TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA

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TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA
Transcrição: Processo em que as moléculas de RNA são iniciadas, alongadas e terminadas. 
RNA é polimerizado pela RNA polimerase sem a necessidade de um primer. 
RNA é unifilamentar sendo um transcrito da dupla hélice de DNA.
A síntese enzimática do RNA se dá da seguinte forma:
5’ trifosfatos de ribonucleosídeos (rNTP) – ATP, GTP, CTP, UTP.
Estrutura da RNA polimerase E.coli.
A enzima contém em sua estrutura: dois polipeptídeos α, um polipeptídio β e B’. A adição da subunidade σ (fator sigma) permite a iniciação nos sítios promotores, formando a holoenzima (RNA polimerase). Após iniciada a polimerização, o fator sigma se dissocia rapidamente da enzima.
A RNA polimerase é responsável pela síntese de RNA (transcrição). O cerne de enzima, que consiste nas subunidades 2α, 1β, 1β´e 1ω, é responsável pelo alongamento da transcrição. O fator sigma (σ) também é necessário para o início da transcrição. A enzima completa, consistindo no cerne da enzima mais o fator σ, é chamado de holoenzima.
SUBUNIDADE α: Duas subunidades alfa (α) estão presentes na RNA polimerase. A subunidade α é necessária para a montagem do cerne da proteína, mas ainda não teve um claro papel transcricional atribuído a ela.
SUBUNIDADE β: Uma subunidade beta (β) está presente na RNA polimerase. O antibiótico rimfacina e as estreptolidiginas ligam-se à subunidade β. A subunidade β pode estar envolvida tanto no início da transcrição quanto no alongamento.
OBS:O importante antibiótico rifampicina é um potente inibidor de RNA polimerase que bloqueia a iniciação, mas não o alongamento. Esta classe de antibiótico não inibe as polimerases eucarióticas e tem, portanto, sido usado pelos médicos para tratamento de infecções bacterianas Gram-positivas e tuberculose.
SUBUNIDADE β´: Uma subunidade beta primo (β´) está presente na RNA polimerase. Ela pode estar envolvida na ligação ao molde de DNA. A heparina liga-se à subunidade liga-se à subunidade β´.
FATOR SIGMA: O fator sigma (σ) é um componente separado do cerne da enzima. A Escherichia coli codifica vários fatores σ, sendo o mais comum o σ. Um fator σ é necessário para a iniciação no sítio promotor correto. Ele faz isto diminuindo a ligação do cerne da enzima a sequências inespecíficas do DNA e aumentando a ligação específica ao promotor. O fator σ é liberado do cerne da enzima quando o transcrito atinge 8 a 9 nucleotídeos de tamanho.
TRANSCRIÇÃO PROCARIOTO
A transcrição é a síntese de um filamento de RNA a partir de um molde bi filamentar de DNA. A síntese de RNA ocorre no sentido 5´--3´, e sua sequência corresponde à do filamento de DNA, que é conhecida como filamento de sentido.
INICIAÇÃO: A RNA polimerase é a enzima responsável pela transcrição. Ela se liga a sequencias especificas de DNA chamadas de promotores para iniciar a síntese de RNA. Estas sequencias estão antecedendo (para a ponta 5´) da região que codifica a proteína, e contêm sequencias de DNA curtas, conservadas, que são comuns a promotores diferentes. A RNA polimerase liga-se ao dsDNA em uma sequência promotora, resultando em deselicoidizaçãolocal do DNA, A posição da primeira base sintetizada do RNA é chamada de sítio inicial e designada como posição +1.
ALONGAMENTO: A RNA polimerase move-se ao longo do DNA e sintetiza sequencialmente a cadeia de RNA. O DNA é desenrolado adiante da polimerase em movimento, e a hélice é reformada atrás dela.
TERMINO: A RNA polimerase reconhece o finalizador que faz com que outros ribonucleotídeos não sejam incorporados. Esta sequência é comumente uma estrutura em forma de grampo de cabelo. Alguns finalizadores requerem um fator acessório chamado de rô para o término.
LIGAÇÃO AS PROMOTOR: O fator σ acentua a especificidade do cerne αββ’ω da RNA polimerase para a ligação do promotor. A polimerase encontra as sequência promotoras -35 e 10- deslixando ao longo do DNA e formando um complexo fechado com o promotor de DNA.
DESELICOIDIZAÇÃO DO DNA: Cerca de 17 pb do DNA é deselicoidizado pela polimerase, formando um complexo aberto. A deselicoidização do DNA em muitos promotores é acentuada pela superelicoidização negativa do DNA. Entretanto, os promotores dos genes para as subunidades da DNA girasse são reprimidos por superelicoidização negativa.
INICIO DA CEDEIA DE RNA: Não é necessário um primer para síntese de RNA. Os primeiros 9 nucleotídeos são incorporados sem movimentação da polimerase ao longo do DNA ou liberação do fator σ. A RNA polimerase passa por múltiplos inícios abortivos de cadeia. Após um início bem-sucedido, o fator σ é liberado para formar um complexo ternário, que é responsável pelo alongamento da cadeia de RNA.
ALONGAMENTO DA CADEIA DE RNA: A RNA polimerase move-se ao longo do DNA mantendo uma região constante do DNA desenrolado chamada de bolhas de transcrição. De 10 a 12 nucleotídeos na ponta 5´do RNA fazem constantemente pareamento de bases com o filamento-molde de DNA. A polimerase desenrola o DNA na frente da bolhas de transcrição e o reelicoidiza atrás.
Etapa 1 – a RNA polimerase se liga aos promotores da molécula de DNA. (-35 -10 em procarioto).
Término da síntese de RNA
- Formação de uma alça (sequência de bases complementares); a segunda parte da alça possui um alto conteúdo de GC; a terceira região é uma sequência de pares A-T que produz no RNA uma sequência de 6 a 8 uracil em precedidos de uma ADENINA.
Outra definição: As sequencias autocomplementares na ponta 3´dos genes formam estruturas em grampo de cabelo no RNA que atuam como finalizadores. A haste do grampo em geral tem um alto conteúdo de pares de bases G-C dando-lhe uma grande estabilidade, fazendo com que a polimerase pare. O grampo é em geral seguido de quatro ou mais Us que resultam em fraca ligação RNA-DNA anti-sentido. Isto favorece a dissociação do filamento de RNA, causando o término da transcrição.
- Término dependente de rô: alguns genes contêm sequencias finalizadoras que requerem um fator proteico adicional, rô para um término eficiente da transcrição. Rô liga-se a sítios específicos no RNA unifilamentar. Ele hidrolisa ATP e move-se ao longo do RNA para o complexo de transcrição, no qual possibilita que a polimerase termine a transcrição.
Anotação do caderno: no procarioto o RNA está pronto, no eucarioto é o transcrito primário. 
Iniciação da transcrição em eucariotos
- Sítios antecedentes de transcrição e acentuadores onde se ligam proteínas fatores de transcrição;
- Podem estar distantes do promotor até 2000 a 3000 bases;
- Aumentam a taxa de início da transcrição pela RNA polymerase II;
- Presentes no mesmo cromossomo;
- Silenciadores agem de maneira oposta aos acentuadores estimuladores.
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
A transcrição em eucariotos é catalisada em três enzimas:
RNA polimerase I (localizada no nucléolo e produz o rRNA);
RNA polimerase II (produz o mRNA);
OBS: Produção de mRNA eucariótico
- cap (7MeG ) 5` PPP 5` 5`--(G ou A, possivelmente metilada 3` P.
- AAUAAA antecedem 10 a 25 bases do local da poli (A) que possui de 20 a 250 nucleotídeos.
RNA polimerase III (produz o tRNA e o rRNA 5S)
Existem para as três polimerases, promotores e terminadores que regulam a velocidade da transcrição, que são diferentes para estas três enzimas.
Algumas proteínas, fatores de transcrição, que auxiliam a interação da RNA polimerase com o DNA, e são divididas em dois grupos:
- Fatores gerais (comuns a todos os genes), os necessários para a iniciação da transcrição, os que participam do processo de elongação do RNA
- Fatores específicos (regulam genes específicos), os que ajudam na formação do complexo de pré-iniciação, mas podem não ser necessários após a iniciação da transcrição.
Os ribossomos de eucariotos possuem 4 rRNAs (18S, 28S, 5.8S, 5S).
Os três primeiros são transcritos como uma única unidade de transcrição, na forma de um pré-rRNA, por ação da RNA polimerase I.
Em todas as células eucarióticas, a unidade de transcrição do pré- rRNA é maior que a soma dos rRNAs.
Para a transcrição correta dos genes e rRNA,a RNA polimerase I necessita de dois fatores proteicos, que se ligam ao DNA, o fator B e o fator S.
O fator B liga-se ao DNA, com muito mais eficiência, em presença do fator S, eles se ligam ao DNA cerca de 150 nucleotídeos antes do ponto de iniciação, e só então a RNA polimerase I liga-se, começando a transcrição. 
A transcrição termina quando a RNA polímerase III encontra uma sequência de resíduos de nucleotídeos timina.
O Rrna 5S não sofre processamento.
Os tRNAs são sintetizados como precursores que são modificados, o pré-RNA sofre:
- Splicing e remoção das sequências intercaladas;
OBS: Recomposição do RNA (Splicing)
Introns: regiões intercalares não traduzidas = 50 a 90% do RNA que são removidas dos transcritos primários;
Éxons: segmentos restantes que são reunidos para formar mRNA;
RNA-heterogêneo (HnRNA): moléculas parcialmente processadas, antes da recomposição;
RNP-partícula de ribonucleoproteína (snRNP): enzimas com atividade de corte de introns e união de éxons.
- Remoção de três nucleotídeos da extremidade 3’ e adição da sequência CCA;
- Adição dos grupos metil e isopentenil.
Todos os genes analisados (que são ativamente transcritos) tem uma sequência altamente conservada, chamada de “TATA box”; (-25; -29) e caixa CAAT (-70; -80).
Genes de expressão constitutiva não apresentam Caixa TATA e apresentam no lugar região rica em GC (ação cis) dentro, facilitando interação com fatores de transcrição ação trans) fora. 
Principais diferenças entre eucariotos e procariotos
- As células eucarióticas contêm três classes de RNA polimerase nuclear e elas são responsáveis pela síntese de classes diferentes de RNA;
- Muitas moléculas de mRNA tem vida longa.
- Tanto as pontas 5`quanto 3`são modificadas.
- Cap (quepe) é encontrada na ponta 5` e uma longa sequência até (250 nucleotídeos) de ácido poliadenílico, poli (A), é encontrada na ponta 3’.
- A molécula de mRNA é geralmente 1/10 do tamanho do transcrito primário. Durante o processamento os íntrons são removidos e os fragmentos reunidos.
- mRNA monocistrônicos são característicos de eucariotos.
Anotação do caderno: Proteínas que aumentam a expressão gênica: alfa hélice; dedo de zinco (DNA metilado não transcreve); zíperes de leucina. 
Não existe nenhuma sequência para caracterizar o ponto de terminação, após a transcrição, vários grupos metil são adicionados a resíduos de adenina localizados em exons. Talvez a metilação desempenhe um papel de proteção na porção do transcrito a ser preservado.
GERALZÃO SIMPLES DE TRANSCRIÇÃO
A RNA polimerase nos procariotos é única, enquanto nos eucariotos são três - RNA polimerase I, II e III. Os RNAs formados durante a transcrição podem ser de três tipos: o mRNA, o tRNA e o rRNA. 
A transcrição ocorre em três etapas: a iniciação, o alongamento e o término.
Iniciação
A síntese do RNA começa em regiões do DNA chamadas de regiões promotoras (promotor – região regulatória que determina onde, quando e quanto um gene será expresso), que são sequências específicas reconhecidas pela RNA polimerase, e direcionam a transcrição de genes. 
O reconhecimento da RNA polimerase aos promotores se dá graças ao fator sigma, que liga-se à RNA polimerase fazendo com que estas tenham maior afinidade com as sequências promotoras. Os promotores contêm sequências consenso localizadas antes do início da transcrição, a distâncias específicas. 
Os promotores procarióticos geralmente localizam-se na região –10 e –35 do início da transcrição e as sequências consenso mais conhecidas são o TATA box na região –10 (TATAAT) e a sequência TTGACA na região –35. Existem vários tipos de promotores e fatores sigma correspondentes e é essa variedade que permite que as funções celulares possam ser reguladas mantendo o equilíbrio das atividades celulares. 
Nos eucariotos, o processo de iniciação e regulação da transcrição é muito mais complexo, envolvendo um número e diversidade maior de sequências promotoras e de fatores de transcrição (análogos ao fator sigma).
Uma importante etapa na iniciação da transcrição é a abertura da dupla fita de DNA (desenovelamento), que é feito rompendo-se as ligações entre as bases das duas fitas. É necessário que os nucleotídeos de um dos filamentos estejam disponíveis a novos pareamentos. A RNA polimerase deve desenrolar o DNA dupla hélice, formando uma bolha de transcrição, cerca de 17 pares de bases desenrolados.
Alongamento
O RNA recém-sintetizado pareia-se temporariamente com a fita molde de DNA, formando um híbrido curto RNA-DNA. Uma vez iniciada, a transcrição segue numa velocidade de aproximadamente 50 nucleotídeos por segundo, estando a RNA polimerase ligada à fita molde de DNA até encontrar o sinal de término da transcrição. 
Término
O final da transcrição é um processo bem controlado, determinado pelo surgimento dos códons de parada ou de terminação, finalizando a síntese dessa molécula.
Local
Em procariotos, que não possuem envoltório nuclear, a transcrição ocorre no mesmo lugar onde ocorre a tradução, dessa forma, tão logo o RNA comece a ser formado, a tradução já se inicia. Por esse motivo diz-se que a transcrição e a tradução nos procariotos é acoplada. Nos eucariotos a transcrição ocorre no núcleo e a tradução ocorre no citoplasma. O RNA recém- sintetizado nos eucariotos ainda precisa passar por várias modificações antes de estar pronto para tradução (retirada dos íntrons, adição de uma cauda de poli Adenina, adição de 7-Metil Guanosina na primeira base do RNA e outras).
Cístron
Um cístron é um segmento de DNA correspondente a uma cadeia polipeptídica mais os sinais de início e término.
mRNA monocistrônico é o mRNA que codifica apenas um polipeptídeo (uma proteína) e é característico dos eucariotos.
mRNA policistrônico é o mRNA que codifica várias cadeias polipeptídica (várias proteínas) s e é característico dos procariotos.
mRNA
Atenuador – região regulatória da sequência líder, determina a quantidade de expressão de um gene. 
Possui sequências não traduzidas em ambas as pontas 5’ e 3’.
A transcrição e a tradução são simultâneas em procariotos, seu mRNA tem tempo útil menor (destruído por nucleases) do que o do eucarionte.
Anotação do caderno: o mensageiro serve de molde para transcrição reversa para transposons e retrovírus.
RNA estável: Rrna e tRNA
Ribossomo: local da síntese proteica. 
tRNA – 50 moléculas de RNA adaptadoras, em que os aminoácidos são alinhados. Cada tRNA liga-se a um códon e coloca um aminoácido correspondente em um sítio do ribossomo, ligando ao aminoácido adjacente por ligações peptídicas. 
Anotação do caderno: códon - trinca de bases que se ligam por complementariedade de bases
rRNA (mais abundante na célula) e tRNA são moléculas estáveis e não servem como molde – O RNA de transferência possui uma pseudouridina (base modificada) em sua estrutura (braço T).
Síntese de rRNA e tRNA
A produção rRNA e tRNA inicia-se em um promotor e termina na região finalizadora. Esses dois tipos de RNA não são considerados transcritos primários, pois: 
- São formados por um 5’ monofosfato ao invés do trifosfato presentes nas pontas dos transcritos primários.
- São muito menores do que um transcrito primário.
- tRNA possui outras bases além de A, U, C, G – bases modificadas que não são presentes no transcrito primário. 
As mudanças são feitas no processo pós-transcricional ou processamento do RNA – ambos são removidos de transcritos primários.
A formação do rRNA (RNA ribossômico) é resultado da remoção direta de uma única sequência continua.
A formação do tRNA requer cortes por várias enzimas em uma ordem determinada e também modificações químicas. 
Estágios do processamento do transcrito do gene de tRNA de E. coli
Na etapa 5, seis bases são modificadas para formar pseudourodina , 2-isopenteniladenosina (2ipA), 2-o-metilguanosina (2mG) e 4-tiouridina (4tU)
Nova Estrutura de DNA
- O nome desta estrutura é i-motiff, encontrada na região promotora dessa forma, a i-motiff deve ajudar a “ligar” e a “desligar” genes ao checar se um geneestá sendo lido ativamente ou não. Agora, os pesquisadores desejam entender quais as funções exatas dessas formas alternativas de DNA e também investigar se aberrações nessas estruturas podem acarretar em consequências patológicas para os seres vivos.
Efeitos de mutações de corte-junção de RNA
- Gera proteínas aberrantes; 15% das doenças genéticas resultam de mutações corte-junção de RNA; Mutações no corte-junção incorreto do mRNA da globina β casos de Talassemia β.
Corte e junção alternativo de moléculas de mRNA – Exemplo: produção de isoformas de tropomiosinas, específicas para cada tecido. 
Cromatina
DNA ligado à histonas: remodelamento
Forma ativa: - HAT: histona acetil transferase - Acetilação de resíduos de lisina região eucromatina.
Forma inativa: - HDAC: histona desacetilases; - Desacetilação Condensação em heterocormatina.
TRADUÇÃO
Moléculas nas células
A forma e funcionamento de qualquer célula são decorrentes direta ou indiretamente da presença de um arsenal de proteínas, que são macromoléculas informacionais sintetizadas sob comandos e instruções específicas presentes nos ácidos nucléicos (genes).
- Alterações nos genes podem acarretar em mudanças na conformação e na atuação de nossas proteínas. 
A ligação dos tRNAs ao seu aminoácido específico, depende da ação das enzimas aminoacil-tRNA sintetases que ativam cada aminoácido ligando-o corretamente ao tRNA específico.
 
	O dogma central e os moldes	
- Os RNA’s possuem flexibilidade e mobilidade para se acoplarem aos ribossomos e dirigirem a síntese proteica. 
Compreendendo o fluxo: a síntese de novas moléculas de DNA (duplicação); a síntese de novas moléculas de RNA (transcrição); algumas das moléculas de mRNA servem de molde para a síntese de proteínas (tradução), que ocorre nos ribossomos. 
As proteínas jamais servem de molde para produção de DNA ou de outras moléculas de proteína. 
É possível com a enzima transcriptase reversa produzir DNA a partir de um RNA (molde). O RNA também serve de molde para síntese de outras moléculas de RNA (possível por conta da enzima replicase codificada por um vírus infeccioso). 
Código Genético
Função da proteina depende da forma que ela possui, determinada pela sequencia de aminoácidos. O DNA não codifica diretamente as proteínas, a codificação ocorre pelo mRNA. O códon do codigo para um aminoácido consiste em uma sequência de três pares de bases nucleotídicas (códon de trincas). O codigo genético possui um codon iniciador (AUG – metionina, em regulação genica raramente o GUG – valina pode gerar o inicio da tradução) e para o termino codon finzalidador (UAA, UAG, UGA) na região codificadora. O codigo genetico é universal: mesmos códons são utilizados por diferentes organismos. O codigo genético é degenerado (64 códons – 20 aminoacidos).
Mutações – expansão e repetições trinucleotídicas
Doença de Huntigton (neurodegenerative) – CAG em tandem (11-34); Muitas glutaminas na proteínas Huntintina.
Ribossomos
Ribossomo – números relacionados com a preciptação. Sempre a unidade menor vai se ligar ao mRNA.
Em procarioto: a subunidade menor possui 30S, a subunidade maior 40S, os dois juntos 70S.
Em eucarioto: a subunidade menor possui 40S, a subunidade maior 60S, os dois juntos 80S. 
No sítio P ocorre o rompimento da ligação de alta energia entre o aminoácido e o transportador. O aminoácido do tRNA que está no sítio P é então ligado ao aminoácido que está no sítio A, através da enzima peptidil transferase, que faz parte do ribossomo.
Síntese de polipeptídeos em procariontes
Em procarionte, a metionina do tRNA é formilada (formilmetionina), sendo capaz de reconhecer o codon AUG para iniciação. No processamento o aminoacido é removido. A síntese ocorre pela associação da subunidade 30S, um mRNA, fMET-tRNA, 3 proteinas (fatores da iniciação) e guanosine 5’ – trifostato (GTP).
Antibióticos
Estreptomincina e neomicina ligam se na partícula 30S e impedem a ligação do fmet tRNA ao sítio P.
Tetraciclinas impedem ligação do tRNA carreado.
Cloranfenicol inibe a peptidil transferase.
Eritromicina liga se a 50S livre impedindo a formação do ribossomo 70S.
Modificações pós-traducionais em eucariotos
- Fosforilação; glicosilação; hidroxilação e sulfidrilação.
Polirribossomos ou Polissomos
Formações constituídas por uma molécula de mRNA + vários ribossomos. Polissomos podem ser livres no citoplasma ou aderidos à membrana. 
Livres no citoplasma – sintetizam proteinas destinadas à célula; ocorre em células que sintetizam grande quantidade de proteínas usadas internamente no crescimento rápido. Exemplo: células cancerosas, embrionárias e reticulócitos (percursores das hemacias polissomos sintetizam hemoglobina).
Aderidos à membrana – sintetizam proteinas que serão secretadas e que compõem estruturas celulares membranosas.
Secretadas: glandula mamaria – em repouso – polissomos livres; em lactação – ligados a membrana do retículo. 
Membranosas: membrana plasmática, golgi, lisossomos, vacúolos.