Biofilmes Microbianos

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Biofilmes Microbianos 
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Introdução 
Comportamento coletivo 
Comunidades associadas às superfícies 
Estrutura dos Biofilmes 
Por que formar um biofilme? 
Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica 
Aquisição de novas características genéticas 
Papel dos biofilmes nas doenças 
Genética da formação dos biofilmes 
 
Introdução 
Nossa percepção de bactérias como organismos unicelulares baseia-se 
essencialmente no conceito de culturas puras, nas quais as células 
podem ser diluídas e estudadas a partir de culturas líquidas. Como 
praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiológicos 
foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, 
somente há alguns anos começamos a entender que, na realidade, a 
maioria das bactérias se encontra na natureza vivendo em 
comunidades, de maior ou menor estruturação. 
O tipo de "ecologia" que imaginávamos em relação aos procariotos, ou 
seja, células individuais crescendo de maneira planctônica (livres, em 
suspensão), raramente é encontrado na natureza. Sabe-se atualmente 
que, quando em seus habitats naturais, via de regra as bactérias são 
encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, 
associadas a superfícies diversas, geralmente compondo um biofilme, 
isto é, um ecossistema estruturado altamente dinâmico, que atua de 
maneira coordenada. 
Assim, embora possam ter uma existência planctônica independente, 
este tipo de vida parece ser eventual. 
Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser 
formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de 
múltiplas espécies, podendo ser encontrados em uma variedade de 
superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta maneira, muitos autores 
definem biofilmes como associações de microrganismos e de seus 
produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies 
bióticas ou abióticas. 
Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas 
distintas. Inicialmente temos or organismos denominados 
colonizadores primários, que se aderem a uma superfície, geralmente 
contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas 
passam a se desenvolver, originando microcolônias que sintetizam 
uma matriz exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como 
substrato para a aderência de microrganismos denominados 
colonizadores secundários. Estes colonizadores secundários podem se 
aderir diretamente aos primários, ou promoverem a formação de 
coagregados com outros microrganisos e então se aderirem aos 
primários. 
 
Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonização primária de um substrato; (b) 
crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com o 
desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células 
coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de 
múltiplas espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme 
maduro. 
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003) 
 
Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinâmica pois, de 
acordo com os microrganismos que o compõem, teremos consições 
físicas, químicas e biológicas distintas. Estas alterações fazem com que 
cada biofilme seja único, de acordo com os microrganismos presentes. 
Neste sentido, ao longo do tempo a composição microbiana dos 
biofilmes geralmente sofre alterações significativas. A figura abaixo 
ilustra não somente a estruturação fisico-química de um biofilme, mas 
também sua evolução e amadurecimento, dependendo das relações 
estabelecidas pelos microrganismos presentes. 
 
 
Estágios de formação e vida de um biofilme, determinados por fatores 
físicos, biológicos e ambientais 
(Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001) 
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Comportamento coletivo 
Há várias décadas, foi proposto que as bactérias poderiam 
corresponder a organismos interativos, capazes de atuar 
coletivamente, facilitando sua adaptação às alterações ambientais. 
Para que um biofilme de uma ou várias espécies seja formado, é 
necessário o estabelecimento de um comportamento multicelular, que 
se reflete em atividades coordenadas de interação e comunicação dos 
vários organismos. Assim, os biofilmes não são simples camadas 
viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biológicos 
altamente organizados, onde as bactérias estabelecem comunidades 
funcionais estruturadas e coordenadas. 
Um dos mecanismos de comunicação interbacteriana que vem se 
mostrando extremamente importante na formação e desenvolvimento 
de biofilmes corresponde ao quorum sensing. 
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Comunidades associadas às superfícies 
Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado às formas 
de vida superiores, assim como vários ambientes inóspitos à maioria 
das formas de vida. Tal fato é decorrente de sua inigualável 
diversidade metabólica e plasticidade fenotípica. Um dos importantes 
aspectos associados a esta ubiqüidade está relacionado à capacidade 
destes organismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se 
propagar. O mecanismo mais comum que permite a migração dos 
procariotos corresponde à motilidade, seja de origem flagelar, 
deslizante, ou de outro tipo. No entanto, são conhecidos mecanismos 
que também permitem a migração bacteriana. Por exemplo, algumas 
espécies podem sintetizar celulose, originando uma película que 
mantém as células próximas à interface ár-água, ou na superfície de 
plantas. Bactérias fotossintetizantes podem se posicionar nas colunas 
de água, em resposta à intensidade luminosa, pela produção de 
vesículas de gás. Outras, apresentam magnetossomos, permitindo 
movimentações ao longo dos campos magnéticos da Terra. Um 
importante mecanismo na formação de comunidades corresponde à 
agregação ou aderência, que otimiza tanto as interações celulares 
como também as taxas de sedimentação dos organismos. 
As comunidades bacterianas têm importantes papéis na natureza, seja 
na produção e degradação de matéria orgânica, na degradação de 
poluentes, ou na reciclagem de nitrogênio, enxofre e vários metais. A 
maioria destes processos requer o esforço coletivo de organismos com 
diferentes capacidades metabólicas. Assim, os biofilmes participam 
metabolizando esgotos e águas contaminadas com petróleo, na 
nitrificação, na reciclagem de enxofre oriundo de drenados ácidos de 
minas (onde o pH é 0) e em vários outros processos. Outro tipo de 
biofilme está associado às partículas em suspensão, muitas vezes 
denominadas neve marinha, extremamente importante nas 
transformações biogeoquímicas do carbono em ambientes pelágicos, 
na metanogênese, fixação de nitrogênio e produção de enxofre. Estes 
achados revelam que nos biofilmes podem ser criadas condições de 
anaerobiose, em ambientes normalmente aeróbios. 
 
Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolônias centrais 
correspondem a organismos que geram e consomem hidrogênio. Os fermentadores 
utilizam açúcares e produzem ácidos orgânicos, utilizados pelos produtores de 
hidrogênio. Além das interações metabólicas, a comunicação intra e intercelular pode 
ser mediada por moléculas sinalizadoras. 
(Adaptado  de  Davey  &  O’Toole,  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.,  64:847-867, 2000) 
 
As interações que permitem a agregação de diferentes espécies, ou 
mesmo gêneros microbianos em um biofilme geralmente envolvem a 
participação de adesinas (moléculas de adesão presentes em fímbrias 
ou dispersar ao longo da superfície celular), que reconhcem receptores 
específicos na superfície de outras células, ou em diversos tipos de 
substratos. Assim, a figura abaixo esquematiza a formação de um 
biofilme aquático, revelando a complexidade tanto estruturalcomo 
temporal deste ecossistema. As horas correspondem ao tempo médio 
necessário à adesão dos diferentes microrganismos, revelando a 
dinâmica de formação e estruturação deste biofilme. 
 
Esquema de coagregações envolvendo bactérias aquáticas. 
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003) 
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Estrutura dos Biofilmes 
A maioria dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo 
conjuntos de agregados celulares distribuídos ao longo da matriz 
exopolissacarídica, que exibem densidades variáveis, originando 
aberturas e canais por onde a água pode trafegar. 
 
Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae. 
A intensidade da cor está associada à densidade celular. 
(Adaptado  de  Davey  &  O’Toole,  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.,  64:847-867, 2000) 
As microcolônias que compõem um biofilme podem ser de uma ou 
várias espécies, dependendo das condições ambientais. Por exemplo, 
em locais de grande stress mecanico, tais como a superfície dental, o 
biofilme é bastante compactado e estratificado. Os espaços intersticiais 
(canais) também são parte importante dos biofilme, pois permitem a 
circulação de nutrientes e a troca de metabólitos. 
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Por que formar um biofilme? 
Acredita-se que a formação de biofilmes esteja associada, por 
exemplo, à proteção contra o ambiente, ou seja, bactérias em um 
biofilme encontram-se abrigadas e em relativa homeostase, graças à 
presença da matriz exopolissacarídica. A matriz contém vários 
componentes: exopolissacarídeo, proteínas, ácidos nucléicos, entre 
outros. O exopolissacarídeo é secretado para o meio externo, sendo de 
diferentes composições. Ao que parece, o EPS tem diferentes 
estruturas e funções, dependendo das comunidades e/ou condições 
ambientais. Este polímero pode impedir fisicamente a penetração de 
agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles 
hidrofílicos e carregados positivamente. Em alguns casos o EPS é 
capaz de sequestrar cátions, metais e toxinas. Por estas razões, os 
biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de 
transferência de metais nos ecossistemas, pois vários organismos 
marinhos pastadores se alimentam de biofilmes. Foi também descrito 
que o EPS teria papel de proteção contra radiações UV, alterações de 
pH, choques osmóticos e dessecação. 
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Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica 
Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema 
circulatório primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabólitos, 
assim como a remoção de metabótilos potencialmente tóxicos. Em um 
biofilme, torna-se possível a cooperação metabólica. Por exemplo, a 
degradação de compostos orgânicos complexos, originando metano e 
CO2 durante uma digestão anaeróbia, requer pelo menos três grupos 
de organismos. As bactérias fermentativas iniciam o processo, gerando 
ácidos e álcoois, que são utilizados por bactérias acetogênicas. 
Finalmente, as metanogênicas convertem o acetato, CO2 e hidrogênio, 
produzindo metano. 
Os biofilmes são ambientes ideais para o desenvolvimento de relaçoes 
sintróficas, que é um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos 
metabolicamente distintos dependem um do outro para utilizarem 
certos substratos, na produção de energia. 
 
Sintrofia em um grânulo de lodo de um reator metanogênico. Corantes 
fluorescentes revelam organismos metanogênicos (em verde) e bactérias que 
oxidam propionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinação verde e 
vermelho, revelando microcolônias sintróficas interligadas a cadeias de 
metanogênicos. 
(Adaptado  de  Davey  &  O’Toole,  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.,  64:847-867, 2000) 
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Aquisição de novas características genéticas 
Várias bactérias possuem plasmídeos, conferindo as mais diversas 
características. Estes podem ser transferidos horizontalmente por 
conjugação, para diferentes espécies presentes em um bioflme. Estudo 
foram realizados com placas dentais artificiais, formadas inicialmente 
por bactérias do gênero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, 
contendo um transposon conjugativo albergando genes de resistência 
à tetraciclina, foi inserida no sistema e transferiu este transposon para 
células de Streptococcus. 
A transdução pode, teoricamente, ser responsável pela transferência 
horizontal de genes em biofilmes. Tal hipótese baseia-se no fato de 
sistemas marinhos e de água doce contêm uma enorme abundância de 
bacteriófagos (cerca de 108/ml), sendo responsáveis pela lise de um 
grande número de bactérias. Diariamente, de 10 a 20% da população 
bacteriana é lisada por fagos, os quais têm relevante impacto na 
cadeia alimentar microbiana uma vez que podem aumentar as taxas 
de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os 
níveis tróficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem 
estruturar ou restruturar comunidades microbianas. Em uma análise, 
onde uma população de cianobactérias foi praticamente exterminada 
pelos fagos, observou-se a presença de novas espécies capazes de 
degradas os compostos orgânicos que surgiram. 
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Papel dos biofilmes nas doenças 
Até o momento, a vasta maioria das doenças infecciosas vem sendo 
tratada eficientemente com antibióticos entretanto, de acordo com as 
pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratégia pode ser 
ineficaz em duas situações: 1) com organismos exibindo resistência 
inata à droga e 2) em bactérias presentes em biofilmes. Em um 
biofilme, as bactérias podem ser 1000 vezes mais resistente a um 
antibiótico, quando comparadas às mesmas células planctônicas, 
embora os mecanismos envolvidos nesta resistência sejam ainda 
pouco conhecidos. Dentre os possíveis mecanismos, acredita-se que 
possa haver a inativação da droga por polímeros ou enzimas 
extracelulares, ou a ineficiência da droga em decorrência de taxas de 
crescimento muito lentas no interior dos biofilmes. 
Infecções assciadas a biofilmes geralmente são de natureza 
recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais 
eliminam predominantemente as formas planctônicas, deixando as 
células sésseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme após o 
tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactérias 
presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o 
sistema imune do hospedeiro. 
Exemplos típicos de doenças associadas a biofilmes incluem as 
infecções de implantes tais como válvulas cardíacas, catéteres, lentes 
de contato, etc. 
Os biofilmes podem ainda promover doenças se formados em tecidos, 
tais como nas infecções pulmonares provocadas por Pseudomonas 
aeruginosa, em pacientes com fibrose cística, que são suscetíveis a 
infecções crônicas por esta bactéria. A periodontite é outro exemplo de 
doença provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado 
a esta doença, Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de 
superfícies orais direta ou indiretamente, sendo então capaz de invadir 
as células das mucosas e liberar toxinas. 
 
Biofilmes e resistência às drogas, devido à densidade e tipos celulares, exclusão 
física da droga, expressão de genes de resistência, quorum sensing e alterações da 
superfície celular 
(Adaptado  de  Mah  &  O’Toole,  Trends  Microbiol.,  9:34-39, 2001) 
 
 
Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental. 
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003) 
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Genética da formação dos biofilmes 
Quatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae, 
vêm sendo intensamente estudados, como modelos na formação de 
biofilmes de espécies únicas. Este processo pode ser subdivido em 
etapas: a) Aderência inicial à superfície, b) Formação das 
microcolônias, c) maturação das microcolônias em um biofilme 
contendo a matrizde EPS. 
 
Estudo microscópico da formação de um 
biofilme por V. cholerae 
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–2679, 
2000) 
 
Etapas que uma nova espécie 
bacteriana realiza, durante sua 
incorporação em um biofilme 
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–
2679, 2000) 
 
Ao que parece, o processo se inicia quando as bactérias percebem 
determinadas condições ambientais, que disparam o fenômeno de 
transição de células planctônicas em sésseis. Assim, Pseudomonas 
aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formar bioflmes 
sob quase todas as condições, enquanto E. coli somente os forma se 
estiver em meios mínimos suplementados com aminoácidos, ou em 
meios pobres em nutrientes. 
Diferentes vias genéticas podem ser utilizadas na formação de 
biofilmes. Por exemplo, V. cholerae parece ter diferentes vias para 
realizar a aderência inicial, dependendo da superfície. Assim, quando 
no intestino, este organismo utiliza a fímbria Tcp para realizar a 
colonização, embora tal estrutura não tenha papel na etapa inicial de 
formação de biofilmes em superfícies abióticas, sendo o processo 
mediado por um outro tipo de fímbria, denominada Msh. 
 
Início de formação do biofilme 
A partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi 
relatado que, quando as células não sintetizam flagelos, são incapazes 
de realizar as interações iniciais com as superfícies. Mutantes que não 
produzem a fímbria tipo IV (associada à movimentação das células em 
uma superfície) são capazes de se aderir formando uma monocamada, 
ao invés de microcolônias. Existem uma proteína, denominada Crc 
que, além de atuar regulando o metabolismo das células, também 
regula a expressão de dois genes que codificam proteínas importantes 
na montagem da fímbria tipo IV. O LPS da membrana externa também 
tem papel na adesão inicial. Em E. coli, os flagelos também são 
importantes nesta primeira etapa de formação do biofilme. Há ainda a 
participação de fímbrias do tipo I, uma proteína de membrana externa, 
Ag43 e do LPS. Em V. chloreae acredita-se que o processo seja 
bastante similar ao de E. coli. 
Maturação do biofilme 
Após a etapa de interações iniciais, começa a haver a formação das 
microcolônias, normalmente associada à produção de EPS. Outra etapa 
importante corresponde à organização da arquitetura do biofilme que, 
em P. aeruginosa parece ter a participação do "quorum sensing". 
 
Estágios iniciais na formação de biofilmes de Gram negativos (P. 
aeruginosa, E. coli, e V. cholerae). 
(A) Em P. aeruginosa, os flagelos são necessários para aproximar a bactéria da 
superfície, enquanto o LPS media as primeiras interações, havendo talvez a 
participação de proteínas da membrana externa. Quando formam monocamadas, 
fímbrias tipo IV mediam o movimento pulsante, necessário à formação de 
microcolônias. A produção destas fímbrias é regulada, em parte, por sinais 
nutricionais (Crc), havendo ainda a ativação de genes envolvidos na síntese de 
alginato e repressão de genes flagelares. A formação do biofilme maduro envolve a 
participação de homoserina lactonas sinalizadoras. (B) Em E. coli, os flagelos 
aproximam as células do substrato, enquanto as primeiras interações são mediadas 
por fímbris tipo I e a proteína de membrana externa Ag43. O EPS, ácido colânico é 
resonsável pela arquitetura do biofilme. (C) V. cholerae, também usa os flagelos na 
aproximação, sendo a ligação mediada por fímbrias MshA e talvez outras proteínas. 
(Adaptado  de  Davey  &  O’Toole,  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.,  64:847-867, 2000) 
 
Dispersão 
Em determinados momentos, os biofilmes sofrem dispersão, liberando 
microrganismos que podem vir a colonizar novos ambientes. Ós 
mecanismos genéticos associados à dispersão não são ainda bem 
conhecidos. 
Existem três tipos de processos de dispersão: expansiva, quando 
parte das células de uma microcolônia sofrem lise e outras retomam a 
motilidade, sendo então liberadas da estrutura. Outro tipo de 
dispersão envolve a fragmentação do biofilme, onde porções de 
matriz extracelular associadas a microrganismos são liberadas. 
Finalmente, o terceiro tipo de dispersão, denominada superficial, 
ocorre pelo crescimento do próprio biofilme como um todo. 
 
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Cynthia M. Kyaw