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Via das pentoses-fosfato; Rui Fontes Página 1 de 5 Via das pentoses-fosfato 1- A via das pentoses-fosfato pode ser vista como um processo alternativo ou complementar à glicólise na oxidação da glicose. Nesta via, também designada de via do fosfogliconato ou de desvio (shunt) das hexoses monofosfato, o agente oxidante não é o NAD+ (como na glicólise) mas sim o NADP+ pelo que, neste caso, se forma NADPH. Pelo menos algumas das enzimas da via das pentoses-fosfato existem em todas as células do organismo e, em certos tecidos e células como o fígado, o tecido adiposo, a glândula mamária ativa, o córtex suprarrenal e os eritrócitos uma parte significativa da glicose é oxidada nesta via metabólica. 2- A ação sequenciada de 3 enzimas que catalisam reações fisiologicamente irreversíveis [desidrogénase da glicose-6-fosfato (ver Equação 1), hidrólase da 6-fosfogliconolactona (ver Equação 2) e desidrogénase do 6-fosfogliconato (ver Equação 3)] permite a formação da ribulose-5-fosfato (uma cetopentose-fosfato) que, numa reação fisiologicamente reversível catalisada pela isomérase das pentoses-fosfato, pode ser convertida em ribose-5-fosfato (uma aldopentose-fosfato; ver Equação 4). A Equação 5 é o somatório das reações referidas acima e descreve a ação sequenciada da chamada “fase irreversível da via das pentoses-fosfato” (Equações 1-3) e da reação catalisada pela isomérase das pentoses-fosfato (Equação 4). Na “fase irreversível da via das pentoses-fosfato”, para além da reação de hidrólise de uma lactona (ver Equação 2), ocorrem duas reações redox em que o oxidante é o NADP+, mas só a segunda pode ser designada de oxidação descarboxilativa: é na reação catalisada pela desidrogénase do 6-fosfogliconato que ocorre a descarboxilação com a consequente formação da primeira pentose-fosfato, a ribulose-5-fosfato (ver Equação 3) [1]. Equação 1 glicose-6-P + NADP+ → 6-fosfogliconolactona + NADPH Equação 2 6-fosfogliconolactona + H2O → 6-fosfogliconato Equação 3 6-fosfogliconato + NADP+ → ribulose-5-P + NADPH + CO2 Equação 4 ribulose-5-P ↔ ribose-5-P Equação 5 glicose-6-P + 2 NADP+ + H2O → ribose-5-P + 2 NADPH + CO2 3- Os produtos do processo descrito pela Equação 5 são a ribose-5-fosfato e o CO2 (que resultaram da oxidação da glicose-6-fosfato) e o NADPH (que resultou da redução do NADP+). A ribose-5-fosfato é um substrato de vias metabólicas que levam à formação de nucleotídeos e de ácidos nucleicos. O NADPH é o agente redutor (i) em reações de vias anabólicas como as de síntese de ácidos gordos, colesterol e hormonas esteroides, (ii) na manutenção do glutatião no estado reduzido (GSH), (iii) em reações de hidroxilação, quer de compostos endógenos, quer de xenobióticos (medicamentos e drogas) e (iv), nas células macrofágicas, em processos reativos que levam à morte de bactérias infetantes. Ao contrário do que acontece no caso do NAD+/NADH em que a concentração estacionária da forma oxidada é cerca de 1000 vezes superior à do NADH, no caso do NADPH/NADP+ a concentração estacionária da forma reduzida é cerca de 100 vezes superior à do NADP+. Uma razão [NADPH]/[NADP+] elevada ajuda a compreender que muitas das reações em que a coenzima envolvida é o par NADPH/NADP+ sejam termodinamicamente favorecidas no sentido em que ocorre o consumo de NADPH. 4- Nas situações em que a glicemia é elevada (como acontece normalmente durante o período absortivo) a síntese e a libertação de insulina nas células β dos ilhéus de Langerhans pancreáticos estão ativadas ao mesmo tempo que a síntese e a libertação de glicagina nas células α dos mesmos ilhéus está inibida. Estas duas hormonas têm no fígado efeitos antagónicos: a insulina estimula todos os processos em que se consome glicose e alguns dos processos anabólicos em que se consome (oxida) NADPH enquanto a glicagina estimula todos os processos metabólicos que levam à formação de glicose. A insulina e a própria glicose estimulam a oxidação da glicose aumentando a formação de acetil-CoA e, ao mesmo tempo, a atividade das enzimas “marca-passo” da via da síntese de ácidos gordos em que o substrato é a acetil-CoA e o NADPH é o agente redutor. A oxidação da acetil-CoA a CO2 no ciclo de Krebs é um processo cuja velocidade está dependente do consumo de ATP: quando a insulina está elevada e a formação de acetil-CoA é mais rápida que a sua oxidação uma parte da acetil-CoA formada pode ser desviada para a formação de ácidos gordos e, em última análise, para a formação de gordura. Neste processo de síntese, o ATP sofre hidrólise mas também se oxida o NADPH formado na via das pentoses-fosfato. A concentração de NADPH é demasiado pequena para poder sustentar os processos de Via das pentoses-fosfato; Rui Fontes Página 2 de 5 síntese se, a uma velocidade semelhante, não ocorresse a redução do NADP+ formado. A insulina estimula a via das pentoses-fosfato induzindo a síntese (transcrição dos genes) das desidrogénases da glicose-6-fosfato (ver Equação 1) e do 6-fosfogliconato (ver Equação 3) permitindo que a concentração de NADPH se mantenha estacionária. Um outro fator que controla o fluxo na via das pentoses-fosfato é a velocidade de consumo (oxidação) do NADPH. A desidrogénase da glicose-6-fosfato (ver Equação 1) é inibida pelo NADPH e, se a concentração de NADPH baixar na célula, esta desidrogénase fica ativada estimulando-se a via das pentoses-fosfato. Nalgumas células não sensíveis à insulina (como os eritrócitos) pode ser este o único mecanismo controlador do fluxo na via das pentoses-fosfato. 5- Quando, numa determinada situação metabólica, a síntese de ribose-5-fosfato excede o seu consumo na síntese de nucleotídeos, uma série de reações fisiologicamente reversíveis catalisadas por duas isomérases e duas transférases permite a conversão da ribose-5-fosfato em frutose-6-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato. Para melhor compreender o processo de conversão da ribose-5-fosfato em frutose-6-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato é útil admitir-se que partimos de 3 moléculas de ribose-5- fosfato (3×5C=15C) e que se formam duas moléculas de frutose-6-fosfato e uma de gliceraldeído-3- fosfato (2×6C + 3C = 15C). As isomérases envolvidas no processo são a isomérase das pentoses- fosfato (ver Equação 4) e a epimérase das pentoses-fosfato (ver Equação 6). A isomérase das pentoses-fosfato é a enzima que catalisou a formação da ribose-5-fosfato (a partir de ribulose-5-fosfato), mas também pode converter 2 das 3 moléculas de ribose-5-fosfato de que partimos em ribulose-5- fosfato. Por sua vez a epimérase pode converter as duas moléculas de ribulose-5-fosfato em xilulose-5- fosfato (uma cetopentose-fosfato). Nesta fase teríamos uma molécula de ribose-5-fosfato e duas de xilulose-5-fosfato. Por ação da transcetólase1 (ver Equação 7) uma molécula de ribose-5-fosfato reage com uma molécula de xilulose-5-fosfato; a transferência de uma unidade de 2 carbonos em que a xilulose-5-fosfato funciona como substrato dador leva à formação de uma molécula de sedoheptulose-7- fosfato (uma cetoheptose-fosfato) e outra de gliceraldeído-3-fosfato (aldotriose-fosfato). A transaldólase (ver Equação 8) vai fazer reagir entre si os produtos da reação anterior; neste caso é a sedoheptulose-7-fosfato que funciona como dador de uma unidade de 3 carbonos formando-se eritrose- 4-fosfato (uma aldotetrose-fosfato) e frutose-6-fosfato. Nesta fase, tendo partido de 3 moléculas de ribose-5-fosfato, temos uma molécula de frutose-6-fosfato, uma de eritrose-4-fosfato e uma outra de xilulose-5-fosfato que ainda não reagiu. A reação entre a xilulose-5-fosfato e a eritrose-4-fosfato também é catalisada pela transcetólase (ver Equação 9) permitindo a formação de mais uma molécula de frutose-6-fosfato e outra de gliceraldeído-3-fosfato. Todas estas reações são fisiologicamente reversíveis e as concentrações estacionárias de todas estas oses-fosfato mantêm-sepróximas das concentrações de equilíbrio. A Equação 10 descreve o somatório das transformações referidas acima; ou seja, a formação reversível de 2 moléculas de frutose-6-fosfato e 1 de gliceraldeído-3-fosfato a partir de 3 moléculas de ribose-5-fosfato (ver Equação 4 e Equações 6-9) [1]. Equação 6 ribulose-5-P ↔ xilulose-5-P Equação 7 xilulose-5-P + ribose-5-P ↔ sedoheptulose-7-P + gliceraldeído-3-P Equação 8 sedoheptulose-7-P + gliceraldeído-3-P ↔ eritrose-4-P + frutose-6-P Equação 9 xilulose-5-P + eritrose-4-P ↔ frutose-6-P + gliceraldeído-3-P Equação 10 3 ribose-5-P ↔ 2 frutose-6-P + gliceraldeído-3-P A frutose-6-fosfato e o gliceraldeído-3-fosfato formadas na “fase reversível da via das pentoses-fosfato” são intermediários da glicólise que, nas condições metabólicas em que a via das pentoses-fosfato está mais ativa no fígado (glicemia elevada, insulina elevada e glicagina baixa), também está ativada levando à formação de acetil-CoA, o substrato na síntese de ácidos gordos. 6- A ação sequenciada das enzimas das fases irreversível (Equação 11) e reversível (Equação 10 ou Equação 12) da via das pentoses-fosfato e de “enzimas da gliconeogénese” [isomérase das trioses- fosfato (Equação 13), aldólase (Equação 14), frutose-1,6-bisfosfátase (Equação 15) e isomérase das fosfohexoses (Equação 16)] pode permitir a oxidação completa da glicose-6-fosfato pelo NADP+ (Equação 17). 1 A transcetólase tem como grupo prostético a tiamina-pirofosfato que se forma a partir de tiamina (vitamina B1). Via das pentoses-fosfato; Rui Fontes Página 3 de 5 Equação 11 6 glicose-6-P +12 NADP+ + 6 H2O → 6 ribulose-5-P +12 NADPH + 6 CO2 Equação 12 6 ribulose-5-P ↔ 4 frutose-6-P + 2 gliceraldeído-3-P Equação 13 1 gliceraldeído-3-P ↔ 1 dihidroxiacetona-P Equação 14 1 gliceraldeído-3-P + 1 dihidroxiacetona-P ↔ frutose-1,6-bisfosfato Equação 15 frutose-1,6-bisfosfato + H2O → frutose-6-P + Pi Equação 16 5 frutose-6-P ↔ 5 glicose-6-P Equação 17 Somatório: glicose-6-P +12 NADP+ +7 H2O → 6 CO2 +12 NADPH + Pi Embora as condições metabólicas em que a via das pentoses-fosfato está mais ativa (glicemia elevada, insulina elevada e glicagina baixa) levem, no fígado, à inibição da enzima responsável pela reação 15 (a fosfátase da frutose-1,6-bisfosfato hepática; uma enzima da gliconeogénese) a velocidade dos processos cuja soma permite escrever a Equação 17 não é nula em nenhuma circunstância. A Equação 17 mostra que, quando 6 moléculas de glicose-6-fosfato são oxidadas na via das pentoses-fosfato (ver Equação 11 e Equação 12), se admitirmos o envolvimento de enzimas da gliconeogénese (ver Equação 13 a Equação 16), 5 moléculas de glicose-6-fosfato podem ser regeneradas; ou seja, em termos líquidos, uma molécula de glicose-6-fosfato é oxidada com a libertação concomitante de 6 moléculas de CO2. A possibilidade de este processo cíclico poder ocorrer permite compreender que algumas das moléculas de glicose que entram no fígado possam ser completamente oxidadas a CO2 sem a intervenção da desidrogénase do piruvato e das enzimas ciclo de Krebs e da fosforilação oxidativa. Evidentemente que a frutose-6-fosfato e o gliceraldeído-3-fosfato formados na via das pentoses-fosfato podem seguir na via glicolítica e acabarem oxidados a CO2 com a intervenção da desidrogénase do piruvato assim como das enzimas do ciclo de Krebs e da fosforilação oxidativa. Quando 3 moléculas de glicose (6C × 3 = 18C) são oxidadas na via das pentoses-fosfato podem formar-se 3 CO2 + 2 frutose-6- fosfato + 1 gliceraldeído-3-fosfato. Se as 2 moléculas de frutose-6-fosfato (6C × 2) e a de gliceraldeído- 3-fosfato (3C) formadas forem oxidadas na sequência glicólise-desidrogénase do piruvato-ciclo de Krebs significa que 3 das 18 moléculas de CO2 formadas no processo de oxidação das 3 moléculas de glicose (6C × 3) foram da responsabilidade da desidrogénase do 6-fosfogliconato. Isto é equivalente a afirmar que, se à conversão de glicose-6-fosfato em ribulose-5-fosfato se seguir a fase reversível da via das pentoses fosfato, a glicólise, a ação da desidrogénase do piruvato e o ciclo de Krebs, 1 dos carbonos da glicose-6-fosfato sai como CO2 aquando da ação da desidrogénase do 6-fosfogliconato e os 5 carbonos sobrantes saem como CO2 pela ação das desidrogénases do piruvato, do isocitrato e do α- cetoglutarato. 7- Em órgãos (como o músculo) em que as desidrogénases da glicose-6-fosfato e do 6-fosfogliconato são pouco ativas, a síntese de ribose-5-fosfato, um precursor na síntese dos nucleotídeos, pode ocorrer por ação exclusiva das enzimas da “fase reversível” da via das pentoses-fosfato atuando na frutose-6-fosfato e no gliceraldeído-3-fosfato (ver Equação 10). A frutose-6-fosfato e o gliceraldeído-3-fosfato podem formar-se na glicólise e estão (quase) em equilíbrio químico com a ribose-5-fosfato. Assim, o consumo de ribose-5-fosfato na síntese de nucleotídeos faz com as reações catalisadas pela transcetólase, transaldólase, isomérase das pentoses-fosfato e epimérase das pentoses-fosfato evoluam no sentido que leva à formação de ribose-5-fosfato e ao consumo de intermediários da glicólise. A frutose-6-fosfato e o gliceraldeído-3-fosfato são comuns à via das pentoses-fosfato e à glicólise e também, no fígado, existe equilíbrio químico entre os intermediários da glicólise e os intermediários (e produtos) da fase reversível da via das pentoses-fosfato. A xilulose-5-fosfato aumenta de concentração no citoplasma dos hepatócitos quando a glicemia aumenta e sinaliza, dentro dos hepatócitos, que há uma captação aumentada de glicose. Quando a xilulose-5-fosfato aumenta de concentração, ativa uma fosfátase de proteínas que catalisa a desfosforilação e a consequente ativação de um fator de transcrição conhecido pela sigla ChREBP (Carbohydrate response element binding protein; Proteína de ligação ao elemento de resposta aos carbohidratos) [2]. O ChREBP desfosforilado (ativo) aumenta a transcrição de genes envolvidos na conversão de glicose em ácidos gordos, um processo que consome NADPH. 8- Um dos papéis metabólicos do NADPH é o de manter o glutatião (tripeptídeo contendo resíduos de glutamato, cisteína e glicina) na sua forma reduzida (GSH; contém um grupo tiol). O glutatião intervém como redutor em processos reativos que serão descritos abaixo, e nessas reações, converte-se em Via das pentoses-fosfato; Rui Fontes Página 4 de 5 dissulfureto de glutatião (GSSG). O NADPH é o agente redutor (do dissulfureto do glutatião) numa reação catalisada pela redútase do glutatião onde o GSH é regenerado: Equação 18 NADPH + GSSG → 2 GSH + NADP+ 9- O GSH existe em altas concentrações nas células sendo o agente redutor em reações em que o H2O2, peróxidos lipídicos (LOOH) e o desidroascorbato (forma oxidada da vitamina C) são reduzidos a H2O, lipídeos hidroxilados (LOH) e ascorbato, respetivamente. A enzima que catalisa a redução dos peróxidos é a peroxídase do glutatião (Equação 19); a que catalisa a redução do desidroascorbato é a redútase do desidroascorbato (Equação 20). Equação 19 LOOH (ou H2O2) + 2 GSH → LOH (ou H2O) + GSSG + H2O Equação 20 Desidroascorbato + 2 GSH → ascorbato + GSSG Nas situações de stress oxidativo, os grupos tiol (R-SH) dos resíduos de cisteína de proteínas sofrem oxidação não enzímica formando-se ligações dissulfureto intra e interproteínas (proteína-S-S-proteína). Na redução destas ligações, o GSH é o agente redutor: a reação descrita pela Equação 21 é catalisada por uma oxiredútase (por tradição, frequentemente designada por tioltransférase) que repõe a situação original. Equação 21 proteína-S-S-proteína + 2 GSH → 2 proteína-SH + GSSG Para além de intervir como redutor nas reações catalisadas pela peroxídase do glutatião, pela redútase do desidroascorbato e pela tioltransférase,o glutatião também é redutor em reações não enzímicas podendo reduzir o ião superóxido (a H2O2) e radicais orgânicos. 10- Como se mostra nas Equações 19, 20 e 21, sempre que o glutatião intervém como redutor forma-se GSSG que é, de imediato, reduzido por ação catalítica da redútase do glutatião (ver Equação 18). O somatório da Equação 18 e Equação 19 permite compreender que o NADPH é o redutor último nos processos de redução dos peróxidos lipídicos e do H2O2 (Equação 22). Uma situação semelhante ocorre também nos casos do desidroascorbato e dos grupos dissulfureto das proteínas (ver Equação 23 e Equação 24). Equação 22 NADPH + LOOH (ou H2O2) → NADP+ + LOH (ou H2O) Equação 23 NADPH + desidroascorbato → NADP+ + ascorbato Equação 24 NADPH + proteína-S-S-proteína → NADP+ + 2 proteína-SH O ascorbato (forma reduzida da vitamina C) reduz o radical tocoferil (forma oxidada da vitamina E) a tocoferol que, por sua vez, reagindo com intermediários dos processos de formação de peróxidos lipídicos das membranas das células, limita a extensão destes processos. Os processos de oxidação de componentes lipídicos das membranas e de outras estruturas celulares como proteínas ou ácidos nucleicos podem lesar as células. 11- Os eritrócitos formam-se na medula óssea e cada eritrócito circula no sangue durante cerca de 3 meses; ao longo deste tempo vai “envelhecendo” até que sofre fagocitose pelos macrófagos. Os eritrócitos não têm núcleo e, ao contrário do que acontece nas outras células, as proteínas e os lipídeos que se alteram não podem ser ressintetizados. Nestas células o principal papel do NADPH é o de manter o glutatião no estado reduzido (GSH) limitando os danos causados às estruturas moleculares celulares pelas chamadas espécies reativas de oxigénio (ROS). São exemplos de espécies reativas de oxigénio o superóxido (O2•- ), o H2O2 e o radical hidroxilo (HO•). De todas estas substâncias a que se supõe ter um efeito direto mais agressivo é o radical hidroxilo mas, na sua origem, está quer o H2O2, quer o superóxido. Em situações de stress oxidativo – aumento da velocidade de síntese de ROS – as ROS levam à peroxidação de lipídeos das membranas e oxidação de proteínas. Mutações no gene (presente no cromossoma X) codificador da desidrogénase da glicose-6-fosfato (ver Equação 1) são responsáveis por uma doença genética muito frequente (cerca de 200 milhões de afetados no mundo) denominada favismo. Dependendo da mutação existem muitas variantes da doença, mas em todas as variantes existe um défice de NADPH e, consequentemente, défice da forma reduzida do glutatião. Isto torna os eritrócitos, nomeadamente os que estão há mais tempo em circulação, vulneráveis a situações de stress Via das pentoses-fosfato; Rui Fontes Página 5 de 5 oxidativo ocorrendo hemólise aguda aquando da ingestão de favas ou de determinados medicamentos, que, tal como um composto presente nas favas, têm efeitos oxidantes. O défice de desidrogénase da glicose-6-fosfato é mais frequente nos descendentes de indivíduos que viveram em zonas com alta incidência de malária2. 12- Em células macrofágicas como os polimorfonucleares neutrófilos, o NADPH tem um papel determinante na destruição das estruturas moleculares das bactérias infetantes. No decorrer do processo fagocítico, por ação da oxídase do NADPH, o NADPH reduz o oxigénio molecular a superóxido (Equação 25) que, por sua vez, está na origem de outras ROS que se supõe participarem no processo de destruição das bactérias. Equação 25 NADPH + 2 O2 → NADP+ + 2 O2•- + H+ O superóxido pode sofrer dismutação enzímica (dismútase do superóxido) ou não enzímica e levar à formação de H2O2 (Equação 26) e também pode reduzir e cindir o H2O2 com formação do radical hidroxilo (reação de Haber-Weiss catalisada por iões de ferro ou de cobre; Equação 27). O radical hidroxilo é dificilmente detetável porque é muito reativo iniciando cadeias de reações de oxidação (e peroxidação). Equação 26 O2•- + O2•- + 2 H+ → H2O2 + O2 Equação 27 O2•- + H2O2 → O2 + HO- + HO• 1. Sillero, A., Selivanov, V. A. & Cascante, M. (2006) Pentose phosphate and calvin cycles: Similarities and three-dimensional views*, Biochem Mol Biol Educ. 34, 275-7. 2. Kabashima, T., Kawaguchi, T., Wadzinski, B. E. & Uyeda, K. (2003) Xylulose 5-phosphate mediates glucose-induced lipogenesis by xylulose 5-phosphate-activated protein phosphatase in rat liver, Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5107-12. 2 A razão desta associação é a proteção que o défice da enzima (mesmo relativo no caso das mulheres heterozigóticas) confere relativamente ao agente da malária. Este agente (Plasmodium falciparum) vive dentro dos eritrócitos dos indivíduos afetados de malária mas a sua capacidade de sobrevivência fica reduzida quando o stress oxidativo dos eritrócitos (aumentado se houver défice de desidrogénase da glicose-6-fosfato) faz com que o tempo de circulação dos eritrócitos no sangue fique encurtado.
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