: Cinética enzimática em placa de 96 poços

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Prática: Cinética enzimática em placa de 96 poços
 
INTRODUÇÃO
As enzimas (E) são essenciais para os processos bioquímicos do corpo, exercendo função de catalisadoras de reações. Em sua maioria, são proteínas, e algumas conseguem exercer sua função sem demais auxílios, enquanto outras precisam de um ou mais grupos prostéticos ligados aos resíduos de aminoácidos (AA), como um cofator (um ou mais íons metálicos) e/ou de uma coenzima (molécula orgânica complexa ou uma molécula metalorgânica). Uma enzima completa e cataliticamente ativa é chamada de holoenzima, enquanto só a parte proteica, sem cofator e coenzima, é chamada de apoenzima.
Figura 1. representação de apoenzima e holoenzima
	É possível dividi-las em seis classes, de acordo com as reações que catalisam. As oxido-redutases (reações de oxido-redução), transferases (reações de transferência de grupos), hidrolases (reações de hidrólise), liases (reações de adição de grupos à ligações duplas ou remoção destes, gerando ligações duplas), isomerases (reações de transferência de grupo pela mesma molécula) e, por fim, ligases (reações formando uma ligação química entre dois compostos, quebrando ATP ao mesmo tempo).
	Para realizar a catálise, a enzima fornece um ambiente favorável, que antes não existia, a certas reações. Isto, principalmente por causa da estabilidade das moléculas em ambiente aquoso, de pH neutro e temperatura moderada, como é dentro das células. O sítio ativo da enzima, coberto por resíduos de AA, liga-se ao substrato (molécula que sofre a ação) (S), formando o complexo enzima-substrato. Depois, a enzima exerce sua função, gerando um produto (P). Esta reação pode ser descrita como:
Reação 1. Descrição da catálise enzimática
	Como catalisador, a enzima acelera essa reação, mas não altera seu equilíbrio. A energia de reações nos sistemas biológicos pode ser interpretada com o diagrama de coordenadas, a energia livre do sistema livre (G). No diagrama da figura 2, é possível ver como a energia necessária para a reação (estado de transição) é consideravelmente menor quando há uma enzima (linha azul).
Figura 2. Diagrama comparando a energia livre necessária de uma reação não catalisada e uma catalisada.
	Também na figura 2, é possível notar a presença de dois intermediários da reação, os complexos de enzima e substrato (ES) e de enzima com o produto (EP). Quando ocorre mais de uma etapa na reação, como nesse caso, a velocidade total é determinada pelo que há uma maior energia de ativação, chamado de limitante. Para muitas enzimas, vários passos tem essa energia muito parecidas, então todos eles são parcialmente limitantes.
	A energia de ligação necessária para a catálise é a mesma que define a especificidade de uma enzima, ou seja, sua capacidade de discriminar o substrato e uma molécula competidora. Isso, por causa dos grupos funcionais no sítio ativo, feitos para interagirem com o substrato no estado de transição, então se não for o certo para a enzima específica, não ocorre uma interação tão forte. 
	Para a quebra e formação de ligações entre substrato e enzima, há o auxílio de três diferentes mecanismos exercidos por grupos funcionais. Primeiramente, catálise ácido-básica, que ocorre a formação de intermediários com carga e instáveis, que se quebram nas espécies reagentes. Temos também, a catálise covalente, que se baseia numa ligação covalente temporária entre enzima e substrato. Por fim, há a catálise por íons metálicos, que acontece quando estes se ligam à enzima ou são captados da solução. As interações iônicas entre os metais ligados à enzima auxiliam na orientação do substrato ou na estabilizar o estado de transição quando carregado.	A eficiência da enzima pode variar de acordo com o pH da solução, dependendo de como a protonação de seu sítio ativo influenciar na sua função e com a temperatura, como quando o valor é maior a velocidade cinética aumenta, porém, se for alta demais pode haver desnaturação.
	O principal meio de determinar a velocidade das reações e como diferentes fatores podem a afetar, é pela cinética enzimática. Um dos principais fatores que afetam essa velocidade é a concentração do substrato. Mede-se a velocidade inicial (Vo) ra reação, como a concentração muda durante a reação. Se a concentração for pequena, é possível ver a Vo aumentando linearmente. Entretanto, se for grande, Vo aumenta muito pouco quando comparada. Quando Vo aumenta insignificantemente conforme se aumenta a concentração de substrato, chama-se de velocidade máxima (Vmáx). Quando se relaciona a concentração de substrato e Vo, se obtém uma curva (Figura 4), que pode ser expressa pela equação Michaelis-Menten:
Figura 3. Equação de Michaelis-Menten
Figura 4. Curva feita a partir da equação de Michaelis-Menten
	Quando há a catálise de reações com mais de um substrato, todos os presentes se ligam à enzima, e é possível fazer a análise com a mesma equação mencionada anteriormente. A diferença é que haverá um Km diferente para cada substrato. Na maioria dos casos, há a transferência de um átomo ou grupo funcional entre os substratos presentes A ligação dos substratos podem ocorrer de forma certa, aleatória, ou então, em dois momentos diferentes, onde o primeiro vira produto antes que o outro se ligue. É possível fazer uma inibição da enzima, que ocorre quando uma substância se liga ao sítio ativo. Esse mecanismo pode ser reversível (ocorre a dissociação do complexo enzima-inibidor, que se ligam covalentemente) ou irreversível (o inibidor se liga covalentemente à enzima , destrói um grupo funcional ou, até, forma um complexo estável por associação não covalente.
	Desses mecanismos reversíveis, é possível dividí-los em quatro subcategorias. A primeira, os inibidores competitivos, que competem com o substrato pelo sítio ativo já que têm estruturas parecidas. Depois, temos os inibidores incompetitivos, que ligam-se em um sítio ativo do substrato quando se tem um complexo ES. Já os inibidores mistos, se ligam aos sítios não só ativos, aos quais o substrato também se liga. Por fim, os inibidores não competitivos, que também se ligam tanto ao complexo ES quanto a enzima sozinha. Já nos mecanismos irreversíveis, temos três tipos. Entre eles, têm-se os inibidores suicidas, que são relativamente não reativos até se ligarem ao sítio ativo. Na catálise, são convertidos para formar um composto muito reativo, que se liga irreversivelmente com a enzima. Além desse, também existem os análagos do estado de transição e os análogos de substrato.
OBJETIVOS
Os procedimentos realizados durante a prática tiveram como objetivo, não só disponibilizar contato empírico dos alunos com os tópicos de enzimologia e cinética enzimática, como também aferir as influências de diversos elementos externos (temperatura, pH, concentração do substrato e influência do inibidor) que proporcionam diferentes graus de desempenho da enzima. 
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais:
Soluções utilizadas: solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5, solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5, solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 10 mM em tampão água tipo III, solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5, Solução de Na2HPO4 1mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. tampão Tris-Pi-HCl), soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5, soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5, solução de NaOH 2 M e fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) 5μg/mL (Sigma Fine Chemicals).
Materiais utilizados: pipetador automático 20-100 μL, pipetador automático 200-1000 μL, placa de 96 poços para leitor de ELISA e tubos de ensaio.
Equipamentos utilizados: vortex, banho de gelo (0ºC), banho-maria (25ºC), banho-maria (37ºC), banho-maria (68ºC) e leitor de ELISA.
Métodos:
Curva padrão de PNP:
Foram transferidas alíquotas das soluções indicadas para seus respectivos tubos de ensaio, respeitando os volumes apresentados na tabela abaixo:
	Tubo nº
	Solução padrão de PNP 0,1mM(μL)
	Tampão Tris-HCl pH 9,5 1mM (μL)
	Solução de
NaOH 2M (μL)
	B
	-
	1000
	1,0
	1
	75
	925
	1,0
	2
	150
	850
	1,0
	3
	225
	775
	1,0
	4
	300
	700
	1,0
	5
	375
	625
	1,0
	6
	450
	550
	1,0
	7
	525
	475
	1,0
Tabela 1: Quantidade das substâncias adicionadas em cada tubo
Ao final da adição das soluções aos tubos de ensaio, os tubos foram homogeneizados manualmente e, por fim, foram retiradas alíquotas de 200μL e colocadas na placa de 96 poços para ser realizada a leitura espectrofotométrica no leitor de ELISA.
Curso temporal:
Primeiramente, 125µL da solução tampão Tris-HCl 0,2M com pH de 9,5 foram adicionados à placa de 96 poços, com o auxílio de um pipetador automático 20-200μL. Em seguida, foi aliquotado 62,5µL da solução de PNPP na placa. Logo após estas adições serem completadas, a placa foi levada para leitura espectrofotométrica. No instante imediatamente anterior ao posicionamento da placa no leitor, 12,5µL da solução de enzima foram adicionados ao poço. O leitor foi previamente configurado para realizar uma leitura a cada 3 minutos, num intervalo de 45 minutos.
Influência da temperatura:
Inicialmente, com auxílio da pipeta automática 100-1000µL, foram transferidos 500µL de solução tampão Tris-HCl de pH 9,5 para os tubos de ensaio numerados de 1 a 4, e seus respectivos brancos. Logo após a transferência, foram adicionados 250µL de solução de PNPP a cada um deles. Em seguida, os tubos foram levadas para pré-incubação, a diferentes temperaturas. Todas as pré-incubações levaram 20 minutos e, após esse tempo, foram adicionados 50µL de enzima aos tubos 1 a 4 e 200µL de NaOH, nesta ordem. A adição nos brancos foi o inverso da descrita para os tubos 1 a 4. Ao final das adições, foram recolhidas alíquotas de 200µL de cada tubo, aliquotando-as na placa de 96 poços para leitura a 405nm no leitor de ELISA.
	Tubo nº
	Tampão Tris HCl, pH 9,5 (μL)
	PNPP
1 mM (μL)
	Temperatura (ºC)
	Enzima (μL)
	Solução de
NaOH (μL)
	1B
	500
	250
	4
	50
	200
	1
	500
	250
	4
	50
	200
	2B
	500
	250
	Ambiente
	50
	200
	2
	500
	250
	Ambiente
	50
	200
	3B
	500
	250
	37
	50
	200
	3
	500
	250
	37
	50
	200
	4B
	500
	250
	68
	50
	200
	4
	500
	250
	68
	50
	200
Tabela 2: Quantidade das substâncias e temperatura para incubação adicionadas em cada tubo
Influência do pH:
Foram transferidos, com auxílio das micropipetas p200 e p1000, alíquotas das soluções indicadas para os tubos de ensaio na ordem descrita na tabela abaixo, com exceção da solução de enzima e de NaOH que serão adicionadas posteriormente. No momento posterior a aliquotagem, foram adicionados com o auxílio de uma micropipeta p200, 50μL da solução de enzima aos tubos 1 a 9, sendo realizados intervalos de 5 segundos entre cada tubo, determinando o horário exato da primeira adição e homogeneizando rigorosamente ao final de cada adição. Posteriormente, procedeu-se com a incubação de todos os tubos em banho-maria a 37ºC por 15 minutos. Por último, acrescentou-se 200μL de NaOH 2M aos tubos em intervalos de 5 segundos entre cada adição, homogeneizando os tubos rigorosamente. Imediatamente antes da leitura, foram adicionados 50μL aos tubos restantes, sendo realizada a leitura espectrofotométrica da absorbância, a 405 nm, com alíquotas de 200μL de cada tubo adicionadas na placa de 96 poços.
	
Tubo nº
	
Solução tampão
Citratato-HCl (µL)
	
Solução tampão
Tris-HCl (µL)
	
Solução tampão
Borato-NaOH (µL)
	
PNPP 1mM (µL)
	
Enzima
(µL)
	
NaOH(µL)
	
	pH 5,5
	pH 6,5
	pH 7,5
	pH 7,5
	pH 8,5
	pH 9,5
	pH 9,5
	pH 10,5
	pH 11,5
	
	
	
	B1-3
	
	500
	
	
	
	
	
	
	
	25
	50
	200
	B4-6
	
	
	
	
	500
	
	
	
	
	25
	50
	200
	B7-9
	
	
	
	
	
	
	
	500
	
	25
	50
	200
	1
	725
	
	
	
	
	
	
	
	
	25
	50
	200
	2
	
	725
	
	
	
	
	
	
	
	25
	50
	200
	3
	
	
	725
	
	
	
	
	
	
	25
	50
	200
	4
	
	
	
	725
	
	
	
	
	
	25
	50
	200
	5
	
	
	
	
	725
	
	
	
	
	25
	50
	200
	6
	
	
	
	
	
	725
	
	
	
	25
	50
	200
	7
	
	
	
	
	
	
	725
	
	
	25
	50
	200
	8
	
	
	
	
	
	
	
	725
	
	25
	50
	200
	9
	
	
	
	
	
	
	
	
	725
	25
	50
	200
Tabela 3: Quantidade das substâncias adicionadas em cada tubo
Curva de substrato:
Com o auxílio das micropipetas p200 e p1000, transferiu-se alíquotas de solução tampão Tris-HCl de pH 9,5 e de PNPP seguindo os volumes demonstrados na tabela abaixo. Em seguida, adicionou-se no tubo branco (B) NaOH e, logo depois, a enzima, também sendo respeitados os volumes da tabela 4. Nos tubos de 1 a 13, adicionou-se 50μL da solução de enzima em intervalos de 20 segundos entre cada tubo. Após as aliquotagens descritas acima, os tubos foram homogeneizados rigorosamente e, logo após, foram incubados em temperatura ambiente por 30 minutos. Cessou-se a reação acrescentando-se 200μL NaOH aos tubos de 1 a 13 em intervalos de 20 segundos entre cada adição. Por fim, foram retiradas alíquotas de 200μL de cada tubo e adicionadas aos poços da placa de 96 poços para leitura espectrofotométrica, a 405nm, no leitor de ELISA.
	Tubo nº
	Tampão Tris HCl, pH 9,5 (μL)
	PNPP
1 mM (μL)
	Enzima (μL)
	Solução de
NaOH (μL)
	B
	725
	25
	50
	200
	1
	725
	25
	50
	200
	2
	700
	50
	50
	200
	3
	675
	75
	50
	200
	4
	650
	100
	50
	200
	5
	600
	150
	50
	200
	6
	550
	200
	50
	200
	7
	500
	250
	50
	200
	8
	450
	300
	50
	200
	9
	375
	375
	50
	200
	10
	300
	450
	50
	200
	11
	225
	525
	50
	200
	12
	150
	600
	50
	200
	13
	75
	675
	50
	200
Tabela 4: Quantidade das substâncias adicionadas em cada tubo
Influência do inibidor:
Com o auxílio dos pipetadores automáticos 20-200μL e 100-1000μL, transferiu-se alíquotas de solução tampão Tris-PI-HCl de pH 9,5, de PNPP e de Inibidor para os tubos de ensaio seguindo os volumes descritos na tabela abaixo. Em seguida, adicionou-se no tubo branco (B) 200μL de NaOH e, logo depois, a 50μL da solução de enzima. Nos tubos de 1 a 13, acrescentou-se a 50μL da solução de enzima em intervalos de 20 segundos entre cada tubo. Logo após as adições descritas anteriormente, realizou-se homogeneizações rigorosas em todos os tubos e, em seguida, realizou-se a incubação em temperatura ambiente por 30 minutos. Paralisou-se a reação aliquotando 200μL NaOH nos tubos de 1 a 13 em intervalos de 20 segundos entre cada aliquotagem. Após o término das aliquotagens, foram adicionados 200μL de cada tubo na placa de 96 poços para leitura a 405nm no leitor ELISA.
	Tubo nº
	Tampão Tris-PI-HCl, pH 9,5 (μL)
	PNPP
1 mM (μL)
	Inibidor (μL)
	Enzima (μL)
	Solução de
NaOH (μL)
	B
	650
	25
	75
	50
	200
	1
	650
	25
	75
	50
	200
	2
	625
	50
	75
	50
	200
	3
	600
	75
	75
	50
	200
	4
	575
	100
	75
	50
	200
	5
	525
	150
	75
	50
	200
	6
	475
	200
	75
	50
	200
	7
	425
	250
	75
	50
	200
	8
	375
	300
	75
	50
	200
	9
	300
	375
	75
	50
	200
	10
	225
	450
	75
	50
	200
	11
	150
	525
	75
	50
	200
	12
	75
	600
	75
	50
	200
	13
	-
	675
	75
	50
	200
Tabela 5: Quantidade das substâncias adicionadas em cada tubo
RESULTADOS
CURVA PADRÃO DE PNP
A fim de elucidar na interpretação dos resultados obtidos no primeiro ensaio, apresentam-se os valores de cada uma das soluções utilizadas que foram descritas anteriormente, assim como suas respectivas quantidades e absorbância na seguinte tabela:
	Tubo nº
	Solução padrão de PNP 0,1mM (μL)
	Tampão Tris-HCl pH 9,5 1mM (μL)
	Solução de
NaOH 2M (μL)
	Nmoles de PNP (X)
	ABS 405nm (Y)
	B
	-
	1000
	1,0
	0
	0,061
	1
	75
	925
	1,0
	7,5
	0,120
	2
	150
	850
	1,0
	15
	0,170
	3
	225
	775
	1,0
	22,5
	0,254
	4
	300
	700
	1,0
	30
	0,315
	5
	375
	625
	1,0
	37,5
	0,395
	6
	450
	550
	1,045
	0,461
	7
	525
	475
	1,0
	52,5
	0,534
Tabela 6: Curva padrão PNP: volume das soluções em cada tubo de ensaio, com concentrações de analito e suas respectivas absorbâncias.
As concentrações de PNP apresentadas no primeiro gráfico foram obtidas através de cálculos de diluição e conversão de unidade para nmoles, utilizando a concentração da solução padrão de PNP (0,1 mM/mL):
Fórmula utilizada para calcular a concentração final após a diluição: Ci * Vi = Cf * Vf
Tubo 1 Ci * Vi = Cf * Vf
0,1 * 75 = Cf * 1000
Cf = 0,0075 * 103 (converter para nmoles)
Cf = 7,5 nmoles/L
Tubo 2 Ci * Vi = Cf * Vf
0,1 * 150 = Cf * 1000
Cf = 0,015 * 103 (converter para nmoles)
Cf = 15 nmoles/mL
Tubo 3 Ci * Vi = Cf * Vf
0,1 * 225 = Cf * 1000
Cf = 0,0225 * 103 (converter para nmoles)
Cf = 22,5 nmoles/L
Tubo 4 Ci * Vi = Cf * Vf
0,1 * 300 = Cf * 1000
Cf = 0,03 * 103 (converter para nmoles)
Cf = 30 nmoles/L
Tubo 5 Ci * Vi = Cf * Vf
0,1 * 375 = Cf * 1000
Cf = 0,0375 * 103 (converter para nmoles)
Cf = 37,5 nmoles/L
Tubo 6 Ci * Vi = Cf * Vf
0,1 * 450 = Cf * 1000
Cf = 0,045 * 103 (converter para nmoles)
Cf = 45 nmoles/L
Tubo 7 Ci * Vi = Cf * Vf
0,1 * 525 = Cf * 1000
Cf = 0,0525 * 103 (converter para nmoles)
Cf = 52,5 nmoles/L
Descontando as absorbâncias do branco nos demais tubos:
Abs 1: 0,120 – 0,061 = 0,059
Abs 2: 0,170 – 0,061 = 0,109
Abs 3: 0,254 – 0,061 = 0,193
Abs 4: 0,315 – 0,061 = 0,254
Abs 5: 0,395 – 0,061 = 0,334
Abs 6: 0,461 – 0,061 = 0,4
Abs 7: 0,534 – 0,061 = 0,473
Este ensaio serviu como base para realizar os cálculos para determinar a concentração de produto gerado nos ensaios seguintes com a enzima fosfatase alcalina. Desse modo, confeccionou-se um gráfico com os valores de absorbância e concentração supracitados:
Gráfico 1: Curva padrão de PNP: Absorbância em função da concentração.
A partir da curva padrão PNP é possível determinar a concentração da amostra. Ao submeter a amostra a leitura de absorbância no espectrofotômetro (leitor de ELISA), valores de uma faixa de comprimentos de onda são atribuídos ao composto, fornecendo informações referentes à capacidade de absorção de luz em um determinado comprimento de onda. Debruçando-se nesse método, a interação da luz com o composto fornece a caracterização da amostra, através do qual a variação dos valores de concentração e absorbância permitem calcular o coeficiente angular da reta e determinar a concentração exata do composto. Para tal, considerou-se o valor de b como sendo zero na equação da reta y = ax + b. 
No entanto, utilizou-se de um outro método de cálculo para determinar a concentração de PNP nos outros ensaios e a velocidade inicial, isto é, o fator de calibração média (FCM). Esse fator irá relacionar o somatório de todas as absorbâncias já descontadas do tubo branco dividido pelo somatório das concentrações já calculadas no ensaio da curva padrão PNP. O valor gerado por essa divisão estará em nM/mL (nanomoles por mililitro). A velocidade inicial (V0), portanto, será essa concentração dividida pelo tempo de reação, sendo a unidade expressa em nmoles/min (nanomoles por minuto). A absorbância de cada tubo utilizado nos cálculos consiste na diferença entre os valores apresentados na tabela 1 descontados do tubo de calibração, o branco. O FCM será então:
Fator de Calibração Média: 
CURSO TEMPORAL
Nesse segundo ensaio do Curso Temporal consistiu basicamente para analisar o avanço da reação, medindo a produção do produto PNP em função do tempo em minutos e ver como a velocidade inicial vai decrescendo com o avanço do tempo. Para tal, moldou-se uma tabela que contém o tempo, absorbância em cada faixa desse tempo, a concentração e a velocidade inicial. Também confeccionou-se um gráfico que irá relacionar a concentração de PNP em nmoles/mL em função do tempo em minutos.
	Tempo
(min)
	Absorbância corrigida
(406nm)
	Concentração
(nM/L)
	Velocidade inicial
	0’00’’
	 0,000
	16,621
	-
	3’00’’
	0,073
	12,46164
	4,153881
	6’00’’
	0,135
	22,96284
	3,827139
	9’00’’
	0,202
	34,41868
	3,824298
	12’00’’
	0,264
	44,97102
	3,747585
	15’00’’
	0,325
	55,33583
	3,689056
	18’00’’
	0,382
	65,10399
	3,616888
	21’00’’
	0,436
	74,29253
	3,53774
	24’00’’
	0,488
	83,14013
	3,464172
	27’00’’
	0,536
	91,42516
	3,386117
	30’00’’
	0,584
	99,55677
	3,318559
	33’00’’
	0,629
	107,194
	3,248303
	36’00’’
	0,672
	114,5755
	3,182653
	39’00’’
	0,715
	121,9229
	3,126229
	42’00’’
	0,754
	128,5373
	3,060413
	45’00’’
	0,792
	135,0835
	3,001856
	48’00’’
	0,831
	141,5786
	2,949554
	51’00’’
	0,867
	147,7327
	2,89672
	54’00’’
	0,902
	153,6993
	2,846283
	57’00’’
	0,935
	159,3931
	2,79637
	60’00’’
	0,968
	164,9847
	2,749744
Tabela 7: Absorbância corrigida, concentração e velocidade inicial.
A partir desses valores de velocidade inicial pôde-se confeccionar um gráfico no qual relaciona a concentração de PNP em função do tempo em minutos. Os valores exibidos na tabela 2 foram calculados do mesmo modo que o ensaio anterior, descontando a absorbância de cada tempo do branco. Após isso, dividiu-se o valor de absorbância pela constante FCM. O resultado consiste na concentração demonstrada na tabela 2. Para calcular o V0, dividiu-se a concentração pelo respectivo tempo. O cálculo da absorbância 1, como exemplo, está logo abaixo:
Abs 1 = 0,073 [PNP] = = = 12,44460 nM/L ÷ 3 = 4,14819865 nM/min
E para todos os valores de absorbância foi realizado essa mesma equação, alterando as variáveis.
A partir dos valores de concentração em nM/L, foi possível moldar um gráfico no qual relaciona a concentração do produto PNP em função do tempo em minutos.
Gráfico 2: Curso temporal: Concentração do produto em função do tempo.
INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA
Para realizar a análise do comportamento enzimático com a temperatura, confeccionou-se uma tabela contendo os tubos, a temperatura utilizada, a absorbância de cada tubo e o volume das soluções utilizadas em microlitros. Além disso, utilizou-se um gráfico no qual relaciona a velocidade inicial com a temperatura em graus Celsius, para observar o comportamento da enzima em cada faixa de temperatura.
	Tubos
	Tampão Tris-HCl pH
9,5 (µL)
	PNPP 1mM (µL)
	Temperatura (oC)
	Enzima (µL)
	Solução de NaOH (µL)
	ABS (405 nm)
	1B
	500
	250
	4
	50
	200
	0,053
	1
	500
	250
	4
	50
	200
	0,087
	2B
	500
	250
	Ambiente
	50
	200
	0,054
	2
	500
	250
	Ambiente
	50
	200
	0,427
	3B
	500
	250
	37
	50
	200
	0,056
	3
	500
	250
	37
	50
	200
	0,591
	4B
	500
	250
	68
	50
	200
	0,058
	4
	500
	250
	68
	50
	200
	0,081
Tabela 8: Influência da Temperatura: temperatura, absorbância e os volumes das soluções utilizadas.
Para moldar o gráfico de barras no qual relaciona a velocidade inicial e a temperatura, fez-se necessário realizar cálculos determinam a concentração e o V0. Primeiramente, descontou-se a absorbância dos tubos de seus respectivos brancos e dividiu cada valor resultante pelo fator de calibração média, ou seja, a constante calculada no ensaio de curva padrão PNP. O resultado da divisão está expresso em nmoles/mL. A velocidade inicial, então, será dividir a concentração calculada pelo tempo constante de reação enzimática (20 minutos). O valor calculado estará em nmoles/min. Tal explicação dos cálculos está demonstrado logo a seguir:
Cálculo realizado para descontar o branco das absorbâncias dos respectivos tubos, exemplo do tubo 1:
Abs 1: 0,087 – 0,053 = 0,034 [PNP] = = = 5,796113195 nM/L ÷ 20 = 0,289805659 nM/min. Será o V0 do tubo 1
Com os valores de velocidadeinicial de todos os 4 tubos e as temperaturas que foram submetidos, pôde-se confeccionar um gráfico de barras que relaciona o V0 no eixo y e a temperatura no eixo x.
Gráfico 3: Influência da temperatura: Velocidade inicial em função da variação de temperatura.
INFLUÊNCIA DO pH
Fez-se necessário confeccionar uma tabela que contém o pH de cada um dos 9 tubos, inclusive os brancos, a absorbância de todos os tubos, a respectiva concentração e a velocidade inicial. Além disso, para compreender de forma sucinta a influência do pH na velocidade da reação enzimática e como ele afeta a proteína, utilizou-se também de um gráfico de barras no qual relaciona os valores de V0 em função do pH utilizado.
	Tubos
	pH
	Absorbância
	Concentração (nmoles/mL
	Velocidade Inicial
(nmoles/min)
	B 1-3
	6,5
	0,061
	-
	-
	1
	5,5
	0,138
	4,139784946
	0,206989247
	2
	6,5
	0,183
	6,559139785
	0,327956989
	3
	7,5
	0,204
	7,688172043
	0,384408602
	B 4-6
	8,5
	0,082
	-
	-
	4
	7,5
	0,300
	11,72043011
	0,586021505
	5
	8,5
	0,398
	16,98924731
	0,849462365
	6
	9,5
	0,643
	30,16129032
	1,508064516
	B 7-9
	10,5
	0,075
	-
	-
	7
	9,5
	0,187
	6,021505376
	0,301075268
	8
	10,5
	0,131
	3,010752688
	0,150537634
	9
	11,5
	0,097
	1,182795699
	0,059139784
Tabela 9: Influência do pH: Absorbância, concentrações e velocidade inicial de todos os tubos, exceto do branco.
Para chegar às concentrações exibidas na tabela quatro e à velocidade inicial da reação enzimática, fez-se o mesmo procedimento matemático anterior para calcular o V0 de todos os tubos numerados. Desse modo, descontou-se a absorbância do branco nos três primeiros tubos de acordo com a designação numérica exibida na tabela 3 e fez o mesmo para os demais tubos. Com os resultados em posse, pegou-se a absorbância de cada tubo e dividiu-se pelo FCM e o resultado foi expresso em nM/L, isto é, a concentração de PNP. Esse valor, portanto, foi dividido pelo tempo constante de reação (20 minutos) para calcular a velocidade inicial de reação em nmoles/min. O cálculo está logo abaixo, como exemplo o do tubo 1:
Descontando a absorbância do tubo branco de seu respectivo número.
Abs 1: 0,077 – 0,065 = 0,012 [PNP] = = = 2.04568701 nM/L ÷ 20 = 0,10228435 nM/min.
A partir desses valores de V0 calculados confeccionou-se um gráfico de barras que relaciona os valores de velocidade inicial em função de cada pH.
Gráfico 4: Influência do pH: Velocidade inicial em função da variação de pH.
INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO E INIBIDOR
Fez-se necessário confeccionar uma tabela que contém a absorbância de cada um dos tubos, inclusive o branco, a concentração de produto e a Velocidade inicial de cada tubo para cada teste e em seguida fez-se um gráfico relacionando a Vo e a concentração de substrato para cada um e mais outro com a mesma finalidade só que utilizando o método de lineweaver-burk a fim de tornar mais fácil a percepção de certas características. Os valores de absorbância nas tabelas seguintes já estão descontados o valor de abs. do tubo branco.
	tubos
	ABS
	Concentraçãode
PNP(nM/L)
	Vo
	PNPP 1mM (µL)
	B
	0,000
	5,626
	0,281282
	25
	1
	0,033
	8,353
	0,417661
	25
	2
	0,049
	16,025
	0,801227
	50
	3
	0,094
	15,343
	0,767133
	75
	4
	0,090
	20,286
	1,01432
	100
	5
	0,119
	23,014
	1,150699
	150
	6
	0,135
	24,548
	1,227412
	200
	7
	0,144
	26,423
	1,321173
	250
	8
	0,155
	29,151
	1,457552
	300
	9
	0,171
	29,322
	1,466076
	375
	10
	0,172
	36,652
	1,832595
	450
	11
	0,215
	36,311
	1,815547
	525
	12
	0,213
	34,606
	1,73031
	600
	13
	0,203
	5,626
	0,281282
	675
Tabela 10: Influência do substrato: Absorbância corrigida, concentrações e Vo.
	Tubos
	ABS
	ConcentraçãoDe
PNP(nM/L)
	Vo
	PNPP 1mM (µL)
	B
	0,000
	2,438
	0,121889
	25
	1
	0,014
	4,432
	0,221616
	25
	2
	0,026
	5,285
	0,264235
	50
	3
	0,031
	7,876
	0,393795
	75
	4
	0,046
	9,495
	0,47477
	100
	5
	0,056
	13,502
	0,675077
	150
	6
	0,079
	15,632
	0,781623
	200
	7
	0,092
	18,752
	0,937607
	250
	8
	0,110
	21,258
	1,062905
	300
	9
	0,125
	25,827
	1,29134
	375
	10
	0,152
	27,532
	1,376577
	450
	11
	0,162
	28,179
	1,408967
	525
	12
	0,165
	30,395
	1,519775
	600
	13
	0,178
	2,438
	0,121889
	675
Tabela 11: Influência do inibidor: Absorbância corrigida, concentrações e Vo.
Para chegar às concentrações exibidas na tabela 5 e 6 e à velocidade inicial da reação enzimática, fez-se o mesmo procedimento matemático anterior para calcular o Vo de todos os tubos numerados. Desse modo, descontou-se a absorbância do branco nos outros tubos. Com os resultados em posse, pegou-se a absorbância de cada tubo e dividiu-se pelo FCM e o resultado foi expresso em nmoles/mL, isto é, a concentração de PNP. Esse valor, portanto, foi dividido pelo tempo constante de reação (20 minutos) para calcular a velocidade inicial de reação em nmoles/min. Foi realizado o calculo a seguir para todos os tubos como, por exemplo, o do tubo 1 demonstrado abaixo:
Cálculo da concentração de PNP e Vo
Abs 1: [PNP] = = = 5,625639277 nM/L ÷ 20 = 2,812819639 nM/min.
Repetiu-se o mesmo cálculo trocando-se os valores para a influência do inibidor. Com estes dados em mãos, construiu-se os gráficos relacionando a Vo e a concentração de substrato (PNPP) com base no modelo de Michaelis Menten e no de lineweaver burk. Segue abaixo:
Gráfico 5: Influência da concentração de substrato e inibidor: Velocidade inicial em função da concentração de substrato
A partir deste gráfico conhecido como gráfico de Michaelis Menten, pode-se então fazer outro gráfico denominado de “duplo reciproco” (vide abaixo), somente elevando a “-1” os valores utilizados nos eixos x e y do gráfico acima.
Gráfico 6: Influência da concentração de substrato e inibidor pelo método Linewear-Burk
A partir deste gráfico e da equação do mesmo extraída do Excel pode-se então retirar-se e calcular-se valores importantes como o Km e a Vmáx. Mas antes e necessário tomar conhecimento a respeito da equação do gráfico e o que a mesma significa. (Vide abaixo)
Fígura 6: Relação dos coeficientes da reta com os valores da cinética enzimática. Retirado de- http://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/tecnologia/luciamariacararetoalves/aula-7---cinetica-enzimatica.pdf
Tendo posse disto e da equação de ambas as retas e possível calcular os valores de Km e de Vmáx que serão muito uteis ao analisar o comportamento enzimático.
Cálculos de Vmáx e Km para a reta sem o inibidor:
Como se possui o valor de b para achar o valor de Vmáx, basta dividir 1 por este valor:
valor:
 = 0,536999248 = Vmáx
 Achando a Vmáx substitui-se a mesma no valor de a para se encontrar o Km:
a = = 198,95 = logo Km é igual a 106,8360004
Repete-se o mesmo procedimento para a outra reta somente trocando os valores de a e b. Sendo assim, os valores de Km e de Vmáx encontrados foram:
	
	Vmáx
	Km
	Sem inibidor
	2,016942315
	0,006050826945
	Com inibidor
	0,536999248
	106,8360004
Tabela 12: Valores de Km e Vmax encontrados.
DISCUSSÃO
Em posse de todos os resultados supracitados, pode-se notar que as enzimas possuem condições experimentais do meio biológico para que sua atividade seja a máxima. Desse modo, fatores como temperatura, pH, concentração do substrato e a presença de um inibidor irão interferir diretamente no funcionamento sucinto da proteína em questão. A partir das tangentes confeccionadas na origem das curvas de concentração de substrato e de produto em função do tempo permitiram calcular o V0, isto é, a partir do gráfico de curva padrão PNP. Tal velocidade inicial é para uma determinada concentração de enzima e substrato de acordo com as condições experimentais definidas. As medidas de velocidade inicial catalisadas enzimaticamente, por sua vez, são imprescindíveis para o completo entendimentodo mecanismo de reação enzimática, assim como para estimar como tal proteína se comportará em uma amostra biológica. Daí a importância fundamental de definir o V0 de uma determinada enzima em cada condição descrita anteriormente. 
Os valores de velocidade inicial são influenciados por diversos fatores do ambiente biológico no qual a enzima encontra-se, como temperatura, pH, concentração de substrato e presença de inibidor. No ensaio de curso temporal, foi possível observar que o tempo consiste em uma das variáveis para a atividade enzimática. Conforme o tempo foi avançando, notou-se um aumento gradual da concentração de produto no meio irracional de acordo com a tabela 2, o que indica que a atividade enzimática é influenciada diretamente pelo tempo em que a enzima está submetida ao contato com o substrato. Portanto, enquanto houver substrato na solução, mais produto será formado e, consequentemente, a concentração dele irá aumentar progressivamente com o avanço do tempo. Ademais, notou-se também que a velocidade inicial diminuiu gradualmente com o avançar do tempo, indicando que o V0 é proporcional à concentração de substrato no meio. 
No ensaio de temperatura, analisou-se que em cada faixa de temperatura há uma velocidade associada. Com isso, pôde-se perceber que a melhor temperatura para a atividade enzimática foi à 37 graus celcius, valor onde há a maior concentração de PNP e velocidade inicial em comparação às demais faixas de temperatura em que a enzima foi submetida. A quantidade de calor no meio irracional promove um aumento da energia cinética nas moléculas ali contidas, favorecendo o choque efetivo dela e promovendo a reação química para o sentido direto de reação. Desse modo, o aumento da temperatura acarreta em uma elevação da atividade enzimática, mas tal elevação irá até um máximo, isto é, após a uma determinada temperatura a concentração de substrato declina e, por consequência, a velocidade inicial também, algo que observa-se na faixa de temperatura de 68°C. Tal fato pode ser explicado pela perda da atividade biológica devido à desnaturação da proteína e perda da conformação tridimensional dela, rompendo as ligações de hidrogênio.
No ensaio de pH, notou-se que a melhor faixa de pH é o 9,5 no tampão TRIS-HCl. Isso pode ser explicado devido à composição química presente no tampão, o qual relaciona-se com os resíduos de aminoácidos presentes nas cadeias laterais da enzima, o que explica que mesmo estando no pH 9,5, o tampão Borato-NaOH não é eficiente para a proteína. Cada enzima vem com seu respectivo tampão de melhor atividade biológica direto da indústria. 
No ensaio da influência do substrato sem o inibidor, percebe-se a alteração da velocidade de reação ao decorrer do aumento da concentração de substrato. Isso deve-se pelo fato de que nos primeiros tubos há uma quantidade pequena de substrato, limitando assim a velocidade da reação enzimática, pois provavelmente há pouco substrato para muita enzima. No entanto, ao decorrer da adição de substrato (nos tubos subsequentes), percebe-se o aumento da velocidade de reação, pois agora tem-se uma maior quantidade de substrato, possibilitando assim uma maior interação entre enzima-substrato (vide equação abaixo). Contudo, chega a um momento em que quase não se nota a variação da velocidade enzimática e isto pode ser explicado devido à grande concentração de substrato, pois agora há tanto dessa substância que praticamente toda a enzima no sistema encontra-se complexada com o substrato, formando o complexo enzima-substrato (ES), impossibilitando assim o incremento da velocidade na velocidade de reação enzimática. 
Já ao inserir-se o inibidor enzimático dentro do meio reacional, percebe-se uma redução significativa na velocidade reacional e, consequentemente, na atividade enzimática, isso porque os inibidores, como o próprio o nome já diz, são substâncias capazes de modificar a atividade enzimática, mais especificamente, interferindo na catálise enzimática, assim diminuindo e/ou interrompendo as reações enzimáticas. O modo que os mesmos atuarão no equilíbrio entre a enzima e o substrato os difere uns dos outros, algo que será argumentado melhor nos próximos parágrafos. 
Primeiramente é necessário observar os valores de Km obtidos em ambos os gráficos (duplo recíproco), pois o mesmo refere-se à quantidade de substrato necessária para se alcançar metade da velocidade máxima, e apresenta uma noção de afinidade da enzima com o substrato, ou seja, quanto maior o Km menor será a afinidade da enzima pelo substrato, necessitando de uma maior quantidade do mesmo para a reação “engrenar”. Comparando os dois valores, percebe-se que quando houve a introdução do inibidor o Km aumentou, indicando assim sua eficácia de inibição para esta enzima, porém, para classificá-lo em um dos tipos de inibidores existentes, é preciso ainda que se compare as velocidades máximas e fazendo isto nota-se que houve uma pequena variação, variação que pode ter sido decorrida de pequenos erros experimentais. Em decorrência disso, considera-se que as velocidades máximas praticamente não se alteraram.
Com tais fatos supracitados, pode-se concluir que o inibidor utilizado foi um inibidor competitivo, pois há alteração do Km, esse tipo de inibidor é uma molécula que compete com o substrato pelo sítio ativo. A partir da desfosforilação do substrato, se forma um intermediário da enzima fosforilada, que sequentemente hidrolisada e o fosfato retorna para o meio. Porém ao aumentar a concentração de fosfato no meio pela adição de NaHPO4 a concentração de fosfato no meio aumenta e o mesmo atua como inibidor competitivo, competindo com o substrato para se ligar ao sítio ativo da enzima. Dessa forma, baixas concentrações de substrato promovem uma diminuição da velocidade com a presença de inibidor, mas ao aumentar a concentração de substrato, por ter mais do mesmo disponível e pela enzima ter maior afinidade a ele que ao inibidor, quase toda enzima se ligará ao substrato.
BIBLIOGRAFIA
NELSON, David L., Princípios de bioquímica de Lehninger. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2011. 1274p.
Berg, Jeremy M. Bioquímica 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2012. 1114 p.
VOET, Donald; VOET, Judith G. Bioquímica. 4. ed. Porto Alegre, Artmed, 2013.
Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L.: BIOQUÍMICA, 5 edição, Editora Guanabara Koogan S. A., Rio de Janeiro, 2004.
NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de Bioquímica de Lehninguer. 5° edição. Porto Alegre: Artmed, 2011.