete Eliza Soares de Lima 58 Estudos de efeitos locais nos olhos: ◦ Irritação ocular na íris (processo inflamatório ou irite) Profª Janete Eliza Soares de Lima 59 Estudos de efeitos locais nos olhos: ◦ Irritação ocular na conjuntiva (vermelhidão) Profª Janete Eliza Soares de Lima 60 Estudos de efeitos locais nos olhos: ◦ Irritação ocular na conjuntiva (quemose) Estudos de sensibilidade cutânea: ◦ Quando houver possibilidade de contatos repetidos com a pele. ◦ Animais: coelho e cobaia. 1 -2 semanas com doses repetidas da substância. 2-3 semanas após a última exposição: aplica-se dose não irritante e observa-se o eritema. Cuidado com as impurezas. Profª Janete Eliza Soares de Lima 61 Profª Janete Eliza Soares de Lima 62 Estudos de sensibilidade cutânea: ◦ Com ou sem uso adjuvantes: Adjuvante Completo de Freund (ACF) = imunopotenciador ou facilitador de sensibilização. ◦ Teste de maximização de Magnusson e Kligmann: ACF + lauril sulfato de sódio (oclusão tópica ou intradérmica). Profª Janete Eliza Soares de Lima 63 Estudos de ecotoxicidade: ◦ Estudo do efeito tóxico no ecossistema e seus componentes. ◦ Interações entre as substâncias no ambiente e condições climáticas (smog fotoquímico: HC + NOx + {UV} + O2 nitratos de peroxiacila); da temperatura; enchentes. ◦ Descoberta da biomagnificação. Profª Janete Eliza Soares de Lima 64 Profª Janete Eliza Soares de Lima 65 Profª Janete Eliza Soares de Lima 66 Profª Janete Eliza Soares de Lima 67 Região de homeostasia Limite para a resposta adversa Morte Deficiência Toxicidade R e s p o s ta Profª Janete Eliza Soares de Lima 68 Identificação do material teste Caracterização química Revisão da literatura Relação estrutura/atividade Estudos em animais a curto prazo (aguda/ subaguda) Toxicoloia Genética in vitro Biotransformação/Farmacocinética Toxicidade Subcrônica Reprodução/Teratogênese Toxicidade Crônica Oncogênese
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