AULA2-Replicacao DNA_2015

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Replicação da 
molécula de DNA 
Disciplina: Biologia Molecular 
Curso: Ciências Biológicas 
Profa. Dra. Nedenia Stafuzza 
 
 2015 
Relembrando... A Molécula de DNA 
Grupo fosfato 
Bases nitrogenadas 
1. Base nitrogenada + pentose: 
ligação covalente (N-glicosídica): OH + C1 da pentose 
2. Fosfato + pentose: 
ligação fosfodiéster: OH + C5 da pentose 
3. Nucleotídeo + nucleotídeo: 
- ligação fosfodiéster: OH do C3 da pentose do 1º nt + grupo 
fosfato ligado a OH do C5 da pentose do 2º nt 
 
 
 
-OH do C5 da primeira pentose livre; 
 
-OH do C3 da última pentose livre; 
Direção 5'→3’ 
anti-paralelas 
Dupla hélice: 2 fitas de DNA estão em orientação opostas 
(polaridade inversa) 
mecanismos especiais para a replicação do DNA 
-uma das fitas do DNA tem a direção da sua síntese (5'→3') 
-outra fita do DNA está invertida (3'→5') 
Com base na estrutura de dupla hélice do DNA e nas 
características da molécula (hidrofóbica), a estrutura do DNA 
apresenta a seguinte forma: 
1. Grupo fosfato + açúcar (parte hidrofílica): 
externamente na molécula; 
 
2. Bases nitrogenadas (parte hidrofóbica: 
internamente na molécula; 
 
3. Pareamento das bases (complementariedade): 
adenina com timina e citosina com guanina 
A/T 2 pontes de hidrogênio 
C/G 3 pontes de hidrogênio 
-deve ser preservado com o mínimo de alterações; 
-transmitido entre gerações intacto 
•DNA ocupa uma posição central como repositório das 
informações genéticas; 
•Sequências de nucleotídeos codificam todos RNAs e proteínas 
celulares; 
Armazenamento e transferência de informação 
Função do DNA 
DNA 
RNA 
Proteína 
replicação transcrição 
tradução 
Sobrevivência imediata do organismo: 
 estabilidade gênica 
Sobrevivência da espécie a longo prazo: 
 variabilidade (DNA sofre alterações = mutação) 
 
Replicação do DNA alta fidelidade = não perfeita 
 
 
Taxa de mutação: 1 nt alterado a cada 1010 nt (“revisão”) 
Tx constante entre organismos 
Mamíferos: genoma haplóide com 3x109 nucleotídeos 
Manutenção da Sequência de DNA 
Complicadores do Processo 
 Tamanho da molécula; 
 Compactação e ligação a outras proteínas; 
 Velocidade; 
 Simultaneidade; 
 Momento certo dentro do ciclo celular; 
 Fidelidade 
 
Replicação 
Novas fitas: -não são cópias das velhas (moldes) 
 -são complementares e não idênticas 
5’ AAGGCTGA 3’ 
3’ TTCCGACT 5’ 
5’ AAGGCTGA 3’ 
3’ TT CC GACT 5’ 
5’ AAGGCTGA 3’ 
3’ TTCCGACT 5’ 
Mecanismos de Replicação do DNA 
Replicação 
 
Replicação 
Replicaçã
o 
 Cada uma das fitas originais (velhas) atuam como molde para 
a formação da fita nova 
 As fitas novas não são cópias das velhas 
(moldes). São complementares e não idênticas 
5’ AAGGCTGA 3’ 
3’ TTCCGACT 5’ 
5’ AAGGCTGA 3’ 
3’ TT CC GACT 5’ 
5’ AAGGCTGA 3’ 
3’ TTCCGACT 5’ 
Processo Semiconservativo 
Modelos propostos para a replicação do DNA 
Semiconservativa 
(Watson e Crick) 
Conservativa 
Dispersiva 
Experimento de Meselson e Stahl (1958) 
N15 
(isótopo estável, não-radioativo) 
Matthew Meselson e Franklin Stahl 
1. Cultivaram E. coli em meio contendo N15 (isótopo pesado) ao invés 
de N14 (forma leve normal); 
2. Após muitas divisões celulares: DNA das bactérias com N15 
3. Bactérias removidas e colocadas em um meio com N14. Em F1 
obteve-se DNA de densidade intermediária 
4. F2: DNA de baixa e intermediária densidade 
 
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072437316/student_view0/chapter14/animations.html 
Se o modelo fosse: 
 Conservativo: nenhuma molécula híbrida (50% pesado / 
50% leve) 
 Dispersivo: mudança de leve para pesado em cada 
geração 
Replicação semiconservativa: cada dupla hélice filha contém 
1 filamento original + 1 recém-sintetizado. 
Mantém o padrão de herança ao longo das gerações 
Quando ocorre a replicação? 
replicação dos cromossomos 
ao mesmo tempo 
Se dá através da formação da 
forquilha de replicação  ponto 
no qual 2 filamentos de DNA se 
separam para permitir a replicação. 
Procariotos: 
replicação contínua (meio favorável) 
E. coli: replicação – divisão: 40 minutos 
 
Eucariotos: 120 min – levedura 
 24 horas – célula animal em cultura 
 29 horas – célula vegetal 
 100 a 200 horas em alguns tipos celulares 
-as fitas originais (velhas) atuam como molde na formação das fitas 
novas; 
-a região da replicação se move pela dupla hélice em forma de Y 
(região ativa de replicação) = forquilha de replicação 
ponto no qual 2 filamentos de DNA se separam para 
permitir a replicação de cada filamento. 
Como ocorre a síntese da nova fita do DNA? 
Se dá através da formação da forquilha de replicação  ponto no 
qual 2 filamentos de DNA se separam para permitir a replicação. 
 PROCARIOTOS 
Replicação em E. coli inicia-se num sítio específico do cromossomo, 
denominado origem de replicação, onde se forma a bolha de 
replicação que se expande bidirecionalmente via garfos de 
replicação (Y) até encontrar o ponto de término 
-origem de replicação em E. coli (ori-C): 245pb e apresenta 
sequências repetidas: 
•sequência 13 bp repetida em tandem (5x) ricas em A:T – facilita 
formação da bolha 
Procariotos: uma única origem de replicação 
Eucariotos: múltiplas origens de replicação 
Como ocorre a síntese da nova fita do DNA? 
Inicialmente acreditava-se que as 2 fitas de DNA tinham 
crescimento contínuo. 
 Contudo as fitas de DNA tem polaridades diferentes 
Seriam necessárias 2 enzimas diferentes (uma para cada fita). 
Porém só existe a DNA polimerase que realiza a síntese na 
direção 5’→3’. 
Nenhuma polimerase é capaz de sintetizar na direção 
3’→ 5’ 
Síntese de DNA semi-descontínua (5´ 3´) 
Como ocorre a síntese da nova fita do DNA? 
-fita sintetizada no sentido 5’3’ em direção ao movimento 
do garfo de replicação 
 
 
-fita complementar sintetizada também no sentido 5’3’ 
porém em direção oposta à do movimento do garfo de 
replicação 
fita líder (leading) 
crescimento contínuo 
fita lenta (lagging), 
implica em replicação descontínua 
com pequenos fragmentos 
Conclusão: forquilha de replicação é assimétrica 
Como ocorre o crescimento na fita 3’5’ do DNA? 
1960: experimentos com H3-timina em bactérias em divisão 
Resultado: existência de fragmentos descontínuos com 1000 a 
2000 bp marcados radioativamente = Fragmentos de Okasaki 
Fragmentos de Okasaki são unidos posteriormente pela enzima 
DNA ligase 
O DNA pode se replicar sozinho? 
Não. Um conjunto de enzimas participam do processo de 
replicação. 
Principais enzimas envolvidas no sistema de replicação 
da molécula de DNA 
 Helicases 
 Topoisomerases 
 Proteínas SSB 
 Primase (Primossomo) 
 DNA polimerase 
 Cinta deslizante (grampo β) 
 Ligase 
 Nucleases 
Replissomo 
 Quebram as pontes de hidrogênio entre as fitas de DNA dupla 
hélice e deselicoidizam o DNA. 
 Duas enzimas podem trabalhar em conjunto: uma na fita líder outra 
na lenta. 
 Necessitam da presença de ATP (energia) 
1. Helicase 
 
desfazem as torções do DNA (superelicoidização), resultantes do 
desenrolamento das fitas pelas helicases, para abrir os garfos de 
replicação (forquilhas) 
 DNA girase 
 
 
 
atuam separando moléculas de DNA-filhas em cromossomos 
circulares (procariotos) 
Topoisomerase II 
2. Topoisomerases Ligam-se fortemente à fita simples de DNA : 
 Auxiliam as helicases estabilizando a conformação distorcida da 
fita e retardando a formação do duplex (que podem impedir a 
síntese de DNA) 
3. Proteínas ligadoras de fita simples (SSB) 
 a enzima DNA polimerase não tem capacidade de iniciar a síntese 
na ausência de um iniciador 
 
 Primase: enzima central do primossomo (conjunto de proteínas 
responsáveis pela síntese de pequenas moléculas de RNA 
iniciadores: primers de RNA) 
• ~8 a 12 nucleotídeos 
• 3’OH para a DNA polimerase 
4. Primase 
Na fita líder: um iniciador na origem de 
replicação 
Na fita descontínua: um iniciador para 
cada fragmento de Okasaki 
Primer: fornece terminal 3’OH livre para 
adição de nucleotídeos durante a síntese 
(ponte fosfodiéster entre 3’-OH do primer e 
5’-fosfato do nucleotídeo livre) 
 
Molde: dita a sequência de bases a ser 
sintetizada 
 identificadas e purificadas pela primeira vez em 1957 por Arthur 
Kornberg (Nobel 1959) 
catalisam a reação de replicação 
 
 
Promovem o crescimento da cadeia na direção 5’→3’ 
ativa na presença de Mg2+ e DNA pré-existente (primer e molde) 
adição sequencial de desoxirribonucleotídeo 
à extremidade 3’-OH 
5. DNA polimerase 
Característica importante: além de adicionar nt, também 
reconhece erros de pareamento e os elimina através de reação 
exonucleásica. 
Tipos de DNA polimerases em Procariotos 
DNA polimerase I possui 3 atividades 
Polimerase 5’3’: catalisa o crescimento da cadeia 
 
 
 
 
Exonuclease 3’5’: remove bases pareadas erradas 
Há 5 DNA polimerases descritas em E. coli 
Exonuclease 5’3’: degrada DNA ou RNA fita simples 
-Remove os primers de RNA 
 
• embora participe da replicação do DNA, ela não é responsável pela 
maior parte da síntese, pois é muito lenta (~20nt/s) 
• remove os primers de RNA (atividade exonuclease 5’3’) e 
preenche os espaços (atividade polimerase 5’3’) 
•se dissocia do DNA após a incorporação de ~20 a 50 nt 
DNA polimerase II 
enzima de reparo: repara DNA danificado; 
 
DNA polimerase III 
atua na replicação com a Pol I. 
atividade polimerase 5’3’ (síntese de DNA) e exonuclease 3’5’ 
(remove bases erradas) 
velocidade de síntese: ~1.000 nt/s 
Tipos de DNA polimerases em Procariotos 
A DNA pol. permanece ligada ao DNA por uma cinta deslizante 
•DNA polimerase tende a se 
dissociar da fita de DNA 
•grampo β circunda o DNA como 
um donut e impede que a DNA 
polimerase III se dissocie 
•Transforma a DNA polimerase III 
de enzima distributiva (capaz de 
adicionar ~10 nucleotídeos) em 
uma enzima processiva (adiciona 
milhares de nucleotídeos) 
6. Cinta deslizante (grampo β) 
catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo 3’-OH 
e o 5’-P de nt adjacentes. 
7. DNA ligase 
EXONUCLEASES: 
clivam o DNA a partir do final da molécula 
 função “editar” – procuram por bases erradas 
 
ENDONUCLEASES: 
clivam em qualquer local da molécula 
8. Nucleases 
Detalhes do Replissomo: proteínas acessórias que atuam na forquilha 
de replicação 
alguns erros escapam da atividade de exonuclease da DNA 
polimerase I e III; 
sistema de reparo detecta potenciais distorções da hélice que 
resultam da interação incorreta de bases não complementares; 
detecta qual a fita que tem que ser corrigida (caso contrário 50% 
de erro ao corrigir a fita molde) 
 
 
Como sabe qual é a fita antiga (molde)?? 
Em bactérias: sequências metiladas 
Em humanos: conjunto de proteínas de verificação identificam a fita 
nova e eliminam erros 
Mecanismos de Reparo do DNA 
1.INICIAÇÃO 
origens de replicação e montagem do spliceossomo; 
 
2. ELONGAMENTO 
síntese das fitas líder e tardia envolvendo diversas 
proteínas; 
 
3.TERMINAÇÃO 
 -Procariotos: as duas forquilhas de replicação se encontram 
(DNA circular) – topoisomerase II 
-Eucariotos: seqüências de nucleotídeos específicas no final 
dos cromossomos, incorporadas a telômeros - telomerase 
Estágios da Replicação do DNA 
Particularidades dos eucariotos 
 Diferenças fundamentais: 
-estrutura nucleoproteica complexa; 
-molécula de DNA maior (150 x 106 vs 4,7 x 106); 
-cromossomos lineares 
 
 Soluções: 
-maquinário enzimático mais complexo; 
-múltiplas origens de replicação; 
-telômeros 
 
 
Sequências Teloméricas 
-sequências conservadas compostas de repetições ricas em TG 
 Ex. humanos: sequência de RNA 3’-AAUCCC-5’ atua como 
molde para a repetição no DNA de 5’-TTAGGG-3’ 
-telomerase (atividade polimerase) 
-ribonucleoproteína (RNA + proteína); 
-sintetiza 5’3’; 
-replicação independente: utiliza seu próprio RNA como molde 
(transcriptase reversa); 
não há perda das extremidades 
cromossômicas 
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Telomerase.html