Teste do D Fraco

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Oficina de Prática Laboratorial 
Aula Prática D Fraco
Assim como A acontece, o B pode ter a proteína em quantidades fracas. Se ele não tem a proteína ela é negativa (-). Os que são positivos (+) tem bastante proteínas, mas tem alguns indivíduos que tem pouca proteína, ele é positivo (+), mas no teste de placa não consegue detectar, por isso é faz o Teste D Fraco.
Os indivíduos que tem a proteína D no fator Rh em quantidades menores. Tem um outro fator relacionado a proteína D, ela tem 37 epítopos diferentes (é aparte em que o anticorpo detecta na reação). A sua detecção é muito alta.
Mas alguns tem os epítopos na camada externa, dentro da membrana impossibilitando sua detecção no teste da placa, assim, realiza o Teste do D Fraco. Em Banco de Sangue, realiza todos os testes para ter certeza do fator Rh.
Além da proteína D que o individuo pode não ter, ele pode ter outras proteínas do Sistema Rh, você pode ser um D negativo (-), mas o Rh positivo (+) para outra proteína. No Laboratório de Analises Clínicas remete Rh negativo (-), significa que é só o D, pra investigar se é um D parcial, o teste já é outro. 
Quando o indivíduo tem a proteína D em pequenas quantidades o teste que faz é o D Fraco, quando não tem a proteína D, realiza o teste do D Parcial para detectar se ele tem outras proteínas do Sistema Rh que não é a proteína D. Então tem dois exames para realizar o Rh negativo (-).
Geralmente quem é positivo (+) tem as outras proteínas do Sistema Rh e o D, quem é negativo precisa verificar a fundo.
As proteínas são as que utilizamos como marcador sanguíneo:
ABO (Tipagem Sanguínea) -> A/B: que tem A, B ou AB ou que não tem nenhuma que é o O;
Rh -> o sistema todo de proteína, que o mais comum é D.
Procedimento:
Três amostras no tubo de EDTA
Paciente 1/ Paciente 2/ Paciente 3
Tubo de vidro e identificar de 1/2/3
Fazer uma suspensão de diluição das hemácias
Misturar com salina e diluir bastante (se for positivo (+), tem maior chance de detectar, aumentando a sensibilidade do teste)
Tubo 1/2/3 -> diluir a amostra a 10%
microlitros de salina pra 100 microlitros de amostra
Homogeneizar bastante
Identificar 6 tubos
3 tubos Testes e 3 tubos Controles
Para verificar se a amostra Teste é negativo (-), ela tem que está igual ao Controle.
Reagente Anti-D -> é o anticorpo monoclonal contra a proteína D.
Reagente Controle -> é controle negativo (-), qualquer outra “coisa” que não vai aglutinar, só pra verificar a aglutinação própria da amostra se houver.
Nos tubos dos pacientes 1/2/3 adicionar 100 microlitros da amostra, a partir da diluição que fez (descartar o tubo do EDTA, não vai usar).
Nos tubos Teste colocar uma gota do Reagente Anti-D e nos tubos Controle colocar uma gota do Reagente Controle -> homogeneizar.
Colocar na centrifuga por 1 minuto a 1.000 rpm.
Depois, agitar delicadamente os tubos contra a luz, verificando se houve aglutinação ou não.
Meu grupo: não aglutinou – Rh negativo (-).
Como não aglutinou, incubar por 5 minutos em banho maria.
- Colocar tanto os tubos Testes e tubos Controles.
Questão de Prova: quando diluiu ele ficou com menos proteína disponível pra fazer a aglutinação, esse anticorpo monoclonal Anti-D, ele tem uma particularidade, ou seja, funciona melhor a 37°, mas no laboratório estava em 25°C, então é possível que não ocorreu aglutinação devido a temperatura e não por não ter proteína. Para garantir que não foi por isso, colocar em banho maria a 37°C só os que não aglutinaram.
Tendo menos hemácias disponível pra fazer ligação, então se der positivo (+) aumenta sensibilidade, no caso o indivíduo tem alguma quantidade da proteína, mesmo com poucas hemácias e consegui aglutinar ele é bem sensível, ou seja, aumentando a sensibilidade do Teste.
O anticorpo tem mais avidez (a força que ele se liga no epítopo) e afinidade é como ele consegue encontrar o epítopo.
Ele tem mais avidez quando ele está em 37°C, o anticorpo é uma estrutura proteica, então a 37°C ele consegue se liga no epítopo e ficar lá ligando e desligando de uma hemácia a outra (fica preso).
Se não tiver avidez, vai aglutinar por não conseguir fazer essa ligação nas hemácias (fica solto).
Aumenta a sensibilidade do Teste e não da ligação: o indivíduo é negativo (-), mas vai testar pra ver até o fim, se em algum teste demonstre o positivo (+), se aglutinar vai ter mais certeza da positividade (+), no caso ele é considerado positivo (+). O que aumenta a chance de ligação é a temperatura então.
Depois de retirar do banho maria, agitou delicadamente contraluz e verificou que nenhuma das amostras aglutinou.
Para aumentar ainda mais a sensibilidade, adicionar 500 microlitros de salina.
Levar para centrifuga por 1 minuto a 1.000 rpm.
Porque colocou mais salina? Esse procedimento se chama “Lavar as Hemácias”, lembre-se que no sangue não tem só hemácias, tem proteínas, íons e outras coisas.. Centrifugar pra que? como ela tem uma densidade maior ela vai para o fundo do tubo e o que ficar sobrenadante vai retira com a pipeta e deixar no fundo só o “botãozinho de hemácia”, ou seja, lavando as hemácias, retirar outros componentes e deixar somente ela no fundo, pois aumenta a sensibilidade e também para outras coisas não darem interferência na ligação.
Após retirar o sobrenadante, deixando apenas o “botãozinho de hemácia”, colocar duas gotas do Anti-IgG.
Homogeneizar e deixar descansar por 2 minutos
Utilizamos na reação o anticorpo anti imunoglobulina, então nesse momento se tiver D, o Anti-D que colocou no tubo estará grudado na proteína, mas ele não é suficiente pra fazer o aglomerado e com isso damos uma força para juntar as hemácias e coloca um anticorpo. Se ele estiver ligado a proteína D esse anticorpo vai se ligar no Anti-D e vai reforçar a reação de aglutinação.
Então o Anti-IgG é um anti imunoglobulina que vai se ligar no Anti-D que tá preso na proteína D da hemácia.
Observar o Teste com o Controle e verificar se aglutinou ou não.