Av2 - Genética

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Genética molecular Av2
Na tecnologia do DNA recombinante, leva-se em consideração o isolamento de um gene específico que produz uma determinada proteína que, por sua vez, é inserida em outro organismo. Ex.: Humanos Bactérias. Permitindo assim, uma conjugação entre DNAs de origem diferente.
	A bactéria é utilizada na maioria dos casos, pois ela apresenta uma replicação muito mais acelerada, permitindo aumentar o gene ou/e a proteína de forma mais acelerada.
Enzimas de restrição
 Também chamadas de endonucleases de restrição, sendo enzimas normalmente presentes nas bactérias, tendo uma função de proteção. Logo, quando uma bactéria é atacada por vírus, por bacteriófagos, estas enzimas cortam o DNA desses vírus. Essas enzimas de restrição são altamente específicas, reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de bases. Elas irão atuar catalisando a destruição da ligação fosfodiéster entre nucleotídeos.
	Devido à especificidade da sequência de determinada molécula de DNA, cada enzima de restrição gera um conjunto único de fragmentos.
Elas foram isoladas das bactérias, existindo mais de 200 enzimas que são comercializadas para utilização na engenharia genética ou biotecnologia, como a tecnologia do DNA recombinante e na análise de mutação pontual. Podem ser de 3 tipos: I, II e III.
	Obs: Na técnica do DNA recombinante, genes específicos do DNA humano são cortados através das enzimas de restrição assim como no DNA bacteriano, e posteriormente haverá a ligação dos dois através de enzimas específicas (proteína ligase). Contendo DNA humano, as bactérias podem produzir proteínas humanas, e isso tem grande importância, como por exemplo, a produção da insulina. 
	Os cortes feitos pelas enzimas de restrição podem ser abruptos ou coesivos:
Cortes abruptos: Acontecem no mesmo eixo de simetria, gerando duas partes iguais.
Cortes coesivos: Acontecem nas extremidades, gerando moléculas com tamanhos diferentes. 
Izoesquisômeros: Diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento. Diferem nas condições ótimas de reação, na estabilidade.
	Com a técnica do PCR, as enzimas de restrição além de utilizadas no DNA recombinante, passaram a ter outra aplicação dentro do diagnóstico genético que é a delimitação de uma mutação pontual. Logo, mesmo com diferentes tipos de mutação, as deleções e inserções ficam claras, pois existe uma diferença na quantidade de nucleotídeos que compõem determinada sequência. 
Mutação pontual: Mutação em determinado ponto que ocorre pela troca de um nucleotídeo por outro (transição e transversão).
As mutações pontuais por transição e transversão podem gerar uma alteração ou um fenótipo normal, nesse caso, são ditas silenciosas (o nucleotídeo alterado irá decodificar o mesmo aminoácido). Podem ser de sentido trocado, quando o novo nucleotídeo decodifica um aminoácido diferente; ou “no sense” /STOP códon, quando o nucleotídeo gera um códon de parada.
	Não é possível identificar uma mutação pontual entre 2 indivíduos utilizando a eletroforese (só deleções). O mecanismo utilizado para isso é o PCR + enzimas de restrição. Com a inserção da técnica do PCR estas enzimas puderam ser utilizadas na identificação de mutação pontual. Pois estas enzimas agem reconhecendo sequências mutadas e promovendo um corte na região, possibilitando a identificação de dois indivíduos com mutação pontual. 
	A nomenclatura das enzimas de restrição é feita a partir da bactéria da qual ela é isolada. Ex.: Enzima isolada da E. Coli é comercializada com o nome de Eco, podendo apresentar um número ao final do nome, que representa a linhagem desta enzima. 
Eletroforese
A eletroforese é uma técnica que permite a separação das moléculas de acordo com a carga e o tamanho (peso molecular) de cada uma. Ela é utilizada para que através do produto originado pelas enzimas de restrição, se possa identificar uma mutação pontual. 
É um aparato composto por tula, que apresenta um catodo e um anodo, que são pólos para diferenciar a molécula de acordo com a carga. Ao colocar uma molécula de DNA em um dos pólos, este deverá ser considerado negativo (devido a característica negativa do DNA graças ao seu grupamento fosfato), e o outro pólo será o positivo. As moléculas que apresentam peso menor irão migrar mais rapidamente através do gel, ficando mais próximas ao pólo positivo; enquanto que moléculas com peso molecular maior irão ficar mais próximas ao pólo negativo. O gel utilizado é coberto por uma solução tampão, que permite a passagem dos íons e de moléculas através do gel.
A eletroforese, diferente do PCR, promove uma diferença qualitativa e não quantitiva, pois mostra apenas se o indivíduo é homozigoto ou heterozigoto para determinada característica. Como foi dito, não é possível identificar a partir dessa técnica mutações pontuais, somente se usada as enzimas de restrição associadas ao PCR.	 
Exemplo de eletroforese:
Indivíduo selvagem: A A C C G G T C G
Indivíduo mutante: A T / C C G G T C G
Inicialmente as moléculas de DNA/proteínas são clivadas a partir da ação das enzimas de restrição, assim, haverão moléculas com pesos diferentes. No indivíduo mutante haverá o reconhecimento da alteração no DNA através da enzima de restrição, que promoverá o corte (nesse caso um corte coesivo) na região T C.
No indivíduo 1, observa-se que a molécula possui o maior peso molecular. Isso mostra que a molécula de DNA não foi clivada, e o indivíduo possui os 9pb em ambos os alelos (que se sobrepõem na eletroforese, pois possuem o mesmo peso). Como os alelos são iguais, o indivíduo é homozigoto normal.
O indivíduo 2 não possui os 9pb, o que sugere uma mutação. As enzimas de restrição identificaram a mutação e clivaram ambos os seus alelos, que apresentam agora dois fragmentos cada, um com 2pb e outro com 7pb. Nesse caso, ele é homozigoto mutado.
O indivíduo 3, possui tanto os 9pb quanto os dois fragmentos clivados, ou seja, seus dois alelos têm pesos diferentes, o que sugere que ele seja heterozigoto. 
Se a doença em questão possuísse padrão dominante, tanto o indivíduo 2 quanto o 3 possuiriam a doença. Porém, se a doença possuísse padrão recessivo, somente o indivíduo 2 (homozigoto mutado) apresentaria a doença. 
Lembra-se que na eletroforese não é possível analisar a sequência em questão, apenas o tamanho do fragmento! Em caso de troca de uma base por outra, embora as bases apresentem pesos diferentes, esta diferença é mínima para aparecer na eletroforese.
A eletroforese pode ser usada tanto para a análise de proteínas quanto para a análise de exóns. A falta de determinados éxons podem ocasionar determinadas doenças. 
PCR (reação em cadeia da polimerase)
É uma técnica in vitro que imita a replicação fisiológica. Consiste na separação do DNA, gerando dois filamentos que servirão como molde. 
	A vantagem do PCR é que a replicação só é feita em uma sequência alvo, replicando apenas genes específicos, como o da fibrose cística (gene CFTR), por exemplo. Então, essa técnica tem uma restrição quanto à replicação total. 
	Promove a amplificação do segmento de interesse, a partir da localização do gene específico a ser analisado (isso é feito pelo primer), permitindo a análise dos éxons e íntrons que o compõem. O primer serve como localizador da sequência a ser analisada e é feito a partir de nucleotídeos de DNA complementares a uma região de DNA molde, e ao ser emparelhado permite a ação da enzima Taq Polimerase.(pois a DNA polimerase não tem autonomia para a replicação do DNA) A extremidade 3’ de cada primer deverá ser mais rica em G e/ou C. 
A técnica do PCR é limitada, pois não consegue amplificar grandes regiões. No DNA extraído, todos os genes e regiões estruturais estão presentes, e o PCR permite isolar a região de interesse a partir da amplificação. A DNA polimerase nesse caso, só irá polimerizar a região para a qual foi feita para polimerizar, gerando trechos curtos e específicos. 
	Esta técnica irá permitir um aumento significativo da quantidade de DNA extraído, seja eledo sangue, esperma, osso, músculo, etc. Isso têm grande importância para a genética forense. 
	
	A PCR é homóloga a replicação do DNA, e consiste em 3 fases:
Desnaturação: É homóloga à fase de início, que consiste na abertura da dupla fita. Consiste no aumento da temperatura do DNA (de 94-96º). Isso rompe as pontes de hidrogênio, substituindo as enzimas que o faziam (helicase, topoisomerase, SSB).
Pareamento: Homóloga à adição do primer. Ocorre nessa fase uma baixa na temperatura (50-65º) para impedir que as fitas se unam novamente.(SSB) O primer adicionado é específico para determinada sequência, e é feito a partir de nucleotídeos de DNA (e não de RNA, como é feito na replicação comum), justamente pela falta de enzimas que substituam os nucleotídeos de RNA por de DNA. O primer reconhecerá a sequência que será analisada (marcação da sequência), e após a adição dele, não é mais possível que as fitas se unam.
Extensão: Novamente a temperatura é aumentada (72º) para deixar o pareamento mais específico. Nessa fase, a DNA polimerase adiciona os nucleotídeos específicos. 
Ao final de todos os ciclos, utiliza-se mais uma etapa de polimerização a 72ºC por 5min, pois podem haver trechos que não foram polimerizados. 
Recursos para o desenvolvimento do PCR:
DNA molde
Primers 1 e 2: Iniciadores para cada filamento(Leading e Lagging)
Taq DNA polimerase: Enzima que faz a extensão da cadeia (é termoestável)
dNTPs: Contêm as bases (A, T, C e G – devem estar em quantidades equivalentes para evitar erros)
Solução tampão: Mantém o pH adequado
MgCl2: Aumenta a eficiência da Taq DNA polimerase.
Termociclador: Promove um gradiente de temperatura, possibilitando diferentes temperaturas em um mesmo ciclo; permitindo que todas as etapas ocorram de forma diferente.
O PCR possui algumas limitações, pois como é homólogo ao processo de replicação, é preciso fornecer todos os recursos necessários na célula para o processo in vitro. Além disso, não é tal fiel como o processo fisiológico, pois não apresenta mecanismos de reparo da DNA polimerase Taq. 
Caso o DNA molecular seja demasiado grande são usadas enzimas de restrição.
Integralidade: O DNA deve ser extraído, quantificado em gel de agarose para observar se há degradação ou não. A presença de rastros na eletroforese indica que o DNA está degradado. 
PCR multiplex: permite que várias regiões sejam amplificadas ao mesmo tempo numa mesma amostra. Para cada éxon analisado, existe uma análise pontual, e consequentemente, um primer específico. 
Detecta deleções homozigóticas ou hemizigóticas, já que a sequência deletada não é amplificada por PCR.
Resumo
A técnica do PCR é importante na amplificação de genes específicos. Depois, as enzimas de restrição irão identificar as sequências de nucleotídeos presentes nesses genes, e em caso de mutação, promover cortes. Esses cortes irão gerar moléculas com pesos diferentes, que serão analisados na técnica da eletroforese. 
Marcadores genéticos: Qualquer segmento de DNA que apresente variabilidade na população em estudo e assim utilizado no rastreamento de uma informação. São os marcadores genéticos os segmentos de DNA utilizados na genética forense, pois são estes que permitem a identificação humana. 
	Os marcadores genéticos podem ser classificados em:
Intergênicos: Localizados entre os genes, são sequências de DNA que não têm como função a produção de proteínas e não irão codificar RNA. Portanto, esses segmentos de DNA são replicados, mas não são transcritos. São os VNTRs e STRs, sequências que se repetem, sendo que o que varia entre elas é o tamanho da sequência de repetição e o número de repetições. Os STRs são mais curtos (1-4 repetições) e os VNTRs mais longos (10-100 repetições).
VNTRs(minissatélites): Pouco utilizado na genética forense, pois como são repetições muito longas, são de difícil amplificação e necessitam de grandes quantidades de DNA íntegro. Por outro lado, são repetições muito polimórficas, a quantidade de repetições é grande, e a variação de um indivíduo para o outro faz grande diferença na técnica da eletroforese. 
STRs(microssatélites): São mais utilizados para padrão de estudo, por consistir em sequências menores, e por isso, necessitam de menor quantidade de DNA.
Observação: Os STRs e VNTRs também podem ser intragênicos, apenas foram utilizados para elucidar o conceito de marcadores intergênicos.
Intragênicos: Sequências polimórficas situadas no interior do gene. Podem estar associados à patologias devido a sua associação com uma sequência alterada, levando à perda da proteína. Os polimorfismos intragênicos podem ser: de inserção/deleção (InDels); troca de um único nucleotídeo (SNP); mutações dinâmicas (repetições de nucleotídeos). 
	Os genes não podem ser utilizados na genética forense, pois indivíduos sem parentesco entre si poderiam apresentar a mesma constituição gênica, desde que patologias genéticas estejam ausentes entre elas.
	Marcadores intergênicos podem apresentar grandes variações dentro de uma mesma população, sem que necessariamente, surja uma patologia, podendo resultar em uma alteração positiva. 
	Seguindo a padronização, a genética forense faz uma análise de 13 regiões (13 marcadores intergênicos).
Amelogenina: é uma proteína que compõe o esmalte dentário. O gene que a decodifica está nos cromossomos X e Y (gene AMELX). Possui grande importância para a genética forense, pois possibilita a determinação do sexo. 
	No cromossomo X, é originado um produto de amplificação de 106pb, enquanto no Y, 112pb. Esse gene contém uma deleção de 6pb no íntron 1. 
	Na eletroforese, amostras XY mostram duas bandas, uma de 106pb e outra de 112pb. Em XX os dois alelos com 106pb se sobrepõem, originando apenas uma banda. 
Genética Forense
	É a área do conhecimento que trata da utilização dos conhecimentos e das técnicas de genética e de biologia molecular no auxílio à justiça criminal e civil. Essa técnica permite a comparação de perfis, usando marcadores intergênicos (13 marcadores intergênicos específicos do tipo STR). 
	Como dito, os genes não podem ser utilizados na genética forense por decodificar as mesmas proteínas em indivíduos diferentes. Assim, indivíduos sem parentesco podem possuir a mesma constituição gênica. 
Vantagens de se utilizar o DNA na genética forense
-Pode ser encontrado em todos os fluidos e tecidos biológicos humanos
-Apresenta um perfil absolutamente indivíduo-específico
-É igual em todas as células
-É estável
Aplicações da genética forense
Na esfera civil:
-Teste de paternidade
-Identificar corpos e restos humanos
-Elucidar trocas de bebês
Na esfera criminal:
-Demonstrar a culpabilidade de criminosos
-Exonerar inocentes
Polimorfismos genéticos
São alterações no DNA com frequência maior que 1% não podendo mais ser denominadas como mutações.
-Permitem a variabilidade e possibilidade de respostas às diferentes situações. (plasticidade)
-Mudanças polimórficas não necessariamente alteram fenótipos(mutações silenciosas)
-Quanto mais possibilidade de alelos, mais polimórfico é o loco
Fases da Genética Forense
-Primeira Fase
Eram utilizados polimorfismos do tipo VNTRs com reagentes que possibilitavam a radiografia da membrana para a obtenção de um filme que demonstrava as diversas bandas de DNA existentes.
Limitações:
Necessidade de utilização de amostras com concentrações elevadas de DNA e dificuldade de análise de material parcialmente degradado
-Segunda Fase
Eram utilizados polimorfismos do tipo STRs, em substituição aos VTNRs devido à descoberta da técnica de PCR que permitiu a amplificação de sequências específicas de DNA
STR do cromossomo Y:
Herdado pelo indivíduo e compartilhado com seu pai, irmãos, tios, primos, avô e demais antepassados masculinos.
DNA mitocondrial
Importante devido à sua alta resistência à degradação e por cada célula possuir mais de 5000 cópias de DNA mitocondrial
A região polimórfica do DNA mitocondrial encontra-se na região de controle e a metodologia de análise desse DNA é de ampliaçãopela PCR, seguida de sequenciamento automático das regiões HV1 e HV2.
Terceira fase
Utiliza-se os polimorfismos do tipo SNP que têm a vantagem de ser mais abundantes no genoma humano, possuem baixos níveis de variabilidade materna e paterna, permitem a análise de pequenos fragmentos de DNA
Câncer 
Doença de descontrole do ciclo celular, onde ocorre crescimento e diferenciação de células de maneira inadequada. Em outras palavras, uma doença de proliferação celular, onde há a presença de células com fenótipo transformado. Apesar de acontecer de forma hereditária ou esporádica, o câncer é considerado uma doença genética. Está envolvido com a alteração de diversos genes e também possui influência ambiental sendo, portanto, multifatorial.
Como consiste em uma duplicação incontrolada de células, é preciso que haja falhas tanto nos genes que estimulam a proliferação quanto nos genes que controlam (inibem) o processo. Os genes envolvidos são (proto)oncogenes e os supressores de tumor. 
O câncer é causado por mutação no DNA e falha no mecanismo de regulação gênica.
Conceitos importantes
-neoplasma ou tumor: massa de células de crescimento indefinido e descontrolado, ou seja, com fenótipo transformado;
-neoplasia: processo de proliferação celular descontrolada;
-câncer: tumor maligno.
Principais características de células tumorais
-crescimento e multiplicação descontrolados
-alterações morfológicas perda da afinidade celular específica
-habilidade de crescer sob condições de hipóxia 
-indução de angiogênese 
-expressão gênica alterada 
Genes envolvidos
Proto-oncogenes: São genes que atuam estimulando a proliferação celular. Além disso, estimulam a diferenciação, ativam mecanismos anti-apoptose, inibe a transcrição de genes que atuam negativamente na proliferação celular. 
Alterações nos proto-oncogenes geram os oncogenes, os quais aumentam a taxa de proliferação, gerando uma transformação maligna. Os oncogenes podem ser ativados por inserção viral; mutação de ponto, inserção e deleção de bases; translocações cromossômicas.
Genes supressores tumorais: São divididos em duas classes, gatekeepers e caretakers.
Gatekeepers (genes protetores): Impedem a divisão e diferenciação celular, pois previnem a progressão do ciclo celular, bloqueiam a diferenciação celular e induzem a senescência ou morte celular (apoptose). Quando alterados ficam inativos, gerando perda do controle sobre a progressão do ciclo celular. 
Hipótese dos dois eventos: Propõe que duas mutações devem ocorrer, uma em cada alelo, para desenvolver a doença. Em caso de câncer hereditário, uma mutação é herdada (linhagem germinativa) e a outra é adquirida ao longo da vida (caráter somático); enquanto que no câncer esporádico, as duas mutações são adquiridas, ou seja, ambas têm caráter somático.
Gene p53: Gene supressor de tumor que codifica a proteína “check point”, responsável por impedir a replicação de DNA mutado. Em caso de danos menores, ela irá parar o ciclo, reparar o DNA e possibilitar a continuidade do ciclo; se os danos forem maiores, leva à apoptose. Mutações nesse gene levam à progressão do ciclo mesmo com o DNA mutado, aumento da freqüência de mutações, e aumento da instabilidade genômica (quanto mais mutações, mais instável).
Caretakers (genes de manutenção): Têm a função de reparo de danos no DNA (mantêm baixa as taxas de mutação e mantêm a estabilidade do genoma). Quando mutados geram instabilidade genética e celular: doenças de reparo e câncer.
Xeroderma pigmentoso: Defeitos de reparo de excisão de nucleotídeos, gerando tumores na pele, fotossensibilidade, catarata, etc. 
	Assim, para que haja o câncer os oncogenes (proto-oncogenes mutados) irão promover a tumorigênese, e os supressores de tumor precisam ser inativados durante a tumorigênese.
	A formação de um tumor envolve múltiplas etapas, com acúmulo de mutações em diferentes tipos de genes. Nenhum destes genes sozinho é capaz de formar um tumor, e várias mutações em genes diferentes são necessárias para que um tumor se forme e atinja plenamente seu potencial maligno.
Distrofia miotônica
Sintomas: rigidez e fraqueza muscular; dificuldade de relaxar a musculatura após a contração. 
Genética: Doença multifatorial de característica autossômica dominante. Cromossomo 19 com expansão instável da trinca CTG, na região do gene que codifica uma proteína quinase (DM-PK). Esse tipo de mutação foi denominado mutação dinâmica. A expansão é diretamente proporcional à gravidade da doença. 
Distrofia muscular de Duchenne e Becker 
Sintomas: debilidade muscular do tronco e dos membros inferiores; marcha anserina (de pato); caminhada na ponta dos pés. 
Genética: Distúrbio genético de caráter recessivo ligado ao cromossomo X, produzido por uma mutação no gene que codifica a enzima distrofina. 
Doença de Gaucher
Sintomas: esplenomegalia; hepatomegalia; anemia; lesões ósseas (tipo 1); além dos sintomas citados a tipo 2 apresenta-se como uma doença neuropática, causando disfunção do nervo oculomotor; estrabismo; sacada; ataxia e hipertonia. A tipo 3 apresenta-se como a forma mais branda do tipo 2.
Genética: É uma doença autossômica recessiva com mutação no gene N370S (tipo 1) ou L444P (tipo 2 ou 3).
Esclerose lateral amiotrófica
Sintomas: fraqueza muscular; deterioração das células nervosas causando deterioração muscular. Tem-se como sintomas secundários: Câimbra; atrofia; diminuição da sensibilidade; espasticidade e reflexos exaltados. 
Genética: A causa da doença ainda mostra-se obscura, porém estudos apontam que trata-se de uma doença multifatorial somática. 
Síndrome do X-frágil 
Sintomas: Deficiência intelectual e emocional; retardo mental; hiperatividade; cabeça com circunferência larga; face longa com testa e mandíbula proeminentes; orelhas que se sobressaem; pé achatado e articulações hiperextensivas. 
Genética: Silenciamento no gene FRM1 devido a uma expansão da trinca CGG. A expansão da trinca é diretamente proporcional à gravidade da doença.
Síndrome de Angelman
Sintomas: Atraso no desenvolvimento; incapacidade de falar com nenhum ou quase nenhum uso de palavras (maior capacidade de compreensão do que expressão verbal); problemas de equilíbrio; incoordenação motora e combinação de uma personalidade facilmente excitável e sorrisos e aparência feliz e espontânea. 
Genética: Deleção no cromossomo 15 (70%); dissomia uniparental paterna (3-5%); mutação no gene UB3A (8%). 
Hipercolesterolemia
Sintomas: hipercolesterolemia; xantoma (lesão epitelial que se apresenta sob a forma de nódulo ou placa, decorrente do acúmulo de colesterol em macrófagos); xantelasma palpebral e arco senil.
Genética: Mutações no gene LDLR (receptor celular de colesterol); gene LPL (decodifica lipoproteína lipase); gene APOB (induz uma falha na ligação do LDL com o LDLR); gene ARH (decodifica uma proteína que possui domínio ligante ao domínio ligante ao domínio citoplasmático do LDLR).
Fibrose Cística
Sintomas: Valores do cloro plasmático acima de 60 mEq/L; ausência de mecônio nos 2 primeiros dias de vida; atraso no crescimento; respiração difícil; perda de peso; pele salgada e azulada; diminuição da capacidade reprodutora.
Genética: Doença autossômica recessiva, causada por mutação no gene CFTR, localizado no braço longo cromossomo 7. Tal mutação leva a expressão (produção) alterada da proteína CFTR. A mais frequente e estudada é a deltaF508, que consiste na deleção do aminoácido fenilalanina. A mutação é dividida em 6 classes: a primeira não permite transcrição da proteína (mais grave); na segunda, a tradução não ocorre; terceira, a proteína é produzida e alocada na membrana celular, porém não é funcional; quarta, a proteína é produzida, colocada na membrana e é funcional, porém sua atividade é reduzida; quinta, a proteína é produzida, colocada e apesar de ter função normal, está em quantidade reduzida; sexta, a proteína é produzida e colocada na membrana celular, porém é rapidamente degradada.
Atrofia Muscular Espinhal
Sintomas: Hipotonia; perda progressivade motoneurônios; atrofia simétrica periférica e em seguida central; peitoral em forma de sino. 
Genética: Deleção nos genes SMN1 ou SMN2 do cromossomo 5. Pode ocorrer também por substituição de citosina por timina (transição) na base nitrogenada 840, convertendo SMN1 em SMN2. Há três classificações da AME: dupla deleção do gene SMN1 (tipo 1); conversão gênica do alelo SMN1 em SMN2, e deleção do SMN1 no outro alelo (tipo 2); conversão gênica do gene SMN1 em SMN2 nos dois alelos (tipo 3). A ordem das classificações é proporcional à produção da proteína SMN, e consequentemente, à menor gravidade dos sintomas.