Extracao e purificacao de acidos nucleicos

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Introdução 
Os ácidos nucleicos são macromoléculas formadas por unidades monoméricas menores conhecidas como nucleotídeos. Cada nucleotídeo, por sua vez, é formado por três partes: um açúcar do grupo das pentoses (monossacarídeos com cinco átomos de carbono); um radical fosfato, derivado da molécula do ácido ortofosfórico (H3PO4), uma base orgânica nitrogenada. Ocorrem em todas as células vivas e são responsáveis pelo armazenamento e transmissão da informação genética e por sua tradução que é expressa pela síntese precisa das proteínas. Presentes no núcleo dos eucariotos e dispersos no hialoplasma dos procariotos, os ácidos nucléicos podem ser de dois tipos: ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA),O DNA se diferencia do RNA por possuir o açúcar desoxirribose e os nucleotídeos adenina, citosina, guanina e timina. No RNA, o açúcar é a ribose e os nucleotídeos são adenina, citosina, guanina e uracila (a uracila entra no lugar da timina). Para o isolamento dos ácidos nucléicos é preciso libera-los das células por destruição de membranas celulares e dissociá-los do complexo DNA-proteína, por desnaturação proteica. Os ácidos nucléicos são, em seguida, precipitados com ácido tricloroacético (TCA) a 20%, juntamente com as proteínas e, posteriormente, extraídos com TCA a 5% a quente. O DNA é detectado pela reação de difenilamina para 2-desoxirribose, enquanto o RNA é determinado pela reação do orcinol para a ribose.
Objetivos
Identificar a presença dos ácidos nucleicos (RNA e DNA).
Materiais Utilizados
Vidrarias e outros utensílios
Tubos de Ensaio
Gral e pistilo
Tubos de centrifuga
Béquer
Bastão de vidro
Pipeta de Pasteur
Centrífuga de balcão
Balança analítica
Reagentes
Água destilada
Fermento Biológico
Éter etílico
Ácido tricloroacético (TCA) a 20% e 5%
Reativo de difenilamina
Reativo de orcinol
Parte Experimental
Procedimentos
Procedimento 1: Preparo do Homogeneizado
Em um gral foi colocado 2g de fermento, 2ml de éter etílico e depois foi adicionado um pouco de água para, com o auxílio do pistilo, amassar bem o fermento biológico e formar o homogeneizado.
Procedimento 2: Extração de Ácidos Nucléicos
Foi pego o homogeneizado do tubo aça e colocou-se no tubo de falcon, juntamente com 1ml de TCA 20% (Ácido Tricloroacético), misturou-se e deixou-se o tubo em repouso por 10 minutos. Após deixar o tubo falcon repousar, o mesmo foi colocado durante 5 minutos na centrífuga numa rotação de 5000 rpm (rotações por minuto). Depois de passar por esse procedimento foi formado o sobrenadante que foi descartado e o precipitado. No precipitado que foi formado dentro do tubo falcon, foi adicionado 3ml de TCA 5% e mexeu-se a mistura com o auxílio do bastão de vidro. O próximo passo foi tranferir o precipitado para um tubo de ensaio maior para ser colocado em banho maria com água fervente por 5 minutos numa rotação de 2400 rpm. Forma-se novamente outro precipitado, que é descartado, e o sobrenadante é colocado em outro tubo de ensaio.
Procedimento 3: Identificação dos Ácidos Nucléicos
De início foram enumerados 2 tubos de ensaio; no primeiro (tubo de controle negativo) foram adicionados 1ml de água mais 1ml de difenilamina, já no segundo foram colocados 1ml de extrato mais 1ml do reativo de difenilamina. Na segunda parte do procedimento 3, foram numerados 3 tubos de ensaio. No primeiro, que é o tubo de controle negativo, foram adicionados 1ml de água juntamente com o reativo de orcinol (ou de Bial); no segundo foram adicionados 1ml de extrato mais 1ml de orcinol e no terceiro e último foram adicionados 1ml padrão (xilose) mais 1ml de reagente de Bial. Sucessivamente desse procedimento, todos foram colocados em banho maria num período de 10 minutos.
Resultados e discussões
Procedimento 1: Como já é de conhecimento, para a separação de ácidos nucleicos se faz necessário tirá-lo de dentro das células, e, isso só é possível através do rompimento das membranas celulares e dissocia-los do complexo DNA proteína, por meio da desnaturação proteica. É pelo motivo citado que foi adicionado 5 ml de éter no primeiro procedimento.
Procedimento 2: Após ter feito o homogeneizado no experimento anterior, foi adicionado também TCA 20%, que tem como função precipitar proteínas, para que fossem separados o sobrenadante, que são lipídeos e carboidratos (que foram descartados, pois o objetivo era o DNA) e o precipitado, que era DNA mais proteína. Foi colocado o precipitado dentro do tubo falcon juntamente com 3ml de TCA 5% (mais fraco para que continue havendo a precipitação de proteínas) e colocou-se o mesmo na centrífuga. O processo de centrifugação acelera a separação de uma ostra fluida a fim de promover a separação dos componentes via sedimentação dos líquidos pela diferença e densidade. Após isso, foram separados em 2 partes o precipitado anterior: o sobrenadante que é o DNA e o precipitado que era proteína (que foi descartado por não haver interesse no mesmo, e sim, no DNA). Em seguida o sobrenadante foi colocado em banho maria por 5 minutos para que houvesse a desnaturação da proteína e o DNA, e , assim, liberar a pentose e romper a ligação fosfodiester e peptídicas, que, como são ligávamos covalentes (ligações forte e difíceis de serem rompidas tem que ser expostas a alta temperatura). Imediatamente foi colocado novamente na centrífuga para que haja novamente a precipitação de proteínas, em consequência de ter adicionado TCA  5% e DNA solubilidade, logo, foi descartado o precipitado, pois o material de análise desejado é o DNA, por isso o mesmo é preservado.
Procedimento 3: O reativo  de difenilamina tem a função de detectar DNA, então, assim sendo o teste foi positivo no tubo 2 (que continha extrato mais difenilamina) que ficou azul, e, como no tubo 1 não havia nada de DNA não ocorreu reação. Na segunda parte desse procedimento, foi utilizado o Teste de Bial que permite identificar o RNA, através da presença de ribose. Esse teste, se baseia na reação colorida específica para identificação das pentoses. Dessa forma, o teste foi positivo para os tubos 2, que ficou na cor verde e no tubo 3 que içou com coloração verde claro.
Conclusão
No geral, toda extração de ácidos nucleicos, por exemplo, se baseia em quatro etapas básicas, presentes em qualquer protocolo de extração; lise das membranas lipídicas, purificação, precipitação e reidratação. Existem diferentes protocolos de extração de DNA e RNA que variam em função da espécie e do tecido a ser utilizado, mas, para isolar os ácidos nucleicos é preciso sempre libera-los das células e dissocia-los do complexo DNA-proteína; e em seguida precipita-los com TCA a 20%, juntamente com as proteínas, e, posteriormente, extrai-los com TCA a 5% a quente. A maneira de coletar e acondicionar o tecido, assim como o estado do mesmo é fundamental para o sucesso da extração. Um dos aspectos importantes é que a quantidade de DNA ou RNA necessária varia em função da técnica molecular a ser utilizada. 
Referências Bibliográficas
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAgSt4AK/relatorio-bioquimica-ii-1-1
http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_tricloroac%C3%A9tico
https://www.passeidireto.com/arquivo/1788798/apostila-de-bioquimica---pratica/5
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/AcNucleico.php 
http://vivendociencias.blogspot.com.br/2010/10/principais-diferencas-entre-dna-e-rna.html?m=1 http://educacao.umcomo.com.br/articulo/qual-a-diferenca-entre-dna-e-rna-10879.html
Práticas de Bioquimica,UFV. 2007
Atividades Propostas
1) Em qual local nas células são encontrados ácidos nucléicos? 
Os ácidos nucléicos são encontrados nos organismos procariontes, dispersos no citoplasma, constituindo o nucleotídeo e nos seres eucariontes encontra-se no núcleo (também ocorre nas mitocôndrias e cloroplastos) 
2) Dê a função biológica dos vários tipos de ácidos nucléicos. 
Os ácidos nucléicos são o DNA e o RNA. Os dois são formados por nucleotídeos. O DNA possuia função de guardar a informação genética dos organismos. A sequência lógica de nucleotídeos forma o gene. O conjunto de sequencias genéticas de um organismo forma o seu genoma. O RNA é formado a partir do DNA, pela complementariedade das bases nitrogenadas, e ele leva a informação de um gene até os ribossomos para que sejam produzidas as proteínas- síntese proteica.
3) Explique as reações que ocorrem com o DNA e RNA e os reativos da difenilamina e do orcinol, respectivamente.
A reação do orcinol (reativo de Bial) permite identificar o RNA, através da ribose presente. Ele reage com a solução de orcinol na presença de FeCl3 e aquecimento formando um complexo amarelo por ligação a ribose (teste de Bial identifica pentoses) o que permite sua detecção.
A reação com a difenilamina é utilizada para identificar e determinar quantativamente o DNA. O DNA em meio ácido é hidrolizado libertando desoxirribose, e esta, através do seu grupamento CHO livre, reage com a difenilamina em aquecimento, com formação de composto de cor azul (teste de dicshe- identifica desoxirribose). 
4) Qual a função do TCA no processo de extração?
Precipitação de macromoléculas tal como proteínas, DNA e RNA.