Produção de embriões bovinos in vivo e in vitro [2012]

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA 
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO E CULTURA 
DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA 
 
 
83ª SEMANA DO FAZENDEIRO 
 
 
 
 PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS IN VIVO 
E IN VITRO. 
 
 
 
 
 
Jurandy Mauro Penitente Filho 
Fabrício Albani Oliveira 
Ciro Alexandre Alves Torres 
 
 
 
 
Viçosa – MG 
2012 
 
 
Índice 
 
Introdução...................................................................................................................... 1 
Dinâmica folicular............................................................................................... 1 
Produção in vivo de Embriões Bovinos........................................................................ 2 
Seleção e Sincronização das receptoras............................................................. 2 
Sincronização de receptoras com PGF2α............................................................ 3 
Uso do GnRH e suas associações........................................................................ 3 
Associação de progestágenos e estradiol............................................................ 5 
Tratamentos que aumentam a concentração de P4 plasmática e a taxa de 
prenhez.................................................................................................................. 6 
Seleção e Superovulação (SOV) das doadoras.................................................. 7 
Protocolos de SOV e IA das doadoras usando cio natural............................... 8 
E2 + Implante de P4............................................................................................. 8 
Inseminação com tempo fixo............................................................................... 8 
Coleta de Embriões.............................................................................................. 10 
Rastreamento e classificação de embriões......................................................... 10 
Transferência dos embriões................................................................................ 11 
Produção in vitro de Embriões Bovinos....................................................................... 11 
Coleta dos Complexos cumulus oócitos (CCOs)................................................ 12 
Classificação de oócitos........................................................................................ 12 
Maturação in vitro............................................................................................... 13 
Fertilização in vitro.............................................................................................. 13 
Cultivo in vitro de embriões................................................................................. 14 
Micromanipulação de Embriões.................................................................................. 14 
Bipartição de Embriões....................................................................................... 14 
Separação de Blastômeros................................................................................... 15 
Referências...................................................................................................................... 16 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
Introdução 
 
A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução animal são condições 
indispensáveis para o aumento da eficiência produtiva. Nesse sentido, especialmente no que 
se refere aos ruminantes domésticos, biotécnicas como a inseminação artificial, fertilização in 
vitro e a transferência de embriões vêm sendo utilizadas com sucesso (FIGUEIREDO et al., 
2007). 
A produção de embriões bovinos in vivo, através da superovulação das doadoras e 
posterior lavagem uterina, é consagrada mundialmente como forma eficiente de multiplicação 
rápida dos indivíduos considerados de melhor mérito genético dentro de um rebanho. Os 
embriões também podem ser produzidos no laboratório utilizando técnicas de fecundação in 
vitro ou por clonagem de células embrionárias ou somáticas. 
Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos permitiram uma 
maior participação da fêmea bovina no processo de melhoramento genético do rebanho. Isso 
porque o número de descendentes deixados por uma única fêmea ao longo de sua vida 
reprodutiva aumentou significativamente com o aperfeiçoamento das técnicas de transferência 
e produção in vitro de embriões, entretanto, uma das principais desvantagens da PIV ainda 
está na baixa produção e qualidade de embriões (GONÇALVES et al., 2007) levando a baixas 
taxas de gestação após inovulação, além do elevado custo de produção de cada embrião. 
 
Dinâmica folicular 
A unidade funcional da gônada feminina e que contém o gameta feminino é o folículo; a 
principal função do folículo é proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação 
do ovócito, bem como produzir hormônios como o estradiol (E2) e peptídeos (PRESTES & 
ALVARENGA, 2006). 
Ao nascimento, as fêmeas dos mamíferos possuem, em seus ovários, folículos 
primordiais contendo ovócitos estacionários no estado dictióteno da prófase I da meiose. 
Esses ovócitos vão sofrer maturação na fase de crescimento do folículo e reinício da meiose 
(maturação final) no folículo pré-ovulatório, somente após a puberdade (PRESTES & 
ALVARENGA, 2006). 
O desenvolvimento folicular de bovinos ocorre em um padrão de ondas. Cada onda de 
crescimento folicular é caracterizada por um grupo de pequenos folículos que são recrutados e 
iniciam uma fase de crescimento comum por cerca de três dias. Destes folículos, apenas um 
continua seu desenvolvimento, enquanto os outros sofrem decréscimo de tamanho, 
estabelecendo-se então, o fenômeno da divergência folicular (BARUSELLI et al., 2007). 
Vacas e novilhas podem ter duas ou três ondas por ciclo, com um folículo tornando-se 
dominante em cada uma delas. Por isso, uma população de pequenos, médios e grandes 
folículos é encontrada em cada ovário, durante todos os dias do ciclo estral (BORGES et al., 
2001). 
Cada onda de crescimento folicular é dividida em quatro fases: emergência, seleção, 
dominância e atresia ou ovulação. A emergência de uma onda é caracterizada por um 
crescimento de mais de 20 folículos pequenos que são estimulados pelo FSH (REIS, 2004). A 
concentração de FSH atinge seu pico quando o maior folículo denominado dominante (FD) 
atinge o tamanho de 4 a 5 mm (Figura 1; NASSER, 2006). 
2 
 
 
Figura 1: Fases do crescimento folicular: Recrutamento (dependente de FSH); Seleção e 
dominância (dependente de LH); e Ovulação ou atresia ( dependente da presença ou não do pico de 
LH) Fonte: TECNOPEC, 2008 
 
Uma das maneiras do FD manter seu “status” é produzir substâncias que inibam o 
desenvolvimento de outros folículos antrais. Uma dessas substâncias é a inibina, um 
hormônio peptídeo produzido pela granulosa que inibe a secreção do FSH por efeito de retro 
alimentação negativa sobre a liberação de FSH, aparentemente através de efeito direto sobre a 
hipófise (FLORIANI, 2006). 
A dinâmica folicular em animais zebuínos tem-se mostrado diferente da de bovinos de 
raças européias, de modo que o diâmetro dos FD e a área do CL são menores nas fêmeas 
zebuínas (BORGES et al., 2004). E em zebuínos, existem relatos que descrevem maior 
incidência de três ondas, sendo notificada à presença de até quatro ondas de crescimento 
folicular por ciclo estral (BARUSELLI et al., 2007). Rasi (2005) ressalta que a emergência da 
3ª onda folicular está associada a uma fase luteínica mais prolongada (Figura 2). 
 
 
Figura 2: Esquemas de ciclo estral de duas (A) e três ondas foliculares (B). Fonte: TECNOPEC, 
2008Produção in vivo de Embriões Bovinos 
 
Seleção e Sincronização das receptoras 
As receptoras de embriões necessitam de cuidados tão rigorosos quanto os dispensados 
às doadoras. Os cuidados, em relação à sanidade (IBR, BVD, Leptospirose, Tuberculose, 
B A 
3 
 
Brucelose, Tricomonose), nutrição, mineralização de qualidade e fertilidade, influem de 
forma significativa sobre os resultados da técnica. 
Geralmente como receptoras são utilizadas fêmeas cruzadas (zebu x taurino), jovens, 
com boa capacidade de conversão alimentar, com alta fertilidade e boa habilidade materna são 
consideradas as melhores receptoras, por isso, mais procuradas. Em geral, quando as 
receptoras pariam e desmamavam suas crias eram descartadas, porém atualmente o 
reaproveitamento de receptoras tem se tornado uma prática cada vez mais comum, pois os 
preços praticados pelos fornecedores de receptoras têm se tornado cada vez maior. 
Algumas considerações devem ser feitas em relação à sincronia da receptora com a 
doadora, tendo em vista que no momento da coleta, os embriões apresentam uma importante 
variabilidade em seus estágios de desenvolvimento (24 a 36 h de diferença). Sendo assim é 
adequado ter um grau de sincronia de aproximadamente 24 horas entre a doadora e a 
receptora, o que permite eleger a receptora mais apropriada para cada tipo de embrião 
coletado. 
 
Sincronização de receptoras com PGF2α 
A PGF2α e seus análogos são os hormônios mais utilizados na sincronização de cio. 
Porém, a PGF2α apresenta alguns limitantes em seu uso, tais como: necessidade de pessoas 
qualificadas para detecção de cio, alta variabilidade das respostas ao tratamento e limitada 
quantidade de receptoras detectadas em cio. 
Vários estudos sobre o uso de prostaglandinas demonstraram que a variação do 
intervalo entre a aplicação aos sinais de cio e ovulação pode ser atribuída ao estado da onda 
folicular no momento do tratamento. Se a luteólise for induzida antes da metade do período 
estático do folículo dominante, indica que este será o folículo ovulatório, sendo que o 
intervalo tratamento-cio será curto entre 2 e 3 dias. Porém, se a luteólise for induzida após 
esse momento, o folículo ovulatório será da próxima onda folicular e o intervalo tratamento-
cio será maior, entre 4 a 6 dias. 
Além disso, estudos revelam que a PGF2α não é efetiva nos primeiro 5 a 6 dias do ciclo 
estral. Um dos protocolos de sincronização de cios mais usados e mais eficiente, consiste na 
administração de 2 doses de PGF2α num intervalo de 11 a 14 dias, o que possibilitará que 
todos animais tratados estejam em fase luteal no momento da segunda aplicação. Este método 
é facilmente aplicado a um programa de TE, visto que permite que a primeira dose de PGF2α 
seja administrada na receptora no momento em que a doadora estiver em cio, antes da 
superovulação (SOV), com a 2
a
 dose sendo aplicada após 11-12 dias, ou seja 12 horas antes 
da aplicação de PGF2α na doadora, fazendo com que o cio da receptora e doadora sejam o 
mais sincrônicos possível. 
 
Uso do GnRH e suas associações 
Um protocolo muito usado para sincronizar a ovulação de receptoras é conhecido como 
OVSYNCH e consiste no seguinte esquema (Esquema 1) de tratamento: 
 
 
 
 
4 
 
Esquema 1: Protocolo OVSYNCH de sincronização da ovulação. 
GnRH PGF2α GnRH TETF* 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
*Transferência de embriões em tempo fixo, Fonte: TECNOPEC. 2008 
 
A administração de GnRH e seus agonistas (GnRHa), induz a liberação de LH e FSH. 
A liberação de LH induz a ovulação ou a luteinização de grandes folículos presentes no 
momento do tratamento. A ovulação do folículo dominante permite a liberação de FSH, 
podendo ser complementado pelo GnRH exógeno, culminando com mais liberação de FSH, 
para iniciar o recrutamento de uma nova onda folicular. 
O mecanismo de ação do GnRH consiste: a primeira dose irá induzir a liberação de LH, 
resultando em ovulação ou luteinização do folículo dominante induzindo, consequentemente, 
a emergência de uma nova onda folicular dentro de 2 dias. A administração de PGF2a 7 dias 
após tem função de induzir a luteólise; 2 dias depois se administra outra dose de GnRH com a 
intenção de induzir outro pico de LH e sincronizar a ovulação do folículo dominante existente 
(MARTINEZ et al., 2001). 
O sistema OVSYNCH mostrou melhores resultados quando usados em vacas do que em 
novilhas. Resultados de outro estudo confirmaram que o GnRH nem sempre resulta em 
ovulação ou luteinização do folículo dominante em novilhas. Vale ressaltar que a emergência 
folicular será efetiva somente quando o tratamento causar ovulação (MARTINEZ et al., 
1999). Para novilhas têm se obtido maior taxa na sincronização quando entre o GnRH e a 
PGF2a for administrado um implante de CIDRB (Esquema 2) visando prevenir o aparecimento 
do cio, que ocorre em muitos casos antes da segunda dose de GnRH (MARTINEZ et al., 
2001). 
 
Esquema 2: Tratamento para TETF, com OVSYNCH associado a progesterona sem a 
necessidade de detecção de cio. 
GnRH PGF2α GnRH TETF 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
 
Implante de progesterona 
Fonte: BÓ et al., 2001 
 
O início do protocolo OVSYNCH em determinado estágio do ciclo estral é associado 
com redução na fertilidade; por exemplo, se a 1º dose de GnRH for aplicada entre o D9 e D12 
do ciclo estral, a mesma pode não resultar em ovulação com conseqüente não formação do 
CL. Neste estágio vacas que possuem apenas 2 ondas foliculares, comumente possuem 
pequeno potencial de folículo dominante, que não é responsivo ao GnRH. Consequentemente, 
não há formação de um CL 2 a 4 dias após a injeção de GnRH. O ciclo segue normalmente 
com a secreção de PGF2α uterina causando a luteólise, sem o aparecimento de cio induzido e 
sim fisiológico. Outra fase crítica para o uso do OVSYNCH é quando o ovário se encontra no 
metaestro. Neste estágio, houve uma ovulação fisiológica prévia e o potencial do folículo 
5 
 
dominante ainda é pequeno e não é responsivo ao LH (< 9 mm), não havendo resposta à 
aplicação do GnRH (MOREIRA et al., 2000). 
Algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para minimizar o número de vacas que se 
encontram nestes estágios críticos do ciclo estral no início do tratamento OVSYNCH. Um 
método é a aplicação de 2 doses de PGF2α com intervalo de 11 - 12 dias entre as doses, em 
um intervalo de 14 dias antes do início do tratamento com OVSYNCH. Com este tratamento 
se todas as vacas estiverem ciclando espera-se que 90% das vacas estejam no momento ideal 
para começar o protocolo. 
 
Associação de progestágenos e estradiol 
A função principal do estradiol é de induzir a regressão dos folículos antrais em 
crescimento. Os resultados mais eficazes foram obtidos quando o estradiol foi aplicado até 1 
dia depois da inserção do implante de progesterona. 
O mecanismo pelo qual o estradiol causa regressão folicular envolve a inibição do FSH, 
até que o estradiol seja metabolizado. A partir de então, o FSH volta a aumentar seus níveis e 
uma nova onda folicular é recrutada. A dose de 5 mg de E2, causa uma emergência folicular 4 
dias após sua aplicação. O benzoato de estradiol (BE) na dose de 5 mg possui efeito similar, 
além do que demonstra atividade luteolítica.Os ajustes nos protocolos são controversos, mas 
tem-se notado uma maior sincronização da emergência folicular, quando o BE é aplicado no 
D0 juntamente com 50 mg de P4, do que quando é aplicado apenas BE, mesmo sem ter sido 
observados aumentos nas taxas de prenhez (MOREIRA et al., 2001; Esquema 3) 
 
Esquema 3: Protocolo de sincronização da ovulação associando progestágeno +BE+GnRHBE PGF2α GnRH 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
 
Implante de progesterona 
Fonte: Kastelic et al., 1996 
 
Tríbulo (2000) sugere a aplicação de CIDR-B, combinado com 2 mg de BE e 50 mg 
de P4, no dia 0 e uma aplicação de PGF2α no dia 7, ou seja, no momento da retirada do CIDR, 
e mais uma dose de 1mg de BE no D8, sendo que para todas vacas foram consideradas que o 
D9 era o dia do estro. (Esquema 4; Figura 4) 
 
Esquema 4: Protocolo de sincronização da ovulação associando progestágeno +BE 
BE + P4 PGF2α BE 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
 
Implante de progesterona ESTRO 
Fonte: Tríbulo, 2000 
 
6 
 
 
Figura 4: Protocolo TECNOPEC para TETF em receptoras cíclicas (A) e Protocolo de ovulação 
simples (B) 
 
Tratamentos que aumentam a concentração de P4 plasmática e a taxa de prenhez 
Fêmeas que falham na concepção apresentam menores níveis de progesterona do que 
aquelas que concebem. O desenvolvimento embrionário e a habilidade do concepto em 
secretar Interferon τ estão relacionados com a concentração sérica de progesterona. 
Uma forma estudada para aumentar a concentração de progesterona plasmática a 
indução de múltiplas ovulações, através da indução de um maior recrutamento folicular pela 
utilização de eCG (gonadotrofina coriônica equina) durante o protocolo de sincronização 
(Esquema 5; Figura 5) 
 
Esquema 5: Protocolo de TETF, usando Novormon® (eCG) e inovulação no D17, sem 
detecção de cio. (Prolise
®
 = PGF2α; RIC-BE
®
= BE; DIB = P4) 
BE eCG 
PGF2α 
 BE Inovulação 
TETF 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 
 
Implante de progesterona 
Fonte: TECNOPEC, 2008 
 
 
Figura 5: Protocolo TECNOPEC para superovulação de receptoras 
 
A B 
7 
 
Outro protocolo para SOV das receptoras indicado pela TECNOPEC (2008) como o de 
melhor resultado é o de inovulação em tempo fixo com Folltropin
®
. (Esquema 6; Figura 6) 
 
Esquema 6: Protocolo TECNOPEC para inovulação em tempo fixo com uso de Folltropin
® 
BE BE+PGF2α 
+FSH 
 Inovulação 
TETF 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 
 
Implante de progesterona 
 
 
Figura 6: Protocolo TECNOPEC de sincronização das receptoras com Folltropin
®
 
 
Seleção e Superovulação (SOV) das doadoras 
Entende-se por doadoras as fêmeas que de alguma forma venham contribuir para o 
ganho genético de um rebanho ou de outros que irão adquirir produtos descendentes desses 
animais. As doadoras devem ter as características superiores à média de produtividade 
encontrada no rebanho, pois assim multiplica-se qualidade. 
Vacas sadias que já atingiram a puberdade devem ser escolhidas. Doadoras que 
apresentam problemas reprodutivos, ciclo estral irregular, metrite e/ou anestro não respondem 
bem ao tratamento superovulatório. 
A SOV é o aumento do número fisiológico de ovulações, próprio de cada espécie, 
provocado através da administração exógena de gonadotrofinas. Nos bovinos, considera-se 
que houve resposta ao tratamento quando se conseguem mais de duas ovulações (PFEIFER et 
al., 2005). A SOV, portanto, é um método de estimular diversos folículos terciários a se 
desenvolverem até o estágio de pré-ovulação, com subsequente ovulação (RASI, 2005). 
A resposta das doadoras a SOV apresenta grande variabilidade tanto na taxa de 
ovulação, quanto na produção de embriões viáveis. Há grande efeito da idade da doadora, do 
coeficiente de endogamia da doadora, da ordem de colheita, da dose da droga e do número de 
inseminações sobre esses resultados (PEIXOTO et al., 2002). As doadoras podem ser 
superovuladas repetidamente a cada 40 dias, durante um período de 1 a 2 anos, com 
resultados satisfatórios (HASLER, 2003). 
O hormônio mais usado atualmente para tratamentos superovulatórios em bovinos é o 
FSH, comercialmente representados no Brasil pelo Pluset
®
 e Foltropin
®
. 
8 
 
Protocolos de SOV e IA das doadoras usando cio natural: 
Utilizando o cio natural realizam-se oito aplicações de FSH com intervalos de 12 horas, 
para aumentar o recrutamento dos folículos e no 3° dia da SOV, realizam-se duas aplicações 
de PGF2α promovendo a luteólise, para que haja redução da P4 e consequente pico de LH, 
ocorrendo assim a ovulação (Esquema 7; RASI, 2005). 
 
Esquema 7: Protocolo de SOV baseado no cio natural associado com FSH + PGF2α 
DIA 0 10 11 12 13 14 15 
MANHÃ CIO FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH CIO IA 
TARDE FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH IA 
Fonte: Rasi, 2005 
 
E2 + Implante de P4: 
O uso de P4 e E2 em protocolos foi um grande avanço para a biotecnologia da 
reprodução animal, permitindo que a SOV fosse iniciada em fases aleatórias do ciclo estral 
dos bovinos pelo fato de sincronizar o início da onda folicular. Esses protocolos são tão 
eficazes no gado taurino quanto no zebuíno (BARUSELLI et al., 2006). O BE, em protocolos 
de SOV, é utilizado com a função de suprimir o desenvolvimento folicular, e sua resposta é 
mais eficaz quando combinada com aplicação de P4 IM na introdução de implante vaginal, 
CIDR
®
, de P4 (Esquema 8; RASI, 2005). 
 
Esquema 8: Protocolo de SOV com E2+P4+ CIDR+PGF2α ( 8 a 12 dias após o cio) 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 
MANHÃ P4 + E2 
+CIDR IN 
FSH FSH FSH 
 
FSH 
CIDR OUT 
CIO IA 
TARDE FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH IA 
Fonte: Rasi, 2005 
 
Inseminação com tempo fixo 
Nem sempre a ovulação está sincronizada nos tratamentos de SOV e, portanto há 
dificuldade no acerto das inseminações realizadas, levando á recuperação de inúmeras 
estruturas não fecundadas. O GnRH tem sido utilizado para controle da ovulação no final 
destes protocolos, assim como o LH (Esquemas 10, 11 e 12). 
 
Esquema 10: Protocolo de SOV baseado no cio natural associado com FSH + PGF2α e 
GnRH/LH para a inseminação em tempo fixo. 
DIA 0 10 11 12 13 14 15 
MANHÃ CIO FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH 
 
GnRH / LH IA 
TARDE FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH IA 
 
 
9 
 
Esquema 11: Protocolo de SOV com E2+P4+ CIDR+PGF2α ( 8 a 12 dias após o cio) + 
Gnrh/LH para a inseminação em tempo fixo 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 
MANHÃ P4 + E2 
CIDR IN 
FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH 
CIDR OUT 
GnRH / LH IA 
TARDE FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH IA 
 
Esquema 12: Protocolo de SOV com aspiração folicular + CIDR e GnRH/LH para a 
inseminação em tempo fixo. 
DIA 0 2 3 4 5 6 7 
MANHÃ FSH FSH FSH 
 
FSH 
CIDR OUT 
GnRH / LH IA 
TARDE AspiraçãoCI
DR IN 
FSH FSH FSH 
PGF2α 
FSH IA 
 
Segundo Manual da Tecnopec (2008) o protocolo de TETF para doadoras taurinas 
consiste em aplicar no dia do início do protocolo (D0) 3ml de BE (Ric-BE
®
) e inserir um 
dispositivo de liberação de P4 (Primer
®
), no D4 iniciar a SOV com 8 doses de FSH 
(Folltropin
®
) aplicadas de 12/12 horas, no D6 as 18h se usa PGF2α (Prolise
®
), no D7 às 18h se 
retira o dispositivo de liberação de P4, no D8 as 18h usa-se LH (Lutropin
®
), no D9 se faz duas 
IA sendo uma as 6h e outra as 18h. A coleta dos embriões é realizada no D15 (Esquema 13). 
 
Esquema 13: Protocolo TETF doadoras taurinas 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 15 
 
MANHÃ 
Inserir 
PRIMER 
+ 3ml 
RIC-BE 
Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin 
 
 IA 
 
Coleta de 
embriões 
 
TARDE 
 Folltropin Folltropin Folltropin 
+ 2ml 
Prolise 
Folltropin 
Retirada 
PRIMER 
Lutropin IA 
Fonte: TECNOPEC, 2008. 
 
Já o protocolo recomendado para SOV em doadoras zebuínas é diferente das doadoras 
taurinas, onde o indutor de ovulação (LH) é aplicado com 12 horas de antecedência e as IAs 
também sãoadiantadas 12 horas em relação às doadoras taurinas (Esquema 14). 
 
Esquema 14: Protocolo TETF doadoras zebuínas 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 15 
 
MANHÃ 
Inserir 
PRIMER 
+ 3ml 
RIC-BE 
Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin 
 
Lutropin IA 
 
Coleta de 
embriões 
 
TARDE 
 Folltropin Folltropin Folltropin 
+ 2ml 
Prolise 
Folltropin 
Retirada 
PRIMER 
IA 
Fonte: TECNOPEC, 2008. 
 
 
10 
 
Coleta de Embriões 
A lavagem uterina é realizada 6 a 8 dias após manifestação do cio do tratamento 
superovulatório. 
A coleta normalmente é realizada com o animal posicionado em estação, por método 
transcervical, utilizando-se um sistema fechado. Realiza-se anestesia epidural, utilizando-se 2 
a 4 ml de lidocaína 2% e limpeza do reto e região da vulva. Utiliza-se um cateter de silicone 
contendo um balão inflável na sua extremidade distal, guiado inicialmente por um mandril de 
metal em seu lúmen para torná-lo rígido, para que o cateter seja introduzido e posicionado em 
um dos cornos uterinos. Remove-se o mandril e infla-se o balão com 10 a 20 ml de ar, para 
evitar refluxo de líquido durante a lavagem. O balão deve estar no terço médio do útero, para 
que a lavagem seja realizada no terço final. O cateter é acoplado a um equipo ligado a uma 
bolsa de um litro de PBS e a um filtro próprio para embriões. Todo o equipamento está 
disponível comercialmente com custos acessíveis. Lava-se cada corno uterino 
aproximadamente 10 vezes, massageando levemente, utilizando-se 500ml de PBS para cada. 
O PBS deve estar numa temperatura de 25 a 30ºC (ambiente). Manter 2-3 cm de líquido no 
filtro durante a lavagem, para que as estruturas não grudem no fundo. O filtro com as 
estruturas coletadas deve seguir para o laboratório (Figura 7). 
 
Figura 7: Lavagem uterina para coleta de embriões 
 
Rastreamento e classificação de embriões 
O conteúdo do filtro é transferido para placa de Petri previamente quadriculada para 
procura dos embriões. Realiza-se 2 procuras completas removendo todas as estruturas viáveis 
e inviáveis encontradas. Estas estruturas são transferidas para outra placa de Petri contendo 
gotas de BSA 0,4%. Os embriões viáveis encontrados são lavados pelo menos 10 vezes em 
gotas de solução de BSA 0,4%, como recomendação da IETS (International Embryo Transfer 
Society), para remoção de agentes que podem estar aderidos à zona pelúcida. 
Critérios para avaliação de embriões bovinos (IETS, 1998): 
EXCELENTE ou BOM – GRAU I – estágio de desenvolvimento corresponde ao 
esperado; massa embrionária simétrica e esférica com blastômeros individuais que são 
uniformes em tamanho, cor e densidade; forma regular, a ZP não deve apresentar superfície 
côncava ou plana, deve ser lisa e, preferencialmente intacta; menos de 15% de células 
extrusadas. 
11 
 
REGULAR – GRAU II - estágio de desenvolvimento corresponde ao esperado; forma 
regular, ZP intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária ou 
no tamanho;pelo menos de 50% das células compõem massa embrionária viável; menos de 
15% de células extrusadas. 
POBRE – GRAU III - estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado; 
irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho; menos de 75% 
das células degeneradas; pelo menos 25% das células compõem massa embrionária viável. 
MORTO OU DEGENERADO – GRAU IV - estágio de desenvolvimento não 
corresponde ao esperado, embrião em degeneração; massa embrionária de menos de 25% de 
todo material celular presente no interior da ZP. 
 
Transferência dos embriões: 
Somente embriões classificados como grau I a III devem ser transferidos para 
receptoras. A transferência, de preferência deve ser realizada por via transcervical. O embrião 
precisa ser previamente acomodado no centro de uma palheta de 0,25ml com BSA, como 
mostra a Figura 8. 
 
 
Figura 8: Esquema de palheta contendo embrião 
 
As receptoras devem estar sincronizadas com a idade do embrião, ou seja, se o embrião 
tem 7 dias, a receptora deve ter ciclado 7±1 dias atrás. Antes de transferir os embriões, avaliar 
o CL da receptora, confirmando assim a ovulação. A TE ou inovulação consiste na deposição 
do embrião no terço médio-final do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo. Através de 
aplicador, semelhante ao utilizado na inseminação artificial, passa-se a cérvix, realizando-se a 
inovulação o mais cranialmente possível, na luz do corno uterino ipsilateral ao CL. Possibilita 
inovular muitas receptoras por dia com baixos custos, por isso é a técnica mais utilizada a 
campo. 
 
Produção in vitro de Embriões Bovinos 
 
As diversas vantagens e aplicações da produção in vitro de embriões (PIV) estão 
relacionadas à: determinação e controle do sexo dos produtos; aumento da eficiência dos 
programas de produção; rápidas e melhores possibilidades para executar programas de 
cruzamento; avaliação do efeito materno sobre a descendência; rápida multiplicação de raças; 
facilidade de importação e exportação de material genético da fêmea; formação de bancos de 
gametas congelados; aumento da eficiência do sêmen congelado de alto valor genético; e 
estudo e desenvolvimento de outras biotécnicas reprodutivas a partir da micromanipulação de 
gametas e embriões (GONÇALVES et al., 2002). 
Gonçalves et al. (2007) afirmam que o advento da aspiração folicular in vivo ou OPU 
(ovum pick up; Figura 9) e o aprimoramento das condições de cultivo in vitro tornaram viável 
à aplicação da PIV em escala comercial. Os índices atuais de blastocistos obtidos com a 
técnica de produção in vitro de embriões giram em torno de 20 a 50% (média de 35%). 
ALGODÃO AR AR BSA BSA BSA 
12 
 
Segundo Gonçalves et al. (2002), cada fêmea bovina é capaz de produzir 50 a 100 
embriões/ano, com um regime de duas punções semanais por doadora, durante vários meses. 
 
Figura 9 – Esquematização da metodologia de Ovum pick up (OPU). 
 
Coleta dos Complexos cumulus oócitos (CCOs): 
A OPU apresenta uma maior flexibilidade em relação a TE, pois permite a obtenção de 
oócitos de fêmeas a partir dos 6 meses de idade (ainda com resultados inferiores nessa idade), 
de vacas prenhes até o terceiro mês de gestação ou mesmo após o parto. 
A aspiração folicular duas vezes por semana produz uma maior percentagem de 
embriões grau 1 e um maior número de embriões transferíveis do que aspirações realizadas 
uma vez por semana (GIBBONS et al., 1994). No entanto, a aspiração folicular semanal de 
animais da raça Nelore pode produzir um bezerro por semana via PIV (WATANABE et al., 
1998), isso demonstra a capacidade da associação OPU/FIV em multiplicar de maneira rápida 
e eficiente animais geneticamente superiores. 
Além da OPU, a obtenção de oócitos a partir de ovários de abatedouro é uma 
ferramenta de grande valia para pesquisa. Metodologias de recuperação como slicing e 
aspiração folicular com agulha hipodérmica acoplada a uma seringa ou a uma bomba de 
vácuo proporcionam número suficiente de oócitos com boa morfologia para estudos in vitro 
(GONÇALVES et al., 2007). 
 
Classificação de oócitos: 
Os complexos cumulus-oócito (COC´s) coletados devem ser separados em quatro 
categorias, de acordo com as características baseadas na compactação e transparência das 
células do cumulus e homogeneidade e transparência do ooplasma, utilizando o sistema de 
classificação descrito por Leibfried & First (1979). Consideram-se COC´s viáveis os de 
classificação I a III, sendo os COC´S de classe IV descartados. 
Grau I: Oócitos com cumulus compacto e mais de três camadas de células. Ooplasma 
com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração 
marrom(Figura 10A). 
Grau II: Oócitos com menos de três camadas de células do cumulus oophorus. 
Ooplasma com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais concentradas 
no centro e mais claras na periferia ou condensadas em um só local aparentando uma mancha 
escura. O ooplasma preenche todo espaço interior da zona pelúcida (Figura 10B). 
13 
 
Grau III: Oócitos que possuem o cumulus presente, mas expandido. Ooplasma 
contraído, com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo 
irregularmente o espaço perivitelino, degenerado, vacuolizado ou fragmentado (Figura 10C). 
Grau IV: Oócitos desnudos sem células do cumulus, citoplasma com cor e granulação 
anormais ou com células expandidas com aspecto apoptótico (Figura 10D). 
 
Figura 10 – Classificação de Oócitos. 
 
Maturação in vitro: 
Para que o oócito seja capaz de ser fecundado e posteriormente se desenvolver até o 
estágio de blastocisto, precisa ser maturado e, durante essa fase, sofrer diversas 
transformações tanto em seu citoplasma quanto em seu núcleo. Durante todo o seu 
desenvolvimento, o oócito se encontra no estágio diplóteno da prófase I ou estádio de vesícula 
germinativa (VG). In vivo, o reinício da meiose, ou maturação, tem início após o pico 
préovulatório de LH durante o estro e, in vitro, a retirada do oócito do contato com as células 
foliculares é suficiente para dar início ao processo de maturação nuclear. A maturação nuclear 
do oócito compreende a progressão do estágio diplóteno da primeira prófase meiótica até a 
fase de metáfase II (MII). Em bovinos, o período de maturação varia de 18 a 24 horas em 
atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em ar e umidade saturada (GONÇALVES et al., 
2007). 
Diferentes condições de cultivo e protocolos já foram testadas in vitro para a maturação 
de oócitos, vários meios de maturação, tais como fluído sintético de oviduto (SOF; GANDHI 
et al., 2000;), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham’s F-10, Ham’s F-12 
(SMETANINA et al., 2000) e meio de cultivo tecidual 199 (TCM 199), têm sido utilizados. 
 
Fertilização in vitro: 
O co-cultivo (espermatozóide e oócito) é realizado em temperatura de 39 °C, atmosfera 
com 5% de CO2 e umidade saturada. Os espermatozóides viáveis contidos em uma palheta de 
sêmen precisam ser separados do plasma seminal, crioprotetores, extensores e dos 
espermatozóides mortos antes de serem co-cultivados com os oócitos. Em bovinos, os 
métodos de separação espermática mais utilizados são o gradiente de PERCOLL e o swim-up. 
Após a separação, os espermatozóides são diluídos a uma concentração de 1 a 5 x 10
6
 sptz/ml 
de meio (GONÇALVES et al., 2007). 
O co-cultivo (espermatozóide e oócito) é realizado em temperatura de 39 °C, atmosfera 
com 5% de CO2 e umidade saturada. Os espermatozóides viáveis contidos em uma palheta de 
sêmen precisam ser separados do plasma seminal, crioprotetores, extensores e dos 
espermatozóides mortos antes de serem co-cultivados com os oócitos. Para bovinos, os 
métodos de separação espermática mais utilizados são o gradiente de PERCOLL e o swim-up. 
14 
 
Após a separação, os espermatozóides são diluídos a uma concentração final de 1 a 5 x 10
6
 
espermatozóides viáveis/ml de meio (GONÇALVES et al., 2007). 
 
Cultivo in vitro de embriões: 
Em alguns laboratórios o co-cultivo de embriões com células somáticas foi utilizado por 
muitos anos com bons resultados. Entretanto, esse sistema tem sido substituído ao longo do 
tempo por sistemas mais simples que utilizam meios semi-definidos como os meios Charles 
Rosenkrans-1 (CR-1), Charles Rosenkrans-2 (CR-2; ROSENKRANS et al.,1993), meio 
simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) e fluído sintético de oviduto (SOF) 
associados a uma atmosfera gasosa controlada contendo baixa tensão de oxigênio 
(GONÇALVES et al., 2007). Fatores de crescimento como o fator de crescimento semelhante 
à insulina (IGF-1) e fator de crescimento e transformação β1 (TGFβ1) têm sido adicionados 
ao meio de cultivo in vitro objetivando melhorar o desenvolvimento embrionário (MATSUI et 
al., 1997). 
O tempo de cultivo in vitro varia de 7-9 dias, dependendo do objetivo da rotina de PIV, 
em temperatura de 39 ºC com atmosfera controlada (5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2) e 
umidade saturada. A taxa de blastocisto geralmente é avaliada no 7º dia de cultivo in vitro 
sendo que, os blastocistos produzidos podem permanecer na estufa de cultivo até o 9º dia caso 
se deseje avaliar a taxa de eclosão in vitro (GONÇALVES et al., 2007). 
 
Micromanipulação de Embriões 
 
Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos permitiram uma 
maior participação da fêmea bovina no processo de melhoramento genético do rebanho. Isso 
porque o número de descendentes deixados por uma única fêmea ao longo de sua vida 
reprodutiva aumentou significativamente com o aperfeiçoamento das técnicas de transferência 
e produção in vitro de embriões, entretanto, uma das principais desvantagens da PIV ainda 
está na baixa produção e qualidade de embriões (GONÇALVES et al., 2007) levando a baixas 
taxas de gestação após inovulação, além do elevado custo de produção de cada embrião. 
Nesse contexto, a produção de animais geneticamente idênticos é de grande utilidade à 
indústria pecuária, principalmente por aumentar o número de descendentes de pais 
geneticamente valiosos. Além disso, o uso de animais monozigóticos em vários estudos 
comparativos reduziria substancialmente o número de animais necessários para a geração de 
dados estatisticamente válidos (YANG & ANDERSON, 1992). 
 
Bipartição de Embriões: 
Apenas 25% da massa celular total do embrião é requerida para manter sua viabilidade 
embrionária. Neste caso embriões bipartidos podem manter ainda razoável capacidade de 
desenvolvimento (WILLADSEM & POLGE, 1981). 
Uma das aplicações da micromanipulação de embriões estaria relacionada à 
possibilidade de obtenção de células para análises genéticas, como determinação de sexo, 
diagnóstico e prevenção de disseminação de doenças genéticas entre outras (GARCIA & 
RODRIGUES 2002). 
15 
 
A bipartição de embriões com finalidades comerciais iniciou-se em meados da década 
de 80 (BAKER & SHEA, 1985). A partir deste período, vislumbrou-se a possibilidade de 
aumentar a progênie de machos e fêmeas pela coleta e posterior bipartição de embriões. 
Diferentes protocolos têm sido empregados para bipartição de embriões de bovinos, ovinos, 
caprinos e outras espécies (HERR et al., 1990). 
Para o processo de bipartição, os embriões selecionados são transportados para placa de 
Petri e lavados 4 vezes em solução de PBS, visando à remoção de todo o conteúdo protéico da 
superfície da ZP. 
Com o auxílio de um estereomicroscópio com base de transiluminação acoplado a um 
dispositivo de micromanipulação mecânico, cada estrutura é posicionada de forma a permitir 
uma divisão o mais equitativa possível da massa embrionária, objetivando a separação do 
embrião em duas metades com a maior semelhança. Este procedimento simplificado de 
bipartição embrionária utiliza lâmina metálica de microcirurgia (Figura 11). 
Os embriões podem ser bipartidos nas fases de mórula, blastocisto inicial e blastocisto. 
Embriões na fase de mórula podem ser bipartidos em qualquer sentido. Aqueles na fase de 
blastocisto são divididos de forma a se obter metades equitativas da blastocele e botão celular. 
 
Figura 11 – Sequência de Bipartição de uma mórula. 
 
Separação de Blastômeros: 
A totipotência dos blastômeros isolados ou em grupos pequenos já foi relatada, 
principalmente com células originadas de embriões de 2 a 8 células. Para embriões com 
estágio de desenvolvimento mais adiantado a totipotênciaé dependente de um grupo maior de 
células (WILLIANS et al., 1984). 
A separação dos blastômeros de embriões de 2 ou 4 células pode ser obtida pela ruptura 
da zona pelúcida e posterior proteólise ou separação mecânica. Uma vez rompida a zona 
pelúcida, os blastômeros podem ser separados por repetidas aspirações e retorno do conteúdo 
para uma placa de Petri com meio de cultivo apropriado (LINDSEY, 2001). 
Tagawa et al. (2008) utilizaram processos enzimáticos e mecânicos para a separação de 
blastômeros de embriões bovinos. Estes autores expuseram os embriões em estágio de 2 
células à pronase durante 1 a 2 minutos, para remoção da zona pelúcida. 
Quando cultivados em WOW (Well of the well culture system), os blastômeros de 
embriões bovinos de oito células produzidos in vitro, mesmo após separação em duas 
metades, mostraram a mesma capacidade de desenvolver para o estágio de blastocisto quanto 
os embriões de oito células intactos cultivados pelo método padrão de cultivo in vitro. Além 
disso, uma alta taxa de gestação foi obtida com a transferência desses blastocistos (TAGAWA 
et al., 2008). 
 
16 
 
Referências 
 
BAKER, R.D.; SHEA, B.F. Commercial splitting of bovine embryos. Theriogenology. v.23, 
p.3-12, 1985. 
 
BARUSELLI, P. S.; GIMENES, L. U.; SALES, J. N. S. Revista Brasileira de Reprodução 
Animal. Fisiologia reprodutiva de fêmeas taurinas e zebuínas, Belo Horizonte, v.31, 
n.2, p.205-211, abr./jun. 2007. < www.cbra.org.br >. 
 
BARUSELLI, P. S.; SÁ FILHO, M. F.; MARTINS, C. M.; NASSER, L. F.; NOGUEIRA, M. 
F.; BARROS, C. M.; BÓ, G. A. Superovulation and embryo transfer in Bos taurus indicus 
cattle. Departament of Animal Reproduction, FMV-USP. São Paulo-SP, v.7. n. 65, p. 
77-88. Jan. 2006. 
 
BÓ, G.A.; TRÍBULO, H.; CACCIA, M.; TRÍBULO, R. Pregnancy rates in embryo recipients 
treated with progesterone vaginal devices and transferred without estrus detection. 
Theriogenology. v. 55, p. 357 (abstr), 2001. 
 
BORGES, A.M.; TORRES, C.A.A.; ROCHA JUNIOR, V.R.; RUAS, J.R.M.; CARVALHO, 
G.R. Dinâmica folicular ovariana em novilhas mestiças Holandês-Zebu. Arquivo 
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.53, n.5, p.1-13. 
2001. 
 
FIGUEIREDO, J.R.; CELESTINO, J.J.H.; RODRIGUES, A.P.R.; SILVA, J.R.V. 
Importância da biotécnica de MOIFOPA para o estudo da foliculogênese e produção in 
vitro de embriões em larga escala. Revista Brasileira de Reproduçao Animal. v.31, 
p.143-152, 2007. 
 
FLORIANI, A. R. Efeito de progesterona e benzoato de estradiol na dinâmica folicular e 
produção in vitro de embriões bovinos. Universidade Federal de Minas Gerais Escola de 
Veterinária Programa dos Cursos de Pós-Graduação, 2006. Tese (Doutorado)- apresentada 
à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. 
 
GANDHI, A. P.; LANE, M.; GARDNER, D. K.; KRISHER, R. L. A single medium supports 
development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. Human 
Reproduction. v.15, p.395-401, 2000. 
 
GARCIA, J.F.; RODRIGUES, J.L. Practical considerations of embryo manipulation: 
preimplantation genetic typing. Proceedings of the satellite symposium of the International 
Embryo Transfer Society: Practical considerations in dealing with embryos, Foz do 
Iguassu, Brazil, 16 January 2002. Theriogenology, v.56, n. 9, 1393-1399, 2002. 
 
 
17 
 
GIBBONS, J. R.; BEAL, W. E.; KRISHER, R. L.; FABER, E. G.; PEARSON, R. E.; 
GWAZDAUSKAS, F. C. Effects of once- versus twice-weekly transvaginal follicular 
aspiration on bovine oocyte recovery and embryo development. Theriogenology, v.42, 
p.405-419, 1994. 
 
GONÇALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotécnicas aplicadas à 
reprodução animal. São Paulo: Varela, v.1. 2002. 
 
GONÇALVES, P. B. D.; BARRETA, M. H.; SANDRI, L. R.; FERREIRA, R.; 
ANTONIAZZI, A. Q. Produção in vitro de embriões bovinos: o estado da arte. Revista 
Brasileira de Reprodução Animal. v.31, p.212-217, 2007. 
 
HASLER, JF. The current status and future of commercial embryo transfer in cattle. Animal 
Reproduction Science, v.79, n.3, p.245-264, 2003. 
 
HERR, C.; HOLT, N.; PIETRZAK, Y. Increased number of pregnancies per collected 
embryo by bisection of blastocysts stage ovine embryos. Theriogenology, v.33, p.244, 
1990. 
 
IETS. Manual da sociedade internacional de transferência de embriões. 3 ed. Illinois 
Stringfellow, D.A. & Seidel, S.M., 1998, 180p. 
 
KASTELIC, J.P.; MCARTNEY, D.H.; OLSON, W.O.; BARTH, A.D.; GARCIA, A.; 
MAPLETOFT, R.J. Estrus syncronization in cattle using estradiol, melengestrol acetate 
and PGF. Theriogenology. v. 46, p. 295-1304. 1996. 
 
LEIBFRIED, L.; FIRST, N. L. Characterization of Bovine Follicular Oocytes and Their 
Ability to Mature In Vitro. Journal of Animal Science. v.48, p.76-86, 1979. 
 
LINDSEY, B.R., I Workshop de sexagem de embriões bovinos. Campinas – SP, 08 e 09 de 
novembro de 2001, p.2-10, 2001. 
 
MANUAL DE SUPEROVULAÇÃO E TRANFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM TEMPO 
FIXO (SOVTF/TETF) Tecnopec, 2008. Disponível em: <http: www.tecnopec.com.br> 
 
MARTINEZ, M.F.; ADAMS, G.P.; BERGFELT, D.; KASTELIC, J.P.; MAPLETOFT, R.J. 
Effect of LH or GnRH on the dominant follicle of the first wave in heifers. Anim. 
Reprod. Sci. v. 57, p. 23-33, 1999. 
 
MARTINEZ, M.F.; KASTELIC, J.P.; ADAMS, G.P.; COOK, R.B.; OLSON, W.O.; 
MAPLETOFT, R.J. The use of progestins in regimens for fixed-time artificial 
insemination in beef cattle. Theriogenology. 2001. 
 
18 
 
MATSUI, M.; TAKAHASHI, Y.; HISHINUMA, M.; KANAGAWA, H. Stimulation of the 
development of bovine embryos by insulin and insulin-like growth factor-I (IGF-I) is 
mediated through the IGF-I receptor. Theriogenology, v.48, p.605-616, 1997. 
 
 
MOREIRA, F.; ORLANDI, C.; RISCO, C.; LOPES, F.; MATTOS, R.; THATCHER, W.W. 
Pregnancy rates to a timed insemination in lacting dairy cows pre-syncronized and treated 
with bovine somatotropin: Cyclic versus anestrus cows. J dairy Sci. v. 83, (Suppl.), p. 1-
134, 2000. 
 
NASSER, L. F. T. Resposta superovulatória na primeira onda de crescimento folicular 
em doadoras Nelore (Bos taurus indicus). 2006, 80f. tese (Doutorado) - USP . FMVZ. 
Departamento de reprodução animal, São Paulo. 
 
PEIXOTO, M.G.C.D.; FONSECA, C.G.; PENNA, V.M.; ALVIM, M.T.T. Multivariate 
analysis of multiple ovulation followed by embryo transfer results from zebu donors. 
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. v.54, n.5. 2002. Disponivel 
em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sciarttex&pid=S0102-09352002000500007& 
Ing=en&nrm=iso&tlng=pt > 
 
PFEIFER, L. F. M.; CORRÊA, M. N .; PINESCHI, L. E. Universidade Federal de Pelotas: 
Alternativas hormonais para programas de transferência de embriões em bovinos, 
Faculdade de Veterinária, 2005. 
 
PRESTES, N. C.; ALVARENGA, F.C.L. Fecundação e Clivagem. In: ALVARENGA, F.C.L. 
Obstetrícia Veterinária. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. cap. 1, p. 1-19. 
 
RASI, F. P. A. Técnicas de superovulação, colheita e transferência de embriões em 
bovinos. 2005. 27f. Dissertação (mestrado)- Faculdade de Medicina Veterinária e 
Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu. 
 
REIS, E. L. Reprodução Animal: Efeito da dose e do momento da administração de 
gonadotrofina coriônica eqüina no protocolo de sincronização da ovulação para T. E. 
T. F. 2004. 101f. Dissertação (Mestrado) - FMVZ departamento de Reprodução animal, 
São Paulo. 
 
ROSENKRANS Jr, C.F.; ZENG, G.Q.; McNAMARA, G.T.; SCHOFF, P.K.; FIRST, N.L. 
Development of bovine embryos in vitro as affected by energy substrates. Biology of 
Reproduction. v.49, p.459-462, 1993.SMETANINA, I. G.; TATARINOVA, L. V.; KRIVOKHARDCHENNKO, A. S. The effect 
of the composition of the culture media on bovine oocyte maturation and embryo 
development in vitro. Ontogenez. v.31, p.139-143, 2000. 
 
19 
 
TAGAWA, M.; MATOBA, S.; NARITA, M.; SAITO, N.; NAGAI, T.; IMAI, K. Production 
of monozygotic twin calves using the blastomere separation technique and Well of the 
Well culture system Theriogenology. v.69, p.574–582, 2008. 
 
TRÍBULO, H.; BÓ, G.A.; GATI, G.; TEGLI, J.; MORENO, M.; BRITO, M.; TRÍBULO, R. 
Pregnancy rates in embryo recipients treated with estradiol benzoate and CIDR-B vagina 
device to eliminate the need for estrus detection. XIV Int. Congr. Anim. Reprod. v. 2, p. 
115, 2000. 
 
WATANABE, M. R.; LÔBO, R. B.; FRANCESCHINI, P. H.; DAYAN, A.; VILA, R. A.; 
GALERANI, M. A. V.; WATANABE, Y. F. Embryo in vitro production per session of 
follicular aspiration in Nelore cows. Arquivos Faculdade Veterinária UFRGS, v.26, 
p.383-1998. 
 
WILLADSEM, S.M.; POLGE, C. Attempts to produce monozygotic quadruplets in cattle by 
blastomere separation. Veterinary Records, v.108, p.211–213, 1981. 
 
WILLIANS, T.J.; ELSDEN R.P; SEIDEL, G.E. Effect of embryo age and stage on 
pregnancy rates from demi-embryos. Theriogenology, v.21, p.276, abstr., 1984. 
 
YANG, X.; ANDERSON, G.B. Micromanipulation of mammalian embryos: principles, 
progress and future possibilities. Theriogenology. v.38, p.315–335, 1992.