Aula 04 ENGENHARIA GENÉTICA E DNA RECOMBINANTE Expressão de proteínas recombinantes em bactérias e Bibliotecas de DNA e cDNA

Prévia do material em texto

ENGENHARIA GENÉTICA E DNA RECOMBINANTE
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM BACTÉRIAS E BIBLIOTECAS DE DNA E cDNA
Profa. Dra. Sabrina Maria Rodrigues Jacinto Costa
Bibliotecas de DNA
Separação física de CADA gene no genoma para depois SELECIONAR os fragmentos desejados para estudo.
Criação das bibliotecas de DNA
adquirida pelo processo de clonagem
Existem inúmeras bibliotecas genômicas de centenas de organismos, facilitando muito a vida dos pesquisadores, que têm disponível, na rede, em portais de dados, as sequências do genoma.
A clivagem de um genoma eucariótico inteiro, com uma enzima de restrição, pode gerar literalmente milhões de fragmentos.
A biblioteca genômica é uma coleção de fragmentos de DNA que representa o genoma inteiro de um organismo ou de uma célula, coleção adquirida pelo processo de clonagem.
Cada fragmento é inserido em um plasmídeo e usado para transformar uma bactéria.
2
Bibliotecas de DNA
Passos básicos para produzir a clonagem molecular:
O DNA a ser clonado é parcialmente digerido por uma endonuclease de restrição, gerando fragmentos grandes, mas com tamanhos diferentes.
Esses fragmentos de DNA de tamanhos diferentes são separados por eletroforese em gel, para se separar um tamanho específico de fragmento, que será escolhido em razão do vetor a ser utilizado – por exemplo, um bacteriófago.
Os métodos de eletroforese em gel são fundamentais para separar moléculas de DNA de diferentes tamanhos. Os ácidos nucleicos apresentam grupamentos químicos com cargas elétricas somente negativas, provenientes dos radicais fosfatos presentes em sua molécula.
3
Bibliotecas de DNA
Passos básicos para produzir a clonagem molecular:
Corte do plasmídeo com a mesma enzima de restrição. 
Reação de ligação entre o plasmídeo e a sequência: produção de um plasmídio recombinante. 
A DNA ligase é usada para fechar as ligações fosfodiéster. 
Transformação da bactéria com o plasmídeo recombinante.
Recuperação das bactérias recombinantes.
As colônias de bactérias recombinantes são, então, armazenadas e podem ser cultivadas, a qualquer momento, em meio líquido, gerando milhões de cópias do gene inserido.
O plasmídeo recombinante pode então ser retirado por centrifugação do meio onde cresceram as bactérias, gerando muitas cópias que podem ser usadas em sequenciamento, produção de transgênicos, vacinas gênicas, transfectados para células eucarióticas etc.
Esses fagos recombinantes constituem a biblioteca genômica. O organismo pode ser propagado milhares de vezes, o que permite a utilização da biblioteca por longos períodos.
4
Bibliotecas de cDNA
Pode-se produzir uma biblioteca a partir de outros tipos de fragmentos. Uma das melhores contribuições da era pós-genômica é buscar a expressão do gene de forma massiva, na forma de um transcriptoma (coleção de transcritos de mRNAs) ou biblioteca de cDNA (DNA complementar).
Na biblioteca de DNA genômico estão presentes não só as regiões codificantes mas também as regiões não codificantes. Desta forma, quando se pretende estudar uma zona não codificante mas importante para a regulação da transcrição, por exemplo, recorre-se a este tipo de biblioteca.
5
Bibliotecas de cDNA
6
Bibliotecas de cDNA
Células de um tecido são usadas para a extração do mRNA. Para garantir que somente RNAs maduros sejam utilizados, lança-se mão de colunas (cromatografia) contendo caudas expostas de oligo-dTs. O RNAm maduro eucariótico possui cauda poli A, sendo então capturado pela coluna.
O RNAm é eluído da coluna, estando pronto para ser utilizado.
Inicialmente um primer de oligo dT liga-se à cauda poli A, possibilitando que uma polimerase adicione nucleotídeos. No caso essa polimerase é a transcriptase reversa, capaz de usar um molde de RNAm para criar uma fita híbrida RNAm/DNA.
O RNAm é degradado com uma solução alcalina; deixa-se uma parte final que se autocomplementa, resultando num terminal em alça.
A DNA polimerase finaliza produzindo uma fita nova DNA/DNA.
A alça é degradada com uma nuclease.
O resultado é uma cópia de cDNA complementar ao mRNA inicial.
Quando todos os fragmentos estiverem complementados, entra em ação a clonagem, produzindo uma biblioteca com os fragmentos.
A biblioteca pode ser sequenciada, apresentando uma coleção de sequências expressas do DNA naquele tecido.
Eluição:  Separação, fracionamento de uma mistura de partículas.
Primers: DNAs iniciadores
7
Bibliotecas de cDNA
Construção de uma biblioteca de cDNA.
Isolar mRNA das células;
2. Usar a transcriptase reversa para fazer cadeias de DNA complementares a cada mRNA. Usar a DNA polimerase para tornar o DNA de cadeia simples em DNA de cadeia dupla.
3. Inserir em plasmídeo e transformar em E. coli.
8
Expressão de Proteínas Recombinantes (RP)
Proteínas recombinantes: proteínas codificadas pelo DNA recombinante que foi clonado em um vetor de expressão.
A modificação do gene pela tecnologia do DNA recombinante pode levar à expressão de uma proteína mutante.
A proteína recombinante é uma forma manipulada de proteína nativa, que é gerada a fim de aumentar a produção de proteínas, modificar sequências de genes e fabricar produtos comerciais úteis.
A maioria das proteínas recombinantes para uso terapêutico são de origem humana, mas são expressas em microorganismos como bactérias, leveduras ou células animais em cultivo.
Atualmente, a maioria das proteínas terapêuticas recombinantes são produzidas em células de mamíferos porque as células de mamíferos são capazes de produzir proteínas de alta qualidade semelhante às que ocorrem naturalmente.
Além disso, muitas proteínas terapêuticas recombinantes são geradas em E. coli devido à sua genética bem caracterizada, crescimento rápido e produção de alto rendimento.
9
Expressão de proteínas recombinantes
Origem: biblioteca de DNA ou cDNA?
Os genes humanos são muito complexos, muitas vezes contendo sequências de DNA não codificantes conhecidas como íntrons.
Portanto, uma versão livre de íntrons do gene é muitas vezes feita através da conversão do mRNA em cDNA.
As doenças humanas mais comuns estão sistemicamente ou parcialmente relacionadas com disfunções de proteínas específicas.
As proteínas humanas obtidas através da engenharia genética desempenham um papel fundamental no mercado de medicamentos terapêuticos.
Uma das muitas vacinas RP aprovadas pela FDA é a vacina contra a Hepatite B para prevenção de infecções causadas por todos os subtipos conhecidos do vírus da Hepatite B.
10
Expressão de proteínas recombinantes
Todas as Grandes Farmacêuticas desenvolvem agora a RP como medicamentos e, portanto, é uma indústria multibilionária.
RP usadas clinicamente: 
Hormônios recombinantes
Interleucinas
Fatores de crescimento
Fatores de necrose tumoral
Fatores de coagulação do sangue
Drogas trombolíticas
Enzimas para tratar doenças importantes 
diabetes, nanismo, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, apoplexia cerebral, esclerose múltipla, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatite, artrite reumatóide, asma, doença de Crohn e terapias de câncer.
11
Expressão de proteínas recombinantes
12
Expressão de proteínas recombinantes
RP são usadas na produção de alimentos, agricultura e bioengenharia.
Na indústria de criação: enzimas podem ser adicionadas à ração animal para aumentar o valor nutricional dos ingredientes da ração, reduzir os custos da ração e do manejo de resíduos, apoiar a saúde intestinal dos animais, melhorar o desempenho animal e melhorar o meio ambiente.
13
Bibliotecas de DNA e cDNA
Bibliotecas de DNA genômico
Possuem tanto exons como íntrons e podem estender grande distância dificultando isolamento e análise.
Contem todos os genes presentes no genoma de um organismo
Quando se pretende estudar uma zona não codificante mas importante para a regulação da transcrição, por exemplo, recorre-se a este tipo de biblioteca.
Bibliotecas de cDNA
Os cDNA são produzidos a partir de mRNAs, ou seja, não possuem íntrons
Possuem somente sequências codificantes
Representam apenas aqueles que são expressosem um tipo celular específico, reduzindo n° de genes a serem triados.
Vale lembrar que...
PCR - Polimerase Chain Reaction
Descoberta em 1983: Uma técnica única, de extrema sensibilidade, facilidade de manuseio, simplicidade, rapidez e custo relativamente baixo, com aplicações monumentais.
Enquanto o sequenciamento do genoma completo de um organismo apresenta como etapa intermediária a criação de uma ou mais bibliotecas, a clonagem de um gene pode ser feita de maneira rápida, com ajuda da biblioteca, visto que a sequência genômica já está completa.
Se soubermos pelo menos uma parte da sequência do gene a ser clonado, podemos gerar milhares de cópias pelo processo conhecido como reação em cadeia da polimerase.
15
PCR - Polimerase Chain Reaction
Baseado na amplificação enzimática de um fragmento de DNA com a utilização de iniciadores (primers) complementares a fita-alvo.
Protocolo baseado na alteração de temperaturas para ocorrência das ligações necessárias à amplificação.
Reação em cadeia e exponencial.
16
PCR - Polimerase Chain Reaction
A reação é preparada com:
uma solução contendo a amostra de DNA que se quer amplificar
uma DNA polimerase estável ao calor (Taq polimerase)
quatro tipos de deoxinucleotídeos trifosfatados (nucleotídeos com as bases nitrogenadas A, T, C e G, chamados de dNTPs)
dois oligonucleotídeos chamados primers (oligonucleotídeos complementares às duas extremidades (5’ e 3’) do fragmento a ser amplificado).
Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes.
17
PCR – Passo a passo
Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana;
A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares à sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio;
Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR – termociclador (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa;
Aquece-se o tubo a 92-96°C para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA (entre 30s e 1’);
Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 58-65°C onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase (entre 30s e 1’);
Aquece-se novamente o tubo a 72°C (temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla (entre 45s e 1’). Cada ciclo é repetido em torno de 60 vezes e promove a amplificação da região alvo determinada conforme afinidade das sequências iniciadoras (primers).
18
PCR – Passo a passo
19
PCR – Passo a passo
20
Clonagem Molecular x PCR
Então, qual o contexto de utilização da clonagem molecular e da PCR?
O DNA recombinante, no sentido de criação de novas sequências de DNA, surgiu com a enzima de restrição. Trata-se de inserir o gene em vetores e fazer a alteração de um genoma bacteriano.
A clonagem molecular permite manter sequências de DNA, de diferentes tamanhos, por tempo indeterminado, intactas, podendo ser recuperadas e multiplicadas a qualquer momento, bastando fazer o repique dessas bactérias, ou leveduras, recombinantes, após anos ou décadas, guardadas em freezer.
A clonagem molecular é adequada à produção de projeto genoma.
Então, qual o contexto de utilização da clonagem molecular e da PCR? Existe inicialmente um contexto histórico. O DNA recombinante, no sentido de criação de novas sequências de DNA, surgiu com a enzima de restrição. Trata-se de obter a primeira resposta técnica, inserir o gene em vetores, fazer a alteração de um genoma bacteriano. 
21
Clonagem Molecular x PCR
Então, qual o contexto de utilização da clonagem molecular e da PCR?
A PCR, por sua vez, amplifica o gene apenas. O produto da PCR é a sequência amplificada, utilizável em dezenas de projetos, mas só pode ser guardada por alguns dias, com perda de material.
A fundamental vantagem do PCR é que não necessita de tantos passos quanto a clonagem, o único segmento que será amplificado é aquele entre dois primers, o que acarreta especificidade.
Em tese, basta uma cópia do template (molde de DNA) para que a amplificação ocorra, sendo portanto, muito sensível. Especificidade, sensibilidade e rapidez no trabalho traduzem-se em praticidade na utilização diária e em aplicações variadas.
Um crime pode ser investigado se houver uma molécula de evidência, como poucas células foliculares de um único fio de cabelo do suspeito ou células sob as unhas da vítima.
Entretanto, a PCR em si não apresenta a identificação do suspeito. Ninguém tem seu nome tatuado na molécula. É preciso um conhecimento a priori para a produção e análise do PCR.
Então, qual o contexto de utilização da clonagem molecular e da PCR? Existe inicialmente um contexto histórico. O DNA recombinante, no sentido de criação de novas sequências de DNA, surgiu com a enzima de restrição. Trata-se de obter a primeira resposta técnica, inserir o gene em vetores, fazer a alteração de um genoma bacteriano. 
22