Estudo cultura de células

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1. Cite 3 linhagens de células conhecidas.
HeLa (câncer de útero) - primeira linhagem de célula imortal cultivada em laboratório (60 anos). 
Ela é proveniente de Henrietta Lacks, uma mulher negra americana que teve câncer de útero 
em 1951, que recebeu tratamento, mas faleceu. Foi feita uma biópsia, que foi enviada para o 
laboratório de Dr. George Gey, que descobriu que as células não morriam (foi a primeira a 
sobreviver in vitro). As células tumorais imortais HeLa já foi utilizada para mapeamentos 
genéticos, estudos das funções da célula, desenvolvimento da vacina de poliomielite etc. Outras 
linhagens conhecidas são LNCap (linfonodo), DU (cérebro)e PC-3 (osso).
2. Quais são os tipos de cultura em cultura de células animais?
São as culturas aderentes e as culturas em suspensão. As culturas aderentes se fixam no fundo 
do frasco, enquanto as culturas em suspensão não. 
3. Quais são as principais características para determinar o melhor frasco para uma cultura de 
células animais?
Se a cultura é aderente ou não, se a cultura se trata de cultura primária (pois vai se for um 
explante o volume do meio no frasco terá que ser ajustado para o mínimo), o tipo de tampão 
(pois se for o tampão de NaHCO3, por exemplo, a cultura dependerá muito do CO2 externo e 
necessitará de uma tampa com filtro).
4. Quais são os principais equipamentos de um laboratório de cultura de células?
Fluxo laminar, microscópio invertido (com contraste de fase), micromanipulador (para 
fertilizações in vitro e seleção celular, mas é opcional), insumos (plásticos, meios, aditivos etc), 
incubadora CO2 e centrífuga refrigerada.
5. Explique o que são culturas primárias e linhagens, e seus tipos. Como se transformam 
culturas primárias em linhagens?
As culturas primárias são células que não estão imortalizadas, elas são coletadas por meio de 
biópsias para se fazer o primeiro cultivo em laboratório, um explante (onde ocorre migração 
das células do pedaço de tecido obtido para o frasco). As linhagens são células imortalizadas, 
elas podem ser tumorais ou não, tem uma população homogênea e tem diversos meios para 
imortalização. 
6. Cite os principais suplementos para o preparo de meio Eagle em pó.
Solução anti-anti (1% - antimicótico e antibiótico), hormônios/fatores de crescimento, 
aminoácidos essenciais (não gasta glicose para síntese), aminoácidos não-essenciais (a célula 
não produz) e soro fetal bovino.
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7. Quais são os tipos de frascos disponíveis para cada tipo de cultura? Como se escolhe o tipo 
de tampa? Quais as vantagens?
Para as células aderentes, tem os com cobertura (tratados com poli-D-Lisina), para as culturas 
em suspensão tem as com cobertura (hidrogel hidrofílico), as sem cobertura (poliestireno 
hidrofóbico)
8. Explique sucintamente cada tipo de insumo necessário para um laboratório de cultura de 
células animais.
Soro fetal bovino - possui muitos hormônios, citocinas e fatores de crescimento importantes 
para as células, é obtido de soro do sangue de fetos bovinos. É um insumo muito caro, mas 
também muito importante, além de ter uma questão ética forte, pois são usados fetos bovinos, 
no entanto, quando se usa cultura de células, minimiza-se bastante o uso de animais em 
pesquisas.
Hormônios/ fatores de crescimento - Possuem várias funções, por exemplo, mitógenos e 
indutores de diferenciação. São importantíssimos para pesquisas com células tronco, pois são 
necessários para diferenciação celular.Alguns fatores de crescimento: PDGF (Plaquetas), EVGF 
(indotelial vascular) e ILGF (Semelhante a insulina).
Aminoácidos essenciais e não essencias - É importante no meio pois as células não sintetizam os 
aminoácidos essenciais a custo de glicose e glutamina, o que pode retardar o crescimento. Já os 
não essenciais, a célula não produz, daí sua importância no meio.
Antibióticos/Antimicóticos - Por mais cuidados que se tomem, as culturas de células animais são 
muito suscetíveis à contaminação, por isso é importante colocar drogas para minimizar esse 
problema.
9. Quais são as vantagens e desvantagens de se cultivar células animais?
Diminui uso de animais, é mais facil de aprovar em conselho de ética, pequena e larga escala, 
com linhagens estabelecidas e confiáves para comparação de resultados, tempo de resposta 
menor do que em animais, o campo de medicina regenerativa só existe por conta das culturas 
de células animais (fazer órgãos, por exemplo).
As desvantagens são o alto custo de planejamento e manutenção, já que os equipamentos e 
insumos são MUITO caros, além disso tem que se levar em conta que uma cultura de células 
não é a mesma coisa que um modelo in vivo, é um sistema simples. Além disso, como as 
culturas de células animais são muito suscetíveis à contaminações, comprar linhagens pode se 
tornar muito caro e arriscado (pode perder toda a linhagem no transporte, por exemplo).
10. O que é subcultivo e cocultura? Quais são os principais passos de um subcultivo? Porquê é 
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um passo importante?
Um subcultivo é aquele em que se faz diversos cultivos seguidos para aumentar o número de 
células. Isso pode ser para congelamento, aumentando o número de uma coleção, ou para um 
experimento específico, para caso algo dê errado, tem mais células disponíveis. É importante 
exatamente no caso do experimento, é um cuidado a mais que facilitará a vida se der errado.
11. Cite e explique sucintamente 4 tipo de tampões utilizados nos meios de cultura.
O tampão de NaHCO3 é bem barato, mas depende muito de CO2, já que seu equilíbrio é entre 
HCO3- e H2CO3, que, por sua vez, o de HCO3- depende água e CO2, uma interação que 
acontece na superfície meio-ar. Um meio de minimizar essa dependência é colocar piruvato 
para aumentar a produção de CO2 das próprias células.
O tampão HEPES tem pH fisiológico e serve tanto para a cultura de células normal, quanto para 
proteção de soluções e estruturas de enzimas. É um tampão menos dependente de CO2, mas 
que apresenta maior custo e citoxicidade caso exposto à luz. (é oxidante)
O tampão PBS é isotônico ao corpo humano, serve para lavagens de célula antes de dissociação, 
transporte etc. Mantém a água em torno das biomoléculas - previne desnaturação ou 
mudanças conformacionais.
O tampão de citrato tem pH um pouco ácido, e não é muito usado em cultura de células, apesar 
de ser um tampão muito poderoso pois mantém seu tamponamento mesmo em diluições de 
até 10x.
12. O que é confluência e repique?
Confluência é a percepção visual de preenchimento do frasco que contém a cultura. Repique é 
passagem repetida de células afim de aumentar seu número.
13. Porque é importante a utilização de soro fetal bovino em cultura de células?
Porque possui citocinas, hormônios e fatores de crescimento importantes para as células.
14. Quais são os tipos de enzimas utilizadas para desagregação enzimática de culturas 
primárias? Qual o procedimento no laboratório para isso?
colagenase (quebra colágeno), hialuronidase (quebra ácido hialurônico, em tecidos 
conjuntivos), dispase (fibronectina) e tripsina (proteínas).
A desagregação enzimática é feita colocando-se o tecido com meio e a enzima em estufa, a 
37ºC por algumas horas, depois coloca-se soro fetal bovino para desativar a enzima, e assim 
faz-se o mesmo procedimento de centrifugar e resuspender a célula para depois colocá-la em 
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cultivo, de fato.
15. Descreva o procedimento de desagregação mecânica.
Pega-se um tecido (cultura primária) e coloca-se em uma placa que estará até metade do 
volume do tecido preenchido com meio. Pega-se o cell scrapper e começa-se a fazer 
movimentos suaves para frente e para trás, enquanto segura-se o tecido com uma pinça, afim 
de esgarçar o tecido suavemente. Quando não ouver quase nada de tecidovisível, pega-se os 
restos e tira-se com a pinça. Coloca-se na centrífuga por alguns minutos, verte-se o meio e 
resuspende-se a célula em novo meio. Coloca-se esse mistura em um frasco e cultiva-se em 
estufa por alguns dias, aonde espera-se que haja migração celular do tecido para o frasco.
16. Quais são os principais métodos para imortalização de células não tumorais?
Vírus (SV40 - antígeno T - desativa p53 , Epstein-Barr - inativa p53 e retinoblastoma, HPV - E6 -
proteína E inativa p53), Lipofecção (lipossomo com DNA viral que desativa p53 - diversos 
mecanismos) e Fusão com células cancerígenas (tratamento da membrana com produtos 
químicos para facilitar a fusão - hibridoma é lifócito B + mieloma múltiplo que produz 
anticorpos)
17. Cite pontos críticos de um subcultivo.
Deteccção de contaminações, observação da morfologia celular, confluência, determinar 
momento certo para fazer passagem, monitorar viabilidade celular (azul de tripano), 
criopreservar células e quanto por ampola (106)
18. Quais sinais de saúde da célula que podem ser observados em microscopia?
Presença de gota de lipídeo (reserva), núcleo e nucléolo bem definido (síntese proteica). 
Observar morfologia.
19. O que são CTM's? Qual o seu tecido de origem e qual a localização desse tipo de célula no 
mesmo? 
As CTM são células-tronco mesenquimais, que provém do tecido adiposo unilocular (que possui 
uma única gotícula de lipídeo por célula). Ela se localiza perto dos vasos sanguíneos, na parte 
externa, e entre os adipócitos.
20. Quais medidas podem ser tomadas no projeto e nas rotinas do laboratório, em geral, para 
diminuir a chance de contaminação?
Uso de insumos estéreis e descartáveis, uso de jaleco e paramentação descartável, manutenção 
correta dos equipamentos essenciais (como fluxo laminar), presença de ar filtrado no 
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laboratório, evitar falar enquanto manipula a células, possuir sala de descontaminação etc.
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