Coma a vida funciona? - O processo de transcrição

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Como a vida funciona?
O processo de Transcrição
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Dogma central
O fluxo da informação é unidirecional
Refutação definitiva da herança dos caracteres adquiridos
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Transcrição
	O que é?: 
Processo de cópia do DNA em RNA (todos os RNAs da célula)
	Pra quê serve?
	Para ativação e desativação diferencial de genes
	Define o repertório de genes ativos a cada instante, o transcriptoma
	Muda de acordo com o tecido, alimentação, estímulos ambientais
	Um entendimento fino e preciso da regulação da transcrição gênica define a adaptação do indivíduo ao meio, diferenciação celular, embriogênese, etc...
	Genoma “ativo” no tempo
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Transcrição
Replicação
Transcrição
Tradução
Proteína
	 Processo para síntese de todos os RNAs da célula
	 Reflete o estado fisiológico da célula
	 O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável
	 Processo catalisado pelas RNAs polimerases dependentes de DNA
Transcrição Reversa
Replicação de RNA
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Transcrição
Características Gerais:
	Complementaridade 
	Antiparalelismo ( T = U)
	Síntese 5'  3‘
	RNA Polimerase (RNAP):
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E onde fica o RNA?
	Eucarioto – RNA produzido no núcleo e depois migra para o citoplasma
	Procarioto não tem núcleo.
	transcrição acoplada com a 
tradução
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O acoplamento
transcrição-tradução
Atenção: só em procariotos
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Eucariotos
RNA migra para o citoplasma
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RNA
	Ele é um intermediário do DNA (adaptador de Crick) para regular a produção de uma proteína
	Quanto mais se “precisa” da proteína, mais RNA dela é produzido => Regulação da transcrição
	Fatores de transcrição
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RNA
RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas.
DNA: Fita codificante: aquela que contém a sequencia direta do RNA
Fita molde: fita copiada pelo RNA
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O RNA é “maior” que a proteína
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	 Apenas uma das fitas do DNA é utilizada como molde, portanto, a molécula de RNA sintetizada é complementar à fita de DNA que lhe deu origem e idêntica à outra fita de DNA (anti-senso), sendo as timinas substituídas por uracilas.
Transcrição
Fitas molde e 
codificadora
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Transcrição
O molde é local
Genes podem ser transcritos utilizando uma das fitas de DNA como molde, enquanto outros podem utilizar a outra fita do DNA.
A escolha da fita molde depende da localização e orientação do promotor
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	 Esta enzima foi denominada RNA polimerase.
Transcrição
RNA POLIMERASE
	 Reconhece e liga-se a seqüências específicas de DNA;
	 Denatura o DNA expondo a seqüência de nucleotídeos a ser copiada;
	 Mantém as fitas de DNA separadas na região de síntese;
	 Mantém estável o híbrido DNA:RNA na região de síntese;
	 Renatura o DNA na região imediatamente posterior à da síntese;
	 Sozinha, ou com o auxílio de proteínas específicas, termina a síntese do RNA.
	 Podem clivar RNA sintetizado – correção de erros e recuperação de complexos de transcrição pausados
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Transcrição
RNA POLIMERASE PROCARIÓTICA
	Grande e complexa, a holoenzima RNA polimerase composta por 5 proteínas. A RNA polimerase interage com proteínas ativadoras e repressoras que modulam a taxa de expressão gênica nas células
	Subunidade	Número	Massa (kg)	Papel
	α	2	40	Participa da iniciação, liga-se a seqüências reguladoras
	β	1	155	Participa da iniciação e alongamento, forma ligações fosfodiéster
	β'	1	160	Liga-se a molde de DNA
	σ	1	32 a 90	Reconhece promotor, inicia síntese (dissociando-se logo após) 
	ω	1	Estabiliza o complexo
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RNA polimerase de E.coli
Ligação ao promotor
Centro catalítico
Reconhecimento específico do promotor
As RNA polimerases não tem mecanismo de correção de erro
(taxa de erro 10-5)
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Transcrição
RNA POLIMERASE EUCARIÓTICA
Em eucariotos existem vários subtipos de RNA polimerases envolvidas na síntese de RNAs específicos:
. RNA polimerase I – localizada no nucléolo e responsável pela síntese do RNA ribossômico
. RNA polimerase II – localizada no nucleoplasma e responsável pela síntese do RNA mensageiro
. RNA polimerase III – também localizada no nucleoplasma e responsável pela síntese do RNA transportador e uma variedade de RNAs pequenos que se complexarão à proteínas
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Transcrição
	 Reação ocorre entre o radical hidroxil da extremidade 3’ de um ribonucleotídeo e o grupo fosfato do carbono 5’ do ribonucleotídeo a ser incorporado
	 A reação processa-se no sentido 5’ 3’ e a fita de DNA copiada é a de sentido 3’ 5’
	 Diferentemente da DNA polimerase, a RNA polimerase não necessita de um iniciador para processar a síntese da nova fita
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Transcrição
1.INÍCIO
Reconhecimento de seqüências específicas no DNA
2. ALONGAMENTO
Incorporação dos ribonucleotídeos
3. TERMINAÇÃO
Seqüências no DNA são reconhecidas e a síntese é interrompida
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Transcrição - Início
	 O DNA apresenta seqüências específicas, denominadas PROMOTORES, que sinalizam exatamente onde a síntese do RNA deve ser iniciada.
	 A sequência dos promotores é bastante conservada nos genes.
	 Procarioto: Promotor é um conjunto de sequências do DNA onde o complexo RNAP se liga para iniciar a transcrição.
	 Eucarioto: Os promotores são, primeiramente, reconhecidos por fatores de transcrição que, ligados ao DNA, interagem com outros fatores, formando um complexo ao qual a RNA polimerase se associa.
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Transcrição – Início Procarioto
A holoenzima RNA polimerase liga-se especificamente nas regiões -10 e -35 em uma das faces da dupla fita (fita molde). Essa ligação ocorre na cavidade maior do DNA, onde as bases estão acessíveis a proteínas. Complexo binário fechado pois é composto de RNAP e DNA dupla hélice
A subunidade sigma (σ) da RNA polimerase reconhece a sequência do promotor.
+1: sítio de iniciação da transcrição – normalmente uma purina em procarioto.
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Os promotores procarióticos
	-35 box e o TATA box
Transcrição - Início
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Heterogeneidade de sequência
Reconhecimento pela unidade sigma
A sequência exata determina a força do promotor
Diferença na sequência altera interação da subunidade alfa e fator sigma
Transcrição - Início
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Subunidade Sigma -- σ
	A subunidade sigma (σ) da RNA polimerase é fundamental para o reconhecimento específico da região promotora. 
	Ela, juntamente ao cerne da enzima, desliza ao longo do DNA à procura do promotor, não precisando desenrolar a dupla hélice nem ligar-se e desligar-se a ela repetidamente.
Transcrição - Início
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Início da Transcrição
Reconhecimento e Ligação ao promotor
Deslocamento da subunidade sigma
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Transcrição - Início
	Após a ligação da RNA polimerase, forma-se o complexo de iniciação da transcrição;
	O complexo abre-se formando a bolha de transcrição – complexo binário aberto;
	Essa abertura ocorre na região -10 (TATAbox) a qual é rica em AT.
	Abertura posiciona o centro catalítico da RNAP no sítio de inicio da transcrição.
	Quando a síntese de RNA inicia forma-se o complexo terciário aberto pois uma terceira molécula o RNA está presente.
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Transcrição - Início
	Ocorre a incorporação de 2 primeiros ribonucleotídeos e a formação da ligação fosfodiéster;
	Após, a enzima sintetiza e libera alguns oligonucleotídeos de 2 a 9 pb;
	Enquanto o fator σ permanece ligado na enzima (fator que reconhece o sítio de início da transcrição), a enzima não se desloca e permanece na fase iniciação abortiva;
	Depois que o fator σ se desliga, a enzima fica livre para se deslocar e iniciar a fase de alongamento;
	O promotor e o fator σ ficam livres para iniciar outro ciclo de transcrição.
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Transcrição - Alongamento
Durante o alongamento, complexo RNAP desempenha várias atividades.
(1) Denatura o DNA expondo a seqüência de nucleotídeos a ser copiada;
(2) Mantém as fitas de DNA separadas na região de síntese;
(3) Catalisa a reação de incorporação de nucleotídeo;
 (4) Permite o tráfego dos ribonucleotídeos ao centro catalítico e a saída dos pirofosfatos resultante da reação de incorporação;
(5) Mantém estável o híbrido DNA:RNA na regiãode síntese;
(6) Separa o RNA sintetizado do híbrido e permite a sua saída do complexo de transcrição;
(7) Renatura o DNA na região imediatamente posterior à da síntese;
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Transcrição - Alongamento
	A polimerase desliza ao longo da fita molde estendendo uma cadeia de RNA crescente no sentido 5’ 3’ através da adição de ribonucleotídeos;
	Durante o alongamento, 18pb estão desnaturados e 12pb formam um híbrido DNA:RNA;
	O deslocamento da RNA polimerase gera superenrolamento positivo à frente da bolha de transcrição e negativo atrás da mesma, sendo necessárias topoisomerases para o bom funcionamento da enzima;
	Este processo ocorre até a RNA polimerase encontrar uma sequência específica no DNA que determina o término do alongamento.
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Transcrição - Alongamento
Velocidade de transcrição não é constante.
Fatores que influenciam:
- Ligação de proteínas ao complexo;
- Sequência ricas em GC;
Em algumas regiões a transcrição pode parar e ser retomada sem que o complexo seja desfeito – pausa 
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Bolha de transcrição
Fita molde
RNA polimerase
Direção da transcrição
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Direção da transcrição
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Terminação da transcrição
	Terminação normalmente determinada pror uma pausa com posteior dissociação do complexo.
Dois tipos de terminação:
	Independente de ρ
	Dependente de ρ
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Terminação da transcrição
Independente de ρ – maioria das bactérias.
	Independente de ρ: pares de nucleotideos A-T precedida por uma seqüência de DNA duplamente simétrica (terminação intrínseca)
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Terminação da transcrição
Independente de ρ – maioria das bactérias.
	Dependente de ρ: pares de nucleotideos A-T precedida por uma seqüência de DNA duplamente simétrica (terminação intrínseca)
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Terminação da transcrição através da formação do grampo de terminação
Longa pausa seguida de pareamento AU – desestabiliza o complexo de transcrição RNAP-DNA-RNA - liberando o RNA, DNA e RNAP livres. 
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Terminação da transcrição dependente da proteína ρ
 ρ (46kDa, ativa como hexâmero) move-se ao longo do RNA acompanhando a RNA polimerase
Com a pausa da RNA polimerase na sequência de terminação, ρ alcança a enzima
 ρ tem atividade de helicase e separa o híbrido RNA-DNA
Sequência de Terminação (espalhadas ao longo de 100pb antes do último nucleotídeo a ser incorporado dependente de ρ: rica em C 
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Sigma na iniciação da transcrição
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Transcrição em Eucariotos
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Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos
Transcrição
Processamento
Transporte
Tradução
Citoplasma
Núcleo
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RNA polimerases de eucariotos
Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição
	RNA pol I	Nucleólo	rRNA	Várias subunidades
	RNA pol II	Nucleoplasma	hnRNA (transcrito primário)
snRNA	Várias subunidades
	RNA pol III
	Nucleoplasma	rRNA 5S
tRNAs	Várias subunidades
	RNA pol Mitocondrial	Mitocondria	01 subunidade
	RNA pol de Cloroplastos	Cloroplasto	Similar as bacterianas
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Estrutura típica de um gene transcrito pela RNApol II
Promotor
Enhancer
Gene
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Enhancers
	Os enhancers ou acentuadores são seqüências de DNA que aumentam a afinidade da maquinaria de transcrição por um certo promotor. Essas seqüências podem estar localizadas acima (upstream), abaixo (downstream) ou dentro do gene a ser transcrito e podem também estar distantes muitos milhares de pares de base deste, e em qualquer uma das fitas.
Transcrição - Início
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Proteínas necessárias para transcrição a partir de promotores reconhecidos pela RNA Pol II 
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Promotores de genes transcritos pela RNApol II
Tata Binding Protein
Complexo TFIID
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Complexo de 
iniciação da transcrição
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	Em eucariotos, as 3 RNAs polimerases terminam a síntese em regiões de DNA ricas em T.
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO
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PROCESSAMENTO DO RNA
	Os diferentes RNAs sintetizados no processo de transcrição são chamados de transcritos primários;
	 Na maioria das vezes, esses transcritos não representam a molécula madura, ou seja, aquela cuja sequência e estrutura correspondem à forma final do RNA funcional;
	Esses transcritos necessitam sofrer modificações que fazem parte do processamento do RNA.
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	O transcrito primário da molécula de mRNA é também conhecido como pré-mRNA ou RNA heterogêneo (hnRNA);
	Este RNA precursor é sintetizado no núcleo e sofre várias alterações, transformado-se no que se chama mRNA (RNA maduro ou processado). O RNA maduro é, então, transportado para o citoplasma onde será traduzido;
	Os rRNAs e tRNAs são processados tanto em procariotos quanto em eucariotos. Já o processamento do hnRNA ocorre apenas em eucariotos.
PROCESSAMENTO DO RNA
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PROCESSAMENTO DO RNA
mRNA
Proteína
pré-mRNA
mRNA
DNA
tradução
transcrição
processamento
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	Capping – formação de 5’ cap;
	Polyadenylation – formação cauda poli A;
	Splicing – excisão de íntrons e junção dos éxons e o transporte para o citoplasma.
TRÊS PASSOS BÁSICOS DO PROCESSAMENTO
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	Após o início da transcrição da molécula de mRNA é adicionado um resíduo de guanina à sua extremidade 5’;
	 Este resíduo chamado “cap” sofre, então, metilação (adição do radical metil – CH3) no N7 da guanina, resultando na formação de uma 7-metil-guanosina;
	 O “cap” protege a extremidade 5’ da ação de exonucleases e, também, é utilizado para reconhecimento, pelo ribossomo, do sítio de início do processo de síntese proteica.
1. CAPPING - CAP 5’
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1. CAPPING - CAP 5’
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1. CAPPING - CAP 5’
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	A maioria dos mRNAs possui uma sequência de resíduos de adenina na sua extremidade 3’ que é chamada de cauda poliA e é adicionada à molécula após a transcrição pela enzima poliA polimerase;
	 Quando se reconhece a sequência 5’AAUAAA3’, altamente conservada e localizada 10 a 30 nucleotídeos “upstream” ao sítio de poliadenilação, é um sinal de que a molécula está terminando e que deve ser adicionada a cauda poliA à extremidade da mesma.
2. POLYADENYLATION - CAUDA POLI A
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	Funções:
	Facilitar transporte e tradução
	Estabilizar a molécula
	Quando ocorre:
	Após terminação
2. POLYADENYLATION - CAUDA POLI A
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2. POLYADENYLATION - CAUDA POLI A
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ESTRUTURA PROTEGIDA
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	Os íntrons apresentam um grau de conservação maior do que os éxons, além de apresentarem uma característica muito importante:
	Os primeiros e os últimos dois nucleotídeos da extremidade 5’ e 3’, GU e AG, são altamente conservados, indicando que os íntrons evoluíram de um ancestral comum.
5’ = GU (hn RNA) = início do íntron.
3’ = AG (hnRNA) = final do íntron.
3. SPLICING – EXCISÃO DE ÍNTRONS E JUNÇÃO DOS ÉXONS
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	Além disso, o íntron apresenta uma ADENINA a 40 nucleotídeos da extremidade 3’, a qual forma um sítio de ramificação;
	Splicing mediado por spliceossomo (ou encadeossomo):
	Spliceossomo = vários snRNPs (U1, U2, U4, U5, U6) + proteínas
	Ajuda a clivar no sítio de splicing;
	Remove os íntrons;
	Impede afastamento dos éxons;
	Une os éxons.
3. SPLICING – EXCISÃO DE ÍNTRONS E JUNÇÃO DOS EXONS
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3. SPLICING – EXCISÃO DE ÍNTRONS E JUNÇÃO DOS EXONS
	U1 snRNP liga-se à extremidade 5’;
	U2 snRNP liga-se ao sítio de ramificação (adenina);
	U5 snRNP liga-se à extremidade 3’;
	Após, U4 e U6 snRNPs ligam-se ao complexo formando o spliceossomo.
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3. SPLICING – EXCISÃO DE ÍNTRONS E JUNÇÃO DOS EXONS
	Primeira clivagem ocorre entre o éxon à esquerda e a extremidade 5’ do íntron;
	O sítio 5’ é então atacado pela adenina no sítio de ramificação;
	O sítio 3’ do íntron é então atacado pela extremidade 3’ do éxon à esquerda, ocorrendo a segunda clivagem;
	Ao final, o íntron é liberado na forma de um laço e os éxons são unidos.
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3. SPLICING – EXCISÃO DE ÍNTRONS E JUNÇÃO DOS EXONS
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3. SPLICING – EXCISÃO DE ÍNTRONS E JUNÇÃO DOS EXONS
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PROCESSAMENTO DO RNA
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	Um transcrito primário pode ser processado de diferentes maneiras, sendo que, o que é íntron para um mRNA pode ser éxon para outro;
	 Esta diferença de processamento pode ser devida à presença dedois ou mais sítios de poliadenilação e/ou à diferença no processo de splicing do hnRNA;
	Essa possibilidade de processamento diferencial em relação à retirada dos íntrons, chamamos de splicing alternativo.
SPLICING ALTERNATIVO
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Splicing alternativo
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Transporte para o citosol
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Transporte seletivo de mRNAs
	O transporte seletivo está associado ao processamento correto do RNA
	O complexo do poro nuclear reconhece e transporta apenas mRNAs completos
	Na sua síntese, o RNA se liga a uma série de proteínas:
	Complexo de ligação à capa
	Proteínas de splicing (SR)
	Proteínas de ligação à cauda poli-A
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Transporte seletivo de mRNAs
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Procariotos
Eucariotos
Splicing
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