AULA 5. MÉTODOS DE ESTUDO EM MICROSCOPIA

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MÉTODOS DE ESTUDO EM 
HISTOLOGIA 
Profa Ms Kaira Emanuella 
HISTOLOGIA 
• Tecidos do corpo  órgãos 
• 4 tipos de tecidos fundamentais: 
• Tecido Epitelial 
• Tecido Conjuntivo 
• Tecido Muscular 
• Tecido Nervoso 
HISTOLOGIA 
• Definição: É o estudo dos tecidos que compõe o 
organismo e o modo como eles se organizam para 
constituir os órgãos 
TECIDOS 
• Constituição: 
 
• Células + matriz extracelular (MEC) 
 
• Cada tecido: 
 
• Células + MEC característicos 
 
 
• Distinção no reconhecimento 
PREPARAÇÃO DE ESPÉCIMES PARA 
MICROSCOPIA 
 • Pequena dimensão das células e dos componentes da 
matriz extracelular (MEC) = MO 
• Ferramentas e os métodos de investigação compreensão 
das células, tecidos e órgãos. 
• Estudo de tecidos ao microscópio  preparação de cortes 
histológicos 
• Microscópio de luz a imagem se forma a partir dos raios 
luminosos de um feixe de luz que atravessou uma estrutura. 
• Células vivas, camadas muito delgadas de células ou de 
tecidos, membranas transparentes de animais 
vivos podem ser observadas diretamente ao microscópio 
 
PREPARAÇÃO DE ESPÉCIMES PARA 
EXAME MICROSCÓPICO 
 
• Tecidos espessos impossibilita a passagem de luz  
Fatiados (Cortes histológicos) em micrótomo Lâminas de 
vidro  tratamentos  Leitura 
• Tratamentos de tecidos para preparo histológico: 
• FIXAÇÃO 
• INCLUSÃO 
• FIXAÇÃO FÍSICA POR CONGELAÇÃO 
• COLORAÇÃO 
 
 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
FIXAÇÃO 
• Evitar autólise e preservar estrutura e composição 
• Endurecer os fragmentos 
• Física (congelamento) 
• Química (formaldeído 4%) ou Glutaraldeído 
• Cuidados para preservar detalhes da ultraestrutura 
das células e da matriz 
• Glutaraldeído tamponado  Tetróxido de ósmio = 
preserva e fornece contraste aos lipídios e 
proteínas 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
INCLUSÃO 
• Substâncias que deem uma consistência rígida ao 
tecido 
• Inclusão em parafina ou resina: 
• 1) Desidratação em etanol (70%100%) 
• 2) Clareamento em xilol e o toluol (tecidos transparentes ou 
translúcidos)colocados em parafina derretida (56-60ºC)  
Preenchimento do tecido com parafina  Solidificação do tecido  
Microtomia 
 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
MICROTOMIA 
• Cortes de 4µm de espessura em lâmina de vidro 
• 1µm = 0,001mm 
FIXAÇÃO POR CONGELAÇÃO 
• Congelamento rápido; 
• método físico de fixação, tornando-se rígidos e, assim, 
prontos para serem seccionados. 
• Corte em Criostato 
• Não inativa a maioria das enzimas e mantém muitas 
proteínas em suas conformações naturais 
• Estudar lipídeos= aconselha-se o uso de secções 
congeladas 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
COLORAÇÃO 
• Tecidos incolores 
• Seletividade maior ou menor 
• Evidenciar os vários componentes dos tecidos, células e 
MEC 
• Corantes: caráter ácido (acidófilos) ou básico (basófilos) que 
formam ligações eletrostáticas (salinas) com componentes 
ionizados dos tecidos 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
COLORAÇÃO 
• Corantes Básicos: 
• Azul de toluidina 
• Azul de metileno 
• Hematoxilina 
Ex: ácidos nucleicos, glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas 
• Corantes Ácidos 
• Orange G, 
• Eosina, Fucsina ácida 
Mitocôndrias, grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e 
colágeno 
 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
COLORAÇÃO 
Hematoxilina e eosina (H & E) 
• Hematoxilina: corante básico (azul 
ou violeta) 
• Liga-se à estruturas basófilas (núcleo) 
 
• Eosina: corante ácido (rosa) 
• Liga-se à estruturas acidófilos 
(citoplasma) 
• Células intestinas de camundongos 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
Hematoxilina e eosina (H & E) 
Aplicações: 
Caracterização do tecido 
Identificação de carcinoma 
Identificação de infiltrado inflamatório → PATOLOGIA 
 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
Células renais humanas 
Hematoxilina e eosina (H & E) 
Infiltrado inflamatório 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
Células Hepáticas de camundongos 
Hematoxilina e eosina (H & E) 
Necrose 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
Células Hepáticas de camundongos 
COLORAÇÃO 
• Pouquíssima informação sobre a natureza química dos 
componentes dos tecidos. 
• Contracorante -IH 
• Impregnação por metais, como prata e ouro (tecido 
nervoso) 
 
 
 
PREPARAÇÃO DE TECIDO PARA 
MICROSCOPIA 
• Transiluminação 
• Partes mecânicas e ópticas 
Sistemas de lentes: 
• Condensador 
• Objetivas 
• Oculares 
• Condensador: concentra a luz de 
uma lâmpada e projeta um feixe 
luminoso sobre o espécime; 
• Objetiva recebe a luz que 
atravessou o espécime  imagem 
aumentada do espécime em 
direção à ocular  amplia a 
imagem e a projeta na retina, em 
uma tela, em uma câmera 
fotográfica ou em um detector 
eletrônico. 
 
 
MICROSCOPIA DE LUZ 
MICROSCOPIA DE LUZ 
 RESOLUÇÃO 
• Imagem aumentada e com detalhes 
•Limite de resolução: 
• A menor distância entre 2 partículas que 
permite visualizá-las como 2 objetos separados. 
• MO: 0,2µm (0,002mm) 
• MET: 3nm (0,003µm ou 0,00003mm) 
MICROSCÓPIO DE LUZ 
- Cortes - 
MICROSCÓPIO DE LUZ 
- superfície - 
Microscópio de Luz - ML 
Microscópio Eletrônico 
de Transmissão - MET 
Microscópio Eletrônico 
de Varredura - MEV 
ML: 
  1.000x 
  0,2 µm 
MET: 
  500.000x 
  0,0002 µm 
MEV: 
  10 a 150.000x 
  0,02 µm 
 
MICROSCOPIA CONFOCAL 
• O espécime é iluminado por 
um feixe de luz muito estreito 
• A imagem coletada deve 
passar por um orifício muito 
pequeno 
• Focalizar um único plano de 
cada vez sem deterioração da 
imagem 
MICROSCOPIA CONFOCAL 
CROMOSSOMOS - CONFOCAL 
MICROSCOPIA CONFOCAL 
• Azul: DNA 
• Verde: filamentos inter- 
mediários 
• Vermelho: filamentos de 
actina 
Cultura de plasmócitos 
Fases do ciclo celular 
MICROSCOPIA CONFOCAL 
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA 
• Indicar métodos que identificam e localizam substâncias 
em células e matriz extracelular, seja em cortes 
histológicos ou em células cultivadas 
• Reações químicas específicas ou em interações de alta 
afinidade entre moléculas. 
• Originam substâncias insolúveis coloridas (para 
microscopia de luz) ou elétron-densas (para microscopia 
eletrônica) 
 
 
REAÇÃO DE IMUNOHISTOQUÍMICA 
(IH) 
• Detecção da reação química: 
 
 
• Anti-Leishmania + enzima  PRECIPITADO MARROM 
 
Substrato da enzima 
Infecção por Leishmania sp. Amastigotas extracelulares (A) e intracelulares (B). 
REAÇÃO DE IMUNOFLORESCÊNCIA 
• Baseada na excitação de átomos de fluorocromo. 
1. Emissão de luz (fotons) com pequeno λ(comprimento de 
onda) 
2. Excitação de elétrons, os quais saltam de camada 
3. Estes retornam à sua camada original. 
4. Liberação de luz (fótons) em um maior comprimento de 
onda (visível). 
5. Visualização com microscópio de fluorescência (confocal) 
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA 
• Laranja: Marcador 
anti-L. monocitogenes 
 
• Verde: Filamentos de 
actina 
 
• Amarelo: 
Sobreposição das 
duas marcações: 
• Laranja e verde Infecção por Listeria monocitogenes 
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA 
MICROSCOPIA DE ELETRÔNICA DE 
VARREDURA 
Eritrócitos humanos 
MICROSCOPIA DE ELETRÔNICA DE 
VARREDURA 
Mucosa respiratória de ratos 
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS 
• Células podem sermantidas vivas e estudadas fora do 
corpo 
• Análise direta do comportamento de células vivas por 
meio de um microscópio; 
• Cultivadas em soluções de composição conhecida (sais, 
aminoácidos, vitaminas) às quais são frequentemente 
adicionados componentes do soro; 
• Cultivadas: suspensão, placa de Petri ou uma lamínula 
de vidro 
• Área estéril 
 
FRACIONAMENTO CELULAR 
• Organelas e outros componentes das células e tecidos 
purificados e isolados 
• Processo físico pelo qual é usada força centrífuga para 
separar organelas e componentes celulares em função 
de seus coeficientes de sedimentação. 
• A composição química e as funções 
das organelas e moléculas podem então ser estudadas in 
vitro. 
• As frações obtidas por essas técnicas podem ser 
analisadas ao microscópio eletrônico para verificar sua 
pureza