Exercícios II GABARITO

Prévia do material em texto

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU 
 DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS NATURAIS 
 BIOLOGIA MOLECULAR 
Paula Angélica Roratto Página 1 
 
 
 
 
 Questão 1: O primeiro passo para se trabalhar com biologia molecular é o isolamento dos 
ácidos nucleicos, sejam eles DNA ou RNA. Apesar da grande variedade de protocolos de extração de DNA, 
contendo inúmeras variações, todos eles envolvem dois passos fundamentais. Descreva-os. 
Resposta: A extração de ácidos nucleicos sempre envolve um passo de lise celular, na qual o tecido é 
submetido a enzimas e detergente para romper as membranas e expor todo o conteúdo celular. O segundo 
passo é isolar somente as moléculas de interesse através de precipitação e centrifugação. 
 Questão 2: A eletroforese é uma das técnicas de separação e visualização de ácidos nucleicos 
mais utilizadas em laboratórios de biologia molecular. Consiste na separação de moléculas de DNA ou RNA 
que percorrem uma matriz. Explique no que se baseia o movimento dos ácidos nucleicos durante a 
eletroforese e de que forma essa matriz (agarose) oferece resistência às moléculas, permitindo a sua 
separação. 
Resposta: O movimento dos ácidos nucleicos em um gel, durante a eletroforese, só é possível porque essas 
moléculas têm carga negativa. Desse modo, ao serem submetidas a presença de uma corrente elétrica, as 
moléculas de DNA e RNA migram sempre para o pólo positivo. A matriz do gel é porosa e, portanto, 
moléculas menores apresentam maior facilidade em passar pelos poros, enquanto moléculas maiores 
passam com mais dificuldade, ou seja, migram com uma velocidade menor pela matriz. PORTANTO, A 
ELETROFORESE SEPARA OS FRAGMENTOS DE DNA POR TAMANHO. 
 Questão 3: O cromossomo humano apresenta 3 bilhões de pb. O cromossomo 1 é o maior, 
com cerca de 246 milhões de pb, e o cromossomo 22 é um dos menores com 49 milhões de pb. Encontrar 
um gene em meio a este universo de moléculas extensas é um desafio. Uma das ferramentas 
extremamente úteis para facilitar a manipulação do material genético é a clivagem com enzimas de 
restrição. Explique de que forma uma enzima de restrição desempenha seu papel, disponibilizando 
moléculas de DNA menores para facilitar seu manuseio. 
Resposta: Enzimas de restrição clivam a dupla hélice do DNA, ou seja, rompem as ligações fosfodiéster 
entre os nucleotídeos nas duas fitas do DNA. Essa clivagem ocorre sempre em uma sequência específica 
(sítio reconhecido pela enzima). Considerando que este sítio ocorre com uma certa frequência ao longo do 
cromossomo, haverá várias quebras da dupla hélice gerando inúmeros fragmentos de DNA.
 Questão 4: A figura ao lado mostra o resultado da 
eletroforese em gel de agarose do DNA extraído do vírus bacteriófago 
lambda na canaleta do meio, que possui aproximadamente 48.000 pb, e a 
mesma amostra clivada com a enzima de restrição EcoRI, que reconhece o 
sítio ( 5’-GAATTC-3’), na canaleta da direita. Explique porque a digestão 
dessa amostra gerou as 5 bandas observadas no gel. 
Resposta: A sequência de DNA do bacteriófago lambda, com seus 48 mil 
pares de bases, possui apenas 4 ocorrências da sequência reconhecida pela 
enzima EcoRI ( 5’-GAATTC-3’). Desse modo, uma clivagem do DNA do fago 
lambda com EcoRI vai gerar sempre 5 fragmentos de DNA, visivelmente 
separados em um gel de agarose. 
 Questão 5: Os cromossomo de células eucariotas são 
moléculas de DNA lineares, ou seja, possuem começo e fim; enquanto que 
cromossomos bacterianos são moléculas de DNA circulares. Imagine a 
situação em que uma de DNA linear e uma circular tenham sido clivadas 
com a enzima de restrição de restrição EcoRI, e que ambas possuam 4 
EXERCÍCIOS II: Técnicas de Biologia Molecular I, II e III 
 
 
 
Paula Angélica Roratto Página 2 
sítios de clivagem por essa enzima. Quantos fragmentos de DNA seriam gerados em 
cada situação, para esta digestão enzimática? Desenhe como ficaria o resultado em 
um gel de agarose. 
Resposta: A Uma molécula de DNA linear com 4 sítios de clivagem resulta em 5 
fragmentos de DNA. Já uma molécula de DNA circular clivada em 4 lugares por uma 
enzima de restrição vai gerar 4 fragmentos de DNA. 
 Questão 6: Qual a característica da molécula de DNA na qual todas as técnicas de hibridização 
se baseiam? E quais características da sonda são igualmente compartilhadas, independente de ser 
Southern blot, Northern blot, Captura híbrida ou FISH? 
Resposta: Qualquer procedimento de hibridização utiliza a característica da molécula de DNA de 
desnaturação e renaturação da dupla hélice [abertura da dupla hélice por rompimento das pontes de 
hidrogênio, e reanelamento das fitas]. A sonda utilizada em procedimentos de hibridização deve ter, 
obrigatoriamente, uma sequência de DNA complementar a uma região do gene de interesse e deve 
carregar algum tipo de marcação, geralmente fluorescência, para sinalizar a ocorrência positiva de uma 
hibridização. 
 Questão 7: Compare a técnica de amplificação do DNA por Reação em Cadeia da Polimerase 
(PCR) com o mecanismo de replicação do DNA celular, em relação a abertura da dupla hélice, presença de 
iniciador, extensão do DNA copiado e número de cópias. 
Resposta: Na replicação do DNA a abertura da dupla hélice é conduzida pela enzima helicase, enquanto na 
PCR é através de aumento da temperatura. O iniciador é produzido pela enzima primase na replicação 
celular, enquanto na PCR um par específico de iniciadores é adicionado à reação e anela sempre no mesmo 
local. A presença deste par de iniciadores faz com que a extensão do fragmento de DNA copiado seja 
limitada na PCR, enquanto na replicação do DNA toda a extensão do cromossomo é copiada. Por fim, a PCR 
é uma reação em cadeia que produz bilhões de cópias do fragmento de DNA alvo, enquanto a replicação 
celular do DNA produz apenas duas cópias de cada cromossomo. 
 Questão 8: A toxoplasmose é uma zoonose causada por um protozoário intracelular que pode 
parasitar os mais diversos tecidos de aves e mamíferos. Desenvolveu-se um protocolo de detecção do 
protozoário causador da doença por PCR, através da amplificação de um gene exclusivo da espécie de 
Toxoplasma gondii, utilizando amostra de sangue da pessoa infectada. Como é possível que este protocolo 
amplifique especificamente o DNA do protozoário a partir de amostras contendo DNA humano? 
Resposta: A especificidade em uma reação de PCR é garantida porque os iniciadores são complementares à 
sequências específicas de uma região do DNA (um gene) do T. gondii, e somente irão anelar nessa 
sequência, mesmo que haja DNA humano na mesma amostra. 
 Questão 9: A tabela abaixo mostra o padrão de termociclagem para a amplificação de um gene 
específico para T. gondii, descrito na questão anterior. Complete a tabela, descrevendo o que acontece 
durante a reação em cada um dos passos. 
Ciclos Temperatura Tempo Descrição 
1 
94°C 5 min Desnaturação inicial da dupla hélice em toda a extensão do 
cromossomo 
30 
94°C 30 seg Desnaturação 
55°C 30 seg Anelamento dos iniciadores 
72°C 45 seg Extensão da DNA polimerase 
1 
72°C 10min Extensão final de todas as fitas de DNA que foram sintetizadas 
pela metade 
1 4°C ∞ Armazenamento do produto resfriado 
 
 
 
Paula Angélica Roratto Página 3 
 Questão 10: Uma reação em cadeia da polimerase (PCR) possibilita a produção de bilhões de 
cópias de um fragmento de DNA de interesse, a partir de um par de primers (iniciadores) que conferem 
especificidade a reação. Como se explica o fato da amplificação do DNA por PCR ser uma reação em cadeia? 
O que justifica a questão do aumento no número de moléculas produzidas de forma exponencial? 
Resposta: A cada ciclo da PCR são geradas cópias idênticas do fragmento de DNA que está sendo 
amplificado, sendo que cada uma dessas cópias servem como molde no ciclo seguinte. Dessa forma, o 
aumento no número de cópias é exponencial. 
 Questão 11: A amplificação de mRNA requer, primeiramente, um passo de transcrição reversa 
que produza um cDNA,para que então a DNA polimerase possa utilizar este cDNA como molde em uma 
PCR normal. Cite as duas principais aplicações da RT-PCR (Transcrição reversa seguida de PCR). 
Resposta: A análise de expressão gênica, utilizando iniciadores específicos para o cDNA de um determinado 
gene, e o diagnóstico de infecção por retrovírus, utilizando iniciadores específicos para o cDNA de um gene 
do retrovírus. 
 Questão 12: Doenças genéticas geralmente apresentam ocorrência rara na população 
humana. Quando surge um caso de portador de alguma síndrome, é importante que uma amostra de DNA 
do indivíduo afetado seja extraída para a investigação das bases genéticas da doença. Um tubinho 
contendo o produto de extração de DNA pode ser armazenado em freezer ou ultra-freezer durante muitos 
anos para ser utilizado em pesquisas futuras, se no momento da coleta da amostra não se tenha nenhum 
conhecimento sobre quais genes investigar. 
 Por outro lado, pesquisadores interessados em estudos de expressão gênica, que utilizam protocolos de 
extração de RNA, não costumam armazenar seus extratos de mRNA congelados por muito tempo. Em vez 
disso, todo mRNA extraído é utilizado como molde em uma reação de transcrição reversa para a produção 
de fitas de DNA complementares a estes mRNA, ou seja o cDNA. Explique porque amostras de extração de 
DNA e RNA recebem tratamento diferenciado em relação ao armazenamento e como funciona a 
transcrição reversa de mRNA total extraído de eucariotos. 
Resposta: Moléculas de DNA são mais estáveis para o armazenamento e conservação do que moléculas de 
RNA, principalmente porque as RNAses (enzimas que degradam RNA) são muito mais abundantes do que as 
DNAses. Por isso a preocupação em armazenar amostras de mRNA na forma de uma fita simples de DNA 
complementar, o cDNA. [mesmo sendo DNA fita simples, o cDNA é mais estável do que o mRNA] 
A reação de transcrição reversa gera o cDNA a partir de um mRNA. Todos os mRNAs eucarióticos possuem 
uma cauda poli-A em sua extremidade 3’. A utilização de um primer poli-T, que anela especificamente com 
a cauda poli-A, serve como iniciador para a enzima transcriptase reversa copiar a fita complementar do 
mRNA em uma fita de DNA. 
Geralmente, depois de produzir o cDNA, a amostra total de mRNAs extraídos é degradada, restando apenas 
as cópias do cDNA total. 
 Questão 13: O que as técnicas de Northern blot e RT-PCR possuem em comum? Em que 
situação vocês se obrigaria a usar o Northern blot, não podendo realizar uma RT-PCR? Qual a vantagem da 
RT-PCR em detrimento do Northern blot? 
Resposta: Ambas utilizam o mRNA, procurando investigar se um gene de interesse está sendo expresso no 
tecido em que o mRNA foi extraído. Para realizar o Northern blot, basta que apenas uma pequena parte da 
sequência do gene seja conhecida para a confecção da sonda complementar. Portanto, essa técnica é 
indicada quando não se tem um conhecimento da sequência total do gene. A RT-PCR somente pode ser 
realizada se a sequência do gene é conhecida, permitindo a construção de um par de iniciadores para a 
amplificação. A vantagem da RT-PCR é que o procedimento de amplificação é muito mais simples e rápido 
que o Northenr blot, além do que ela pode ser aplicada em uma PCR em tempo real que permite não 
apenas informar que o gene está sendo expresso, mas também quantificar a expressão [a quantidade de 
mRNA produzida por um determinado tecido]. 
 
 
 
Paula Angélica Roratto Página 4 
 Questão 14: Se um pesquisador está interessado em investigar mutações em um determinado 
gene que causam uma distrofia muscular congênita, ele pode extrair DNA de uma amostra de sangue do 
indivíduo afetado ou ele tem que extrair a amostra de DNA do músculo? 
Resposta: O pesquisador pode extrair uma amostra de sangue do indivíduo, porque a mesma sequência de 
DNA das células musculares está presente nas células de qualquer outro tecido do organismo. 
 Questão 15: Em relação à questão anterior, suponha que o pesquisador já estudou a mutação 
causadora da distrofia e sabe que ela ocorre no sítio promotor do gene que produz uma proteína muscular 
importante. Essa mutação no promotor silencia o gene, ou seja, a pessoa portadora dessa mutação não 
produz a proteína e, portanto, apresenta o fenótipo de distrofia muscular. Neste caso, em vez de trabalhar 
com a sequência do gene, de que forma o pesquisador poderia avaliar se este gene realmente está 
silenciado? O material necessário para esta análise deve ser obtido exclusivamente no tecido muscular ou 
pode ser a partir de uma amostra de sangue do indivíduo afetado? 
Resposta: Para avaliar se o gene está silenciado, [ou seja, se a mutação no promotor não está permitindo a 
transcrição do mRNA] o pesquisador deve fazer uma RT-PCR utilizando primers específicos para a 
sequência do cDNA deste gene. Neste caso, o pesquisador tem que extrair o mRNA de células musculares 
do indivíduo afetado, para investigar se a distrofia é causada pela falta da produção desta proteína no 
músculo. 
 Questão 16: Os microtubos da figura ao lado representam 
extrações de mRNA total de uma célula hepática cancerígena (CHC) e de 
uma célula hepática normal (CHN) do mesmo paciente. Suponha que o 
pesquisador tenha interesse em investigar se o gene X possui expressão 
aumentada nas células cancerígenas. 
16.1) De que forma ele poderia detectar a presença da expressão do 
gene X nestas amostras? 
Resposta: Com a realização de RT-PCR na qual os primes são específicos 
para a sequência do mRNA da proteína X. 
16.2) Complete a figura abaixo que representa um gel de agarose, com o 
resultado esperado caso a proteína X seja encontrada apenas no tecido 
cancerígeno. 
 
 
 
AS QUESTÕES A SEGUIR FORAM RETIRADAS DE PROVAS DO ENADE. TESTEM SEUS CONHECIMENTOS! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
X 
 
 
 
Paula Angélica Roratto Página 5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
X