Tecnologia do DNA recombinante produção de biofármacos

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Tecnologia do DNA recombinante -
produção de biofármacos
Fabricio Fernandes
Introdução
• A dupla hélice: Francis Crick e James Watson (1953).
– Nobel em 1962
Introdução
• Dogma central da genética molecular.
Introdução
Tecnologia do DNA recombinante (década de 70...)
• Tecnologia do DNA consiste nas técnicas coletivas para obtenção,
amplificação e manipulação de fragmentos específicos de DNA.
• A engenharia genética, a aplicação da tecnologia do DNA a problemas
biológicos, médicos ou agrícolas específicos, é agora um ramo bem
estabelecido da tecnologia.
• O termo DNA recombinante geralmente é reservado para as moléculas
produzidas pela junção artificial de DNA obtido de diferentes fontes
biológicas.
Introdução
Tecnologia do DNA recombinante (década de 70...)
• Aplicações:
Estudos 
Estrutura/Função
Vacinas
Agentes 
Terapêuticos 
Diagnóstico 
Laboratorial 
Melhoramento 
Vegetal/Animal
Terapia Gênica
Introdução
Metodologia básica DNA recombinante
1. O DNA a ser clonado é purificado de células ou tecidos.
2. São usadas proteínas chamadas enzimas de restrição para gerar os
fragmentos específicos de DNA (gene alvo/inserto).
3. Os fragmentos produzidos pelas enzimas de restrição são unidos a outras
moléculas de DNA que servem como vetores, ou moléculas transportadoras.
4. A molécula de DNA recombinante é transferida para uma célula hospedeira.
5. Quando as células hospedeiras se replicam, as moléculas de DNA recombinante
que se encontram em seu interior são transmitidas a toda a sua prole (clonagem
gênica).
6. O DNA clonado pode ser recuperado das células hospedeiras, purificado e
analisado.
7. O DNA clonado, então, pode ser transcrito e traduzido.
Introdução
• Quais técnicas estão envolvidas na metodologia do DNA recombinante?
Clonagem gênica
• Um modo de se obter numerosas cópias de um fragmento específico de
DNA é colocá-lo em uma bactéria e deixar que ela replique esse fragmento.
Esse processo é chamado de clonagem gênica, porque são produzidas
cópias idênticas (clones) do trecho original do DNA alvo.
• Para que clonar genes ou fragmentos de DNA?
– Realização de estudos nas mais variadas áreas da genética: genômica,
transcriptômica e proteômica.
Clonagem gênica
Considerações no desenvolvimento de uma estratégia de clonagem:
– O gene e a proteína que ele codifica é conhecido?
– Qual o tamanho do gene?
– Tipo do vetor.
– Tipo de organismo que o gene será clonado.
– Como será realizada a transferência do vetor recombinante para o organismo
hospedeiro.
– Como será feita a identificação das células (organismos) que receberam o vetor
recombinante.
Clonagem gênica
Enzimas de restrição
• Se liga ao DNA e reconhece uma sequência nucleotídica específica,
denominada sequência de reconhecimento ou sítio de restrição.
• A maioria dos sítios de restrição exibe uma forma de simetria descrita como
palíndromo, o que significa que ambos os filamentos têm a mesma
sequência de nucleotídeos, porém em sentido oposto.
• Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição é que elas
produzem “extremidades coesivas”.
Clonagem gênica
Nomenclatura das enzimas de restrição
Primeira letra maiúscula = gênero
Segunda e terceira letras = espécie
Letra adicional = cepa da bactéria
Número em algarismo romano = número da enzima descoberta
• Ex.: a enzima EcoRI foi descoberta em Escherichia coli, cêpa RY13, e foi a
primeira enzima de restrição identificada naquela espécie (por isto a
designação I).
Clonagem gênica
Enzimas de restrição
Animação
Clonagem gênica
Vetores de clonagem:
– Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA estável, replicante, à qual um
fragmento de DNA pode ser ligado para introdução em uma célula.
• Tipos:
– Plasmídeos (insertos até 15 Kpb).
– Fagemídeos (insertos até 23 Kpb).
– Cosmídeos (insertos até 44 Kpb).
– BAC / Bacterial Artificial Chromosome (insertos até 300 Kpb).
– YAC / Yeast Artificial Chromosome (insertos até 2 Mpb).
– HAC / Human Artificial Chromosome (insertos até 10Mpb ).
• A escolha é feita considerando as questões técnicas e financeiras.
Clonagem gênica
Os plasmídeos atendem à maioria das necessidades.
Clonagem gênica
Célula hospedeira: Escherichia coli.
Escherichia coli
Microbiologia
Genética
Bioquímica
Clonagem gênica
Vantagens de se utilizar E. coli :
• Pouca exigência nutricional:
– Sais, proteínas e açúcares.
• Replicação rápida:
– 20 minutos/geração.
• Métodos eficientes, fáceis e de baixo custo:
– Transformação e extração de plasmídeos.
• Diversos plasmídeos para clonagem.
Clonagem gênica
Metodologia:
Clonagem gênica
Inserto (gene de interesse/fragmento de DNA):
• Como isolá-lo?
– Enzimas de restrição
– PCR
• Há sítios de restrição no inserto que poderão ser utilizados na clonagem?
– Sim, ok!
– Não! Faça o uso da PCR utilizando oligonucleotídeos (primers/iniciadores) com
sítios de restrição artificial.
Clonagem gênica
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):
Clonagem gênica
(a) Digestão enzimática do
vetor e do inserto:
Reação ideal 37 ºC.
Entre 2 e 16h (depende quantidade
DNA).
(b) Ligação vetor/inserto
Reação ideal entre 4 e 16 ºC.
16h (DNA Ligase convencional).
Obs.: condições de acordo com fabricante.
Clonagem gênica
• Cálculo para estimar a quantidade de DNA (inserto) a ser utilizado em uma
reação de ligação.
50 ng vetor X PM inserto (Kb)
PM vetor (Kb)
X (ng) = 1:1 3:1 10:1
Clonagem gênica
Transformação bacteriana:
Animação
Clonagem gênica
Seleção dos clones positivos
• O clone positivo pode ser
selecionado por genes marcadores
que revelam sua presença nas
células hospedeiras.
• Exemplos:
– Gene LacZ degrada uma substância
X-Gal dando uma coloração azul a
colônia.
– Genes de resistência à antibióticos.
Clonagem gênica
Seleção dos clones positivos por coloração
Clonagem gênica
Seleção dos clones positivos
– Apenas resistência a antibiótico: realiza-se PCR de colônias.
Clonagem gênica
Sequenciamento
Expressão gênica
• Em termos genéticos, expressão significa, da forma mais simples, a
manifestação da informação genética, seja de um único gene ou de todo
um conjunto deles; o que por sua vez resulta em proteínas as quais
juntamente com o ambiente nos fornecem o fenótipo.
• A maioria das técnicas, vistas anteriormente, para se clonar genes ou
fragmentos de DNA são válidas tanto para a clonagem gênica quanto para
expressão. Entretanto há detalhes que devem ser considerados...
Em termos gerais... Há clonagem sem expressão, mas não há 
expressão sem clonagem. 
Expressão gênica
Célula hospedeira
Procariotos Eucariotos
Vantagens
Conhecimento Baixa toxicidade
Fácil cultivo Fácil cultivo
Controle da expressão Estrutura protéica
Sistemas de purificação Função protéica
Sistemas de endereçamento Sistemas de purificação
Produção larga escala
Desvantagens
Estrutura e função protéica Sistemas de expressão
Corpúsculo de inclusão Produção larga escala
Endotoxinas (LPS) Custo
Expressão gênica
• Sistema de expressão: é composto por diversos elementos que funcionam
em conjunto e assim propiciam alcançar os objetivos.
– Vetores:
• Promotores e operadores
• RBS
• Terminadores
• Sequencias de endereçamento
• Sequencias de purificação
– Células:
• Sistemas de recombinação
• Codon usage
Expressão gênica
Sistema de expressão: vetores
Expressão gênica
Sistema de expressão: vetores
• Promotores:
– Quanto mais consensual melhor: maiores níveis de expressão.
Expressãogênica
Sistema de expressão: vetores
• Operador:
– Sistemas de indução: controle da expressão gênica.
Expressão gênica
Sistema de expressão: vetores
• RBS (Ribosome Binding Site / Shine-Dalgarno):
– Quanto mais consensual melhor: maior a eficiência da tradução.
Expressão gênica
Sistema de expressão: vetores
• Terminadores (formam hairpin)
Expressão gênica
Sistema de expressão: vetores
• Sequências de purificação (ex.: 6-His):
– Colunas cromatográficas: facilitam a purificação
Expressão gênica
Sistema de expressão: Codon Usage
• Organismos diferentes:
– Códons preferenciais: baixa expressão.
• Soluções:
– Alterar a sequência: síntese gênica.
– Linhagens alternativas.
Expressão gênica
Sistema de expressão: Vetor pET
Expressão gênica
Sistema de expressão: E. coli + pET
– E. coli linhagem BL-21
Purificação de proteínas recombinantes
Passos iniciais para purificação
– Extração
• Lise celular: química; enzimática; mecânica.
• Fracionamento proteico: centrifugação; filtração.
• Concentração: precipitação química.
– Análise
• SDS-PAGE.
• Western-Blot.
• Espectrometria de massa.
– Purificação
• Cromatografia: colunas filtração, afinidade...
Purificação de proteínas recombinantes
Esquema geral
Purificação de proteínas recombinantes
SDS-PAGE
– A eletroforese é uma técnica baseada na separação de macromoléculas por aplicação de um
campo elétrico. Quando um campo elétrico é aplicado a uma solução de proteínas, estas
moléculas migram numa direção e com uma velocidade que refletem a sua dimensão
(massa molecular) e carga global.
– A separação de proteínas tornou-se possível com o desenvolvimento da eletroforese em gel
de poliacrilamida ou PAGE (de PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) em que às amostras a
separar é adicionado o detergente SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). O detergente SDS é usado
para desnaturar proteínas com várias subunidades e para cobrir as moléculas da proteína
com cargas negativas. Deste modo, a carga intrínseca da proteína é mascarada, e a razão
carga/massa torna-se constante. Assim, as proteínas são separadas em função do seu
tamanho, tal como no caso das moléculas de DNA na eletroforese de ácidos nucléicos, em
que as amostras aplicadas no gel migram no sentido do eletrodo positivo.
Purificação de proteínas recombinantes
SDS-PAGE
Purificação de proteínas recombinantes
Análise da expressão por SDS-PAGE
Purificação de proteínas recombinantes
O problema:
– Um dos maiores problemas encontrados durante o procedimento de extração
proteica diz respeito aos “corpúsculos de inclusão”.
– Não é possível predizer quais proteínas podem formar corpúsculos de inclusão.
Purificação de proteínas recombinantes
SDS-PAGE / Western Blot
– A imunodetecção (também denominada “immunoblot”) é uma técnica que possibilita
reconhecer e quantificar antígenos a partir de um gel de eletroforese, geralmente SDS-
PAGE.
– Transferência para membrana: o gel de eletroforese é um meio pouco apropriado para a
imunodetecção, isto é, não é um bom suporte para as ligações antígeno/anticorpo. Assim
sendo, utiliza-se membranas constituídas geralmente de papel, isto é, de celulose, alteradas
quimicamente. Como exemplo, pode-se citar a nitrocelulose, que possui grupos nitro ligados
à celulose produzindo desta forma um suporte com alta afinidade por proteínas, fazendo
com que estas permaneçam presas a sua superfície. Para transferir o antígeno do gel de
eletroforese para a membrana utiliza-se um campo elétrico (mesmo princípio da
eletroforese). Neste método, coloca-se a membrana sobre o ânodo (+) coberto por vários
papeis filtro e em seguida o gel, que entrará em contato com o cátodo (-), também através
de papéis filtro, fazendo com que as proteínas, ainda embebidas em SDS (-), possam migrar
para o ânodo.
Purificação de proteínas recombinantes
SDS-PAGE / Western Blot
Purificação de proteínas recombinantes
Western Blot
Purificação de proteínas recombinantes
• Como purificar sua proteína?
• Colunas cromatográficas:
– De acordo com a matriz, proteínas podem
ser separadas por:
• Carga.
• Tamanho.
• Sua capacidade de se ligar a um grupo
químico específico.
Purificação de proteínas recombinantes
Cromatografia de troca iônica:
Purificação de proteínas recombinantes
Cromatografia de filtração:
Purificação de proteínas recombinantes
Cromatografia de afinidade:
Purificação de proteínas recombinantes
Cromatografia de afinidade:
Purificação de proteínas recombinantes
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