Protocolo de cultura de linfócitos by me

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Protocolo de cultura de linfócitos, em suspensão, e obtenção de preparações cromossómicas a partir de sangue periférico humano
A. Crescimento celular de linfócitos, em suspensão
Dia 1: 9 horas
1.Recolha de uma amostra de sangue de 3-5 mL para tubos vacutainer, contendo heparina sódica (anticoagolante). Deve se-ter o cuidado de manter as amostras à temperatura ambiente.
Dia 2: 9 horas
2.Preparar 15 mL de meio RPMI 1640 com suplemento de L-glutamina e adicionar 0.4 mL de fitohemaglutinina (agente mitogénico que promove a desdiferenciação dos linfócitos) e 0.2 mL de penincilina.
3.Inocular 0.5mL de amostra de sangue com 7.5 mL de meio para cada tubo
4.Incubar as culturas a 37ºC durante 72 horas, tendo o cuidado de deixar os tubos com uma inclinação de 30º. Adicionar 0.75 mL de soro fetal bovino (FDS), passadas as primeiras 24 horas. Os tubos devem ser invertidos e abertos uma vez por dia.
Dia 4: 8 horas
5.Adicionar 0.1 mL de colchicina 0.0017% (agente anti mitótico, provoca bloqueio em metafase impedindo a polmerização dos microtubolos), agitar os tubos e deixar em incobação por mais uma hora. Neste passo, pode ser também adicionado brometo de etídeo para evitar a condensação extrema dos cromossomas. 
B. Obtenção de preparações cromossómicas
6.Transferir o meio de cultura para um tubo de centrifugação (Falcon) e proceder à centrifugação a 900 rpm por 5min.
7.Retirar o sobrenadante e em seguida adicionar a cada tubo 8mL de KCL (0.075 M) e incubar a 37º durante 10 minutos.
8.Adicionar 5 gotas de fixador Corney ( metanol e ácido acético numa porporção de 3:1) recém preparado e gelado.
9.Centrifugar a 900 rpm durante 5 minutos e em seguida desprezar o sobrenadante.
10.Adicionar 8 mL de fixador.
11.Centrifugar a 500 rpm durante 5 minutos e deitar fora o sobrenadante. Repetir este passo 3x.
12.Adicionar cerca de 1mL de fixador e ressuspender o material.
13.Colocar 3/4 gotas da suspenção obtida numa lâmina limpa e deixar secar ao ar.
14.Proceder à coloração da solução com Giemsa (possui grande afinidade com ácidos nucleicos) diluída a 5% em tampão fosfato (pH=6.8) e deixar atuar durante 7 minutos
15.Lavar a lâmina com água destilada
Webgrafia:
https://pt.vwr.com/store/product/18812660/meios-liquidos-de-cultura-de-celulas-rpmi-1640-biowhittakertm
https://www.passeidireto.com/arquivo/50735015/analise-de-cariotipo-humano
http://www.uel.br/laboratorios/laca/protocolos/cultura_de_linfocitos.pdf
Alexandra Monteiro nºal68774