Questões biblioteca genomica e cDNA

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Estudo Dirigido - Bibliotecas genômicas e de cDNA
1 - Descreva os principais passos da construção da biblioteca de cDNA.
R: Primeiramente, deve-se obter um tecido de interesse, lisar as células e purifiar o RNAm. Depois, deve-se usar o RNAm contendo uma cauda poli-A como molde para a síntese da fita de DNA. Adiciona-se um primer na cauda poli-A e, com a transcriptase reversa, inicia-se o processo de síntese do DNA no sentido 5’-3’. Irá se formar então uma fita dupla híbrida, sendo uma o RNAm e a outra o cDNA. A fita de RNAm é então removida com calor, álcali ou RNAse H. Após a remoção do RNAm, há a formação de uma alça na extremidade 3’, que servirá de molde para a DNA polimerase sintetizar a outra fita de DNA. Inicia-se então a síntese da fita de DNA e ao final da síntese a alça é clivada pela nuclease S1.
2 - Que características um plasmídeo de clonagem deve ter para se construir uma biblioteca genômica? Explique a importância de cada característica.
R: Uma origem de replicação, ou seja, um ponto de partida inicial importante para o plasmídeo se replicar independentemente do DNA cromossômico; um marcador de seleção, como por exemplo, um gene de resistência a uma droga, importante para seleção da colônia de interesse no meio de cultura; e um sítio de restrição para determinada enzima, onde as endonucleases de restrição irão cortar a fita de DNA para inserir o DNA de interesse, gerando o DNA recombinante.
3 - De que maneiras podemos fazer a triagem de uma biblioteca genômica? 
R: Sondagem por Hibridização, onde um DNA fita simples pode parear com outro DNA ou RNA desde que este possua região complementar; e Sondagem Imunológica, usado para rastrear a expressão gênica a nível de proteína.
4 - Exemplifique uma técnica de hibridização.
R: Exemplo: hibridização de colônias - transferência das colônias para a membrana; adesão das bactérias à membrana; adição de solução alcalina para lisar as bactérias e desnaturar o DNA; sonda com DNA marcado; impressão de raio-X; obtenção do resultado.
5 - Na triagem de uma biblioteca de cDNA de músculo de porco, foi empregado o soro de um coelho imunizado contra miosina de carneiro. O que deve ser encontrado na biblioteca de cDNA? Por quê?
R: Devem ser encontrados clones de cDNA expressando a miosina de porco. Porque os anticorpos produzidos são contra da miosina de carneiro, e como a miosina é uma proteína altamente conservada ao longo da evolução, provavelmente esses anticorpos reconhecerão algumas das partes da miosina de porco, já que os dois vertebrados são mamíferos, ou seja, haverá regiões homólogas, mas não será de 100%.