Aula1 Espectrometria de Massa

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Espectrometria de 
Massa
O que é Espectrometria de massa? 
(MS - mass spectrometry)
– É um método analítico usado para identificar os compostos diferentes
baseados na constituição atômica da amostra das moléculas e de seu
estado da carga, que permite a análise das “cortinas” de uma amostra
desconhecida sem nenhum conhecimento prévio de sua composição.
– Este tipo da potência analítica fez a esta técnica uma ferramenta
indispensável para aplicações qualitativas e quantitativas.
– Os avanços tecnológicos permitiram seu uso em estudar peptideos,
proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, drogas, e uma
infinidade de outras moléculas biológicas.
Princípios técnicos
– Moléculas em uma amostra são convertidas em íons em fase gasosa,
que são subsquentemente separados no espectrômetro de massas de
acordo com sua razão massa (m) sobre a carga (z), m/z.
– Espectro de massa: é um gráfico que mostra a abundância
(intensidade) relativa de cada íon que aparece como picos com m/z
definidos.
Usos
 Biotecnologia: na análise de proteínas, peptídeos e oligonucleotídeos,
monitoramento de fermentação;
 Agropecuária: Análise e controle de qualidade de rações;
 Farmacêutica: Descobertas de novas drogas, farmaco-cinética;
 Clínica: Análise da hemoglobina, teste de drogas;
 Ambiental: Qualidade de água, contaminação em alimentos;
 Geologia: Composição do petróleo, análise de solos;
 Esportes: Identificação de esteróides;
Medicina Forense: Investigação de crimes
Breve histórico
 1897: JJ Thomson  descoberta do elétron
 1907: Espectrômetro de massas rudimentar
 1919: Aston aprimorou o Espectrômetro de massas e descobriu 212 isótopos 
naturais
 1922: ganhou o prêmio Nobel de Química
 Década de 50: Hans G. Dehmelt e Wolfgang Paul desenvolveram o ion trap
não permitia análises de moléculas de alta massa molecular
 1960: MALDI e ESI- Hillenkamp e Fenn (Prêmio Nobel)
Prêmio Nobel de Química, 2002 – foi para os 
inventores de métodos de ionização branda em 
espectrometria de massa - permitiu análise de 
macromoléculas
Evolução
John B. Fenn (E.U.A.) -
Electrospray (ESI)
Koichi Tanaka (Japão) –
Soft Laser Desorption (SLD).
Como um espectrômetro de 
massa trabalha?
Razão m/z 
Ionização
 Íons podem ser produzidos a partir de uma molécula neutra pela
remoção ou adição de um elétron ou próton.
 As análises nos espectrômetros de massas podem ser feitas no modo
de análise de íons positivo ou negativo.
 2 tipos clássicos:
 Ionização por electrospray (ESI): envolve a produção de íons através da
formação de um spray da solução contendo o analito em um campo elétrico
possibilita a análise de biomoléculas grandes na sua forma intacta, como
proteínas e DNA
 MALDI (ionização/desorção a laser assistida por matriz): produz íons
protonados em fase gasosa pela excitação do analito que recebe energia
proveniente da absorção da energia do laser pelo componente presente na
matriz
MALDI 
(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
 Consiste na deposição de uma determinada amostra em uma matriz
capaz de fornecer prótons (ou H+) para o processo de ionização dos
componentes da amostra.
Quando esta matriz absorve a energia emitida por um laser, ocorre a
transferência de prótons da matriz para os componentes da amostra e ao
mesmo tempo desencadeia-se um processo de dessorção (processo em
que uma substância é liberada através de uma superfície)
possibilita a passagem da amostra do estado sólido para o gasoso
Os componentes da amostra ionizados e dessorvidos são direcionados
para o analisador TOF (time of flight), onde são acelerados através de um
campo elétrico dentro de um tubo a vácuo, até que atinja o detector.
Principais utilizações do 
MALDI-TOF
 Identificação de proteínas e peptídeos; 
 Identificação taxonômica de microorganismos
 Genotipagem e análise de polimorfismos no DNA
 Investigação de modificações pós-transcricionais no RNA
 MALDI-IMS (MALDI-based imaging mass spectrometry) -
descoberta de biomarcadores e permite que a expressão de
proteínas ou lipídios seja correlacionada com a histologia
Caracterização de biomarcadores específicos 
de proteínas para diagnóstico clínico
 Limite de detecção de
albumina na urina: ~5x10-
7mol/l
atinge os limites inferiores
da microalbuminúria - um
sinal de alerta para doenças
renais crônicas devido
principalmente ao diabetes,
hipertensão e aterosclerose
Interferências de drogas,
vitaminas, sangue etc 
falsos positivos ou negativos
 evitador por MALDI
Caracterização de biomarcadores específicos 
de proteínas para diagnóstico clínico
 Biomarcadores de proteínas específicas (Hb)  diagnóstico de sangue
oculto nas fezes
Limite de detecção 10x menor que os convencionais
 Biomarcadores de proteínas na saliva de pacientes com câncer bucal
 Além dos biomarcadores protéicos, pequenos metabólitos ainda
poderiam ser caracterizados por MALDI-TOF
trimetilamina (TMA) e N-óxido de trimetilamina (TMAO) na urina
foram detectados diagnostico de trimetilaminúria
Diagnosticar a doença através de perfis 
proteicos, peptídicos ou lipídicos
 Câncer de pulmão: a comparação
do padrão de íons lipídicos no
espectro de massa entre amostras
deve fornecer informações
diagnósticas abrangentes.
 Diferenças dos perfils peptídicos
em amostras de urina coletadas de
indivíduos saudáveis e pacientes
diabéticos, nefropáticos e
diabéticos  distinguir
rapidamente os grupos de
pacientes
Usos do MALDI-TOF nas 
análises microbiológicas
 A identificação de bactérias, fungos, micobactérias a partir de amostras clínicas
esteve baseada no exame macroscópico e microscópico de colônias e na
caracterização bioquímica dos microrganismos
 trabalhosos, de demorada incubação e de interpretação altamente subjetiva
 Microbiologia automatizada, o uso de plataformas modernas de identificação
microbiana, o sequenciamento do DNA e as reações de PCR contribuíram muito
para melhorias e progressos
 incidiram em custos, na necessidade de expertise técnico e na demanda pelo
desenvolvimento de técnicas avançadas de trabalho e análise de dados  limitaram o
uso das técnicas moleculares na rotina diária dos laboratórios.
 MALDI-TOF MS: identificação de microrganismos
 revolucionou e solucionou grande parte destes problemas no laboratório de
microbiologia clínica.
 Além disso, estão sendo desenvolvidos testes para esta plataforma que identificam
mecanismos de resistência e contribuem para o uso racional dos antimicrobianos.
Usos do MALDI-TOF nas 
análises microbiológicas
 A identificação de microrganismos por esta tecnologia é baseada na obtenção
dos perfis de proteínas de colônias e comparação com os dados de uma
biblioteca de referência derivada de um banco de amostras previamente
caracterizadas
A identificação é realizada em apenas alguns minutos, comparativamente aos
métodos demorados que eram aplicados na microbiologia até o momento
 Rapidez na Identificação direta de Hemoculturas
 foi aplicado no desenvolvimento de protocolos de identificação direta de frascos de
hemoculturas positivas.
 Permite a identificação do gênero e da espécie do microrganismo presente na amostra
 contribui essencialmente para o direcionamento precoce da escolha terapêutica
Usos do MALDI-TOF nas 
análises microbiológicas
 Identificação de Fungos de Importância Médica
 Dentre os fungos de importância médica podemos destacar as leveduras e os fungos
filamentosos cuja identificação da espécie sempre dependeu de métodos fenotípicos e
moleculares um tanto trabalhosos, demorados e muitas vezes inconclusivos.
 A identificação dos fungos pela técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF pode
ser considerada uma revolução na micologia, tendo desbancado a maioria dastécnicas
fenotípicas utilizadas para leveduras e ainda a técnica da micromorfologia para a
identificação dos fungos filamentosos, que exigia antes de tudo um período
prolongado para o crescimento dos organismos em laboratório.
Identificação de Micobactérias e Actinomicetos
 Através de rotinas específicas de lise e extração de proteínas nos protocolos da técnica
de MALDI-TOF, microrganismos do gênero Streptomyces, Actinomyces e Nocardia , cuja
parede celular possui algumas peculiaridades, podem ser identificados com mais de
95% de acurácia e em alguns minutos.
MALDI-IMS (Imaging Mass Spectrometry) 
 Obtenção de dados de
massas de peptídeos e
proteínas diretamente de
seções de tecidos biológicos.
 Vantagens em relação à
análise por imuno-
histoquímica: rapidez e
independência do uso de
anticorpos
 Detecção de marcadores
tumorais em inúmeros
estudos clínicos e pré-clínicos
para uma variedade de tipos
de tumores, dentre eles, para
o câncer de mama, próstata,
intestino, ovário, boca,
cérebro e linfomas.