Bibliotecas de DNA

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Bibliotecas de DNA
Separação física de CADA gene no genoma para depois selecionar os fragmentos desejados para estudo.
Criação das bibliotecas de DNA - Adquirida pelo processo de clonagem
Existem inúmeras bibliotecas genômicas de centenas de organismos, facilitando muito a vida dos pesquisadores, que tem disponível na rede, em portais de dados, as sequências do genoma.
Passos básicos para produzir clonagem molecular:
1) O DNA a ser clonado é parcialmente digerido por uma endonuclease de restrição, gerando fragmentos grandes, mas com tamanhos diferentes.
2) Esses fragmentos de DNA de tamanhos diferentes são separados por eletroforese em gel, para se separar um tamanho específico de fragmento, que será escolhido em raz do vetor a ser utilizado – por exemplo, um bacteriófago. Importante determinar o vetor.
3) Corte do plasmídeo com a mesma enzima de restrição
4) Reação de ligação entre o plasmídeo e a sequência: produção de um plasmídeo recombinante
5) A DNA ligase é usada para fechar as ligações fosfodiéster
6) Transformação da bactéria com o plasmídeo recombinante
7) Recuperação das bactérias recombinantes
8) As colônias de bactérias recombinantes são, então armazenadas e cultivas a qualquer momento em meio líquido, gerando milhões de cópias do gene inserido.
9) O plasmídeo pode então ser retiruado por centrifugaçãoo do meio onde crescerem as bácterias, gerando muitas cópias que podem ser usadas em sequenciamento, produção de vacinas produção de transgênicos
10) Utiliza por longos períodos.
Biblioteca de cDNA.
Pode produzir uma biblioteca a partir e outros tipos de fragmentos. Uma das melhores contriguições da era pós-gênomica é buscar a expressão de forma massiva, na forma de um transcriptoma (coleção de transcritos de mRNAs – quais genes estão ativos) ou a biblioteca de cDNA (DNA complementar)
Pega o RNA mensageiro daquela célula para poder produzir o DNA complementar através da transcriptase reversa. Sabe quais genes estão ativos. Biblioteca cDNA.
RNA instável, para fazer uma biblioteca.
Passos: 
Células de um tecido são usadas para extrair o mRNA. Para garantir que somente RNA’s maduros sejam utilizados, lança-se mão de colunas contendo caudas expostas de oligo-dts. O RNam maduro possui cauda 5’poli A, sendo capturado pela coluna. Utiliza-se um primer com timinas que garante que só estará pegando RNA maduro.
O RNAm é pego e faz sua eluição numa coluna, estando pronto para utilizar.
Inicialmente um primer de oligo dT liga-se a caude poli A, dá inicio a produção do DNAc pois possibilita que uma polimerase pela adição de nucleotídeos. No caso essa polimerase é a transcriptase reserva, capaz de usar um molde de RNAm para criar uma fita hibrída RNAm/DNA.
Faz um looping, fazendo um alongamento da fita de DNAcomplentar para continuar a produzir o DNAc. Tem uma fita dupla de DNA complementar, uma só não tem estabilidade complementar ao RNAm pego para fazer a biblioteca de cDNA
O RNAm é degradado com uma solução alcalina, deixa-se uma parte final que se autocomplementa, resultando num terminal em alça.
A polimerase finaliza produzindo a nova fita DNA/DNA
A alça é degrada com uma nucleasse
Resulta de uma cópia de cDNA complementar ao mRNA incial
Quando todos os fragmentos estiverem complementados, entra em ação a clonagem produzindo uma biblioteca com fragmentos, que pode ser sequenciada apresentando uma coleção de sequências expressas do DNA naquele tecido.
Expressão de proteínas recombinantes
É expressa através da clonagem molecular, pega uma célula do pâncreas humano preparamos o gene da insulina utilizando a enzima de restrição, endonuclease pega o plasmídeo, corta-se com a enzima da restrição liga o plasmídeo ao gene de interesse, forma-se o DNA recombinante, entra na bactéria receptora fazendo a clonagem.
Vale lembrar que...
Bibliotecas de DNA genômico
Possuem tanto exons como intros, e podem estender grande distância dificultando isolamento e análise.
Contem todos os genes presentes no genoma de um organismos.
Quando se pretende estudar uma zona não codificante mas importante para a regulação da transcrição por exemplo: recorre-se a esta biblioteca.
cDNA
Os cDNA são produzidos a partir de mRNA, ou seja não possuem íntrons
Possuem somente sequências codificantes
Representam apenas aqueles que são expressos em um tipo celular específico reduzindo n° de genes a serem triados.
Pontos principais
Expressão heteróloga como ferramenta biotecnológica para aplicação em processos e obteção de produtos em diversos setores.
Biomol fundamental e de elevado pontecial exploratório em diversas áreas.
Importância das Bibliotecas de DNA e cDNa para entendimento aprofudando dos organismos vivos e seu potencial para exploração da sociedade ( sociais, econômico, ambientais)
PCR
Vai reproduzir aquele material genético. Técnica única, de extrema sensibilidade, facilidade de manuseio, rapidez e custo relativamente baixo e com aplicações diversas.
Para fazer o sequenciamento é a criação de uma biblioteca. A clonagem é feita de maneira sem ajuda, visto que a sequência já está completa.
Baseado na amplificação enzimática de um fragmento de DNA com utilização de iniciadores (primers) complementares a fita-alvo.
Protocolo baseado na temperatura para ocorrência das ligações necessárias a amplificação. Depende da temperatura, das alterações
Reação em cadeia e exponencial
A reação é preparada com:
Solução contendo a amostra e DNA que ser amplificar
Dna polimerase estável ( TAQ)
Quatro tipos deoxinucleotídeos trisfofatados ( nucleotídeos com as bases nitroneganadas)
Dois oligonucleotídeos chamados de primers ( oligonucleotídeos complementares ás duas extremidades ( 5’ e 3’ do fragmento).
Quando a molécla de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a fita dupla, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação por isso precisamos de dois tipos de primers diferentes.
Obtem-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana
A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação ( DNA polimerase) , os nucleotídeos de DNA e os primeres complentares, senso e antisenso, solução tampão são colocados num tubo. 
Cola-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR – termociclador ( maquina que aumenta e dimir a temperatura de acordo com o programa). OS passos seguintes de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina contralados pelo programa
Aquece-se o tubo a 92°C-96°C para desnaturar separar a dupla fita o DNA ( Entre 30S e 1min )
Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve para síntese das cadeias complentares. Para isso resfria-se 58-65°C temperatura que os primers se anelam ao ínicio das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a polimerase.
Aquece- tubo novamente 72° (temperatura ideal de funcionamento da TAQ polimerase) para duplicação da fita. A DNA polimerase inciia, após o final do primer a colocar os nucleotídeos livrres na fita de DNA ligando-os por complementariedade, formando uma nova fita ( entre 45s e 1’). Cada ciclo é repetido em torno de 60 vezes e promove amplificação da região alvo.
No final de 60 ciclos, um número de moléculas cresce, vai dobrando.
Então qual o contexto de utilização da clonagem molecular e pcr?
Clonagem molecular – Trata-se de obter a primeira resposta técnica, inserir o gene em vetores, fazendo a alteração de um genoma bacteriano. Vai permitir manter sequência de DNA, por tempo indeterminado, intactas, podendo ser recuperados e multiplicadas a qualquer momento bastando fazendo o repique dessas bactérias ou leveduras, recombinantes, após anos ou décadas, guardadas em freezer e colocadas para crescer fonte sem fim do material.
PCR – Amplifica o gene apenas. O produto do PCR é a sequência amplificada, utilizável em dezenas de projeto mas só pode ser guardada por alguns, com perda de material. A fundamental vantagem do PCR é que não necessita de tantos passos quanto a clongem, o único seguimento que será amplificado é aquele entre dois primers, o que acarreta especificidade. Em tese, basta uma cópia do template (molde de DNA),paraque a amplificação ocorra, sendo muito sensível. Especificidade, sensibilidade e rapidez precisa da biblioteca de DNA no trabalhado traduzem-se em praticidade na utilização diária e em aplicações variadas.