cinética enzimática : ph otimo e determinação do km

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RELATÓRIO DE BIOQUÍMICA 
EXPERIMENTAL 
 
EXPERIMENTO 5- CINÉTICA ENZIMÁTICA: 
pH-ÓTIMO E DETERMINAÇÃO DO Km: EFEITO DA 
CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO SOBRE A 
VELOCIDADE DA REAÇÃO 
 
 
DOCENTE:​ PROF. DR. ARTHUR H.C. DE OLIVEIRA 
 
GRUPO 2: 
FERNANDA CHIACCHIO GUARESCHI MARTINS 9787637 
RAPHAEL FIGUEIRA 9846855 
 
 
RIBEIRÃO PRETO - SP 
2020 
 
 
1- Objetivos 
 
O experimento teve como objetivo, estudar os efeitos causados pelo emprego 
de diferentes faixas de concentrações de substrato durante uma reação enzimática, 
para a determinação da constante de Michaelis Menten, Km e o efeito de diferentes 
valores de pH do meio reacional, permitindo desta forma encontrar o valor de pH 
ótimo da enzima, isso é, o pH em que esta age com maior efetividade na catálise do 
substrato, através da leitura de absorbância em um espectrofotômetro UV-Vis. Os 
testes foram realizados separadamente, variando as condições de pH e 
concentração de substrato. 
 
2- Resultados e Discussão 
 
2.1 Efeito do pH sobre a velocidade da reação 
 
Questão A: Calcule a quantidade de p-nitrofenolato formado, em 
μmoles/min/mL de enzima (U/mL) e μmoles/min/mg de enzima (U/mg) em cada pH 
estudado. Faça um gráfico da atividade da enzima, expressa em U/mg de enzima, 
em função do pH e determine o seu pH-ótimo. 
 
Para essa análise, preparou-se uma fileira com 10 tubos de ensaio onde se 
manteve constantes as concentrações de tampão (100mmol/L), substrato (2mmol/L) 
e enzima (10ng/tubo). Porém variou-se o tampão para atingir a faixa de pH 
necessária em cada tubo, variando de 2,5 a 7, além de se fazer um branco para 
cada pH, como mostrado na tabela 1. A reação se processou durante 30 minutos, 
sendo interrompida com 1mL de NaOH 1mol/L. E em seguida, foram obtidos 
resultados de absorbância para cada amostra. 
Tabela 1: Protocolo experimental - efeito do pH sobre a velocidade da 
reação 
Nº tubo 
 
pH Volume 
do 
tampão 
(uL) 
pNFF 
(uL) 
H​2​O (uL) Enzima 
(uL) 
A​410 nm 
1 
 
2,5 500 100 300 100 0,060 
2 
 
3,0 500 100 300 100 0,174 
3 
 
3,5 500 100 300 100 0,305 
4 
 
4,0 500 100 300 100 0,477 
5 
 
4,5 500 100 300 100 0,575 
6 
 
5,0 500 100 300 100 0,683 
7 
 
5,5 500 100 300 100 0,491 
8 
 
6,0 500 100 300 100 0,439 
9 
 
6,5 500 100 300 100 0,354 
10 
 
7,0 500 100 300 100 0,219 
 
Utilizando a lei de Lambert Beer, conseguimos determinar a concentração do 
produto formado (pNF-): 
.b.c A = 
/( )c = A * b 
0, 60)/(17600 )c = ( 0 * 1 
c= 3,409E-6 = 3,409𝜇mol/L 
Após encontrar a concentração de produto em 𝜇mol/L, utilizou-se análise 
dimensional para encontrar o número de 𝜇mol por tubo: 
= 0,068182 pNF-3mol/L 000mL)/100000mL( * 2 mol 
Para encontrar o número de 𝜇mol/mim pNF- formado, dividiu-se os valores 
encontrados anteriormente por 30 min (tempo do processamento da reação). 
0, 68182mol/30 , 02273mol/min 0 = 0 0 
Depois calculou-se a atividade da enzima por mL, dividindo o valor 
encontrado anteriormente por 0,1mL a fim de encontrar a quantidade de 
p-nitrofenolato formado, em μmoles/min/mL (U/mL): 
, 02273/0, , 22727 U /mL0 0 1 = 0 0 
Para encontrar a atividade específica (U/mg), dividiu-se o valor em 𝜇mol/mim 
pNF- encontrado pela massa de enzima no tubo (10mg): 
U/mg, 02273/1E 2, 7E0 0 − 5 = 2 + 2 
Os valores encontrados estão na tabela 2. 
Tabela 2: concentrações obtidas para o experimento 
pH Abs 
410nm 
concentração 
(mol/L) pNF- 
concentração 
(umol/L) de pNF- 
pNF- 
(umol) 
pNF- 
(umol/min) 
pNF- 
U/mL 
pNF- 
U/mg 
2,5 0,06 3,41E-06 3,409090909 0,068181818 0,002272727 0,022727 227,2727 
3 0,174 9,88636E-06 9,886363636 0,197727273 0,006590909 0,065909 659,0909 
3,5 0,305 1,73295E-05 17,32954545 0,346590909 0,01155303 0,11553 1155,303 
4 0,477 2,71023E-05 27,10227273 0,542045455 0,018068182 0,180682 1806,818 
4,5 0,575 3,26705E-05 32,67045455 0,653409091 0,021780303 0,217803 2178,03 
5 0,683 3,88068E-05 38,80681818 0,776136364 0,025871212 0,258712 2587,121 
5,5 0,491 2,78977E-05 27,89772727 0,557954545 0,018598485 0,185985 1859,848 
6 0,439 2,49432E-05 24,94318182 0,498863636 0,016628788 0,166288 1662,879 
6,5 0,354 2,01136E-05 20,11363636 0,402272727 0,013409091 0,134091 1340,909 
7 0,219 1,24432E-05 12,44318182 0,248863636 0,008295455 0,082955 829,5455 
 
 
Com isso, traçou-se o seguinte gráfico com a curva de U/mg x pH a 
fim de verificar qual a atividade específica da enzima em cada pH e avaliar 
qual o pH ótimo para essa enzima (maior U/mg). 
Gráfico 1: Atividade específica da enzima (U/mg) para cada pH analisado
 
 
A partir da análise do gráfico, podemos concluir que o pH ótimo para a 
enzima fosfatase ácida é 5, já que foi o pH onde sua atividade enzimática foi a mais 
elevada. Isso significa que essa é a condição do meio mais favorável para que a 
enzima catalise a reação. Isso acontece porque em outras regiões de pH, o meio irá 
facilitar que as interações fracas da enzima se quebrem e se reorganizem, fazendo 
com que ela perca sua estrutura terciária e quaternária, resultando em uma 
diminuição de atividade ou sua inativação. Quando se está no pH ótimo, a enzima 
está nas condições ideais para o seu funcionamento, permitindo que ela catalise a 
reação com muita eficácia. 
 
1. Por que o pH do meio reacional afeta a velocidade das reações enzimáticas? 
O pH do meio reacional afeta a velocidade das reações enzimáticas, porque 
as enzimas são proteínas cujas estruturas terciárias e quaternárias estão 
organizadas de acordo com interações fracas de cadeias laterais dos aminoácidos 
das enzimas, além de interações com o meio. A partir do momento em que se altera 
as condições do meio, como o pH, as interações fracas podem se romper ou formar 
outras interações e isso pode resultar em alterações na atividade da enzima, como 
pequenas variações que permitem que ela continue funcionando de forma mais ou 
menos eficiente como até na sua inativação. E isso consequentemente irá interferir 
na velocidade de reação da enzima. 
2. ​Por que é importante utilizar uma solução tampão nas determinações de 
atividade enzimática? 
Para que o pH se mantenha constante durante toda a reação, permitindo que 
haja menos erros experimentais em relação à sua variação. Além disso, utiliza-se 
tampões de diferentes pH’s para que consigamos analisar a atividade para cada pH 
dado para determinar o pH ótimo da enzima. 
 
2.2 Determinação do Km: efeito da concentração do substrato 
sobre a velocidade da reação 
 
Será preparado a seguir um protocolo, preparando dez tubos em fileiras, 
mantendo a concentração do tampão, do substrato e da enzima constantes. As 
condições experimentais serão: Tampão citrato de sódio 100 mmol/L, pH 5,5, 
contendo pNFF 2 mmol/L e fosfatase ácida 10 ng/tubo. 
 
As soluções estoque a seguir, estão fornecidas. 
 
MR = tampão citrato de sódio 200 mmol/L, pH 5,5, contendo pNFF 4 mmol/L 
Enzima = Fosfatase ácida (40 ng/mL) 
 
Tabela 3: protocolo experimental - efeito da concentração do substrato sobre 
a velocidade da reação 
Nº tubo 
 
Tampã
o (uL) 
Enzima (uL) H​2​O 
(uL) 
pNFF 
(estoque) 
A​410 nm [S] (10​
-3 
mol. L​-1​) 
pNFF 
(uL) 
 
1 
 
500 100 350 1 0,093 0,05 50 
2 
 
500 100 330 1 0,145 0,07 70 
3 
 
500 100 300 1 0,177 0,10 100 
4 
 
500 100 250 1 0,240 0,15 150 
5 
 
500 100 200 2 0,277 0,20 100 
6 
 
500 100 200 2 0,406 0,40 200 
7 
 
500 100 150 2 0,428 0,50 
 
250 
8 
 
500 100 350 20 0,561 1,00 50 
9500 100 300 20 0,648 2,00 100 
10 
 
500 100 150 20 0,691 5,00 250 
 
Com o resultado da absorbância e, seguindo os mesmos passos do 
experimento anterior, calculou-se a concentração de pNF- em mol/L, mol, e a 
velocidade de reação em mol/min. 
 
Tabela 4: resultados obtidos a partir do protocolo experimental 
Tubo Abs 
410nm 
[pNF-] (mol/L) [pNF-] umol/L [pNF-] umol [pNF-] 
umol/min 
[S] 
(10-3 
mol. 
L-1) 
vo (umol/min) 
1 0,093 5,28409E-06 5,284090909 0,105681818 0,003522727 0,05 0,003522727 
2 0,145 8,23864E-06 8,238636364 0,164772727 0,005492424 0,07 0,005492424 
3 0,177 1,00568E-05 10,05681818 0,201136364 0,006704545 0,1 0,006704545 
4 0,24 1,36364E-05 13,63636364 0,272727273 0,009090909 0,15 0,009090909 
5 0,277 1,57386E-05 15,73863636 0,314772727 0,010492424 0,2 0,010492424 
6 0,406 2,30682E-05 23,06818182 0,461363636 0,015378788 0,4 0,015378788 
7 0,428 2,43182E-05 24,31818182 0,486363636 0,016212121 0,5 0,016212121 
8 0,561 0,000031875 31,875 0,6375 0,02125 1 0,02125 
9 0,648 3,68182E-05 36,81818182 0,736363636 0,024545455 2 0,024545455 
10 0,691 3,92614E-05 39,26136364 0,785227273 0,026174242 5 0,026174242 
 
 
1. Com base nos seus resultados determine os valores de V​max e Km, traçando os 
seguintes gráficos: 
 
a) v x [S] 
 
Gráfico 2: velocidade inicial x concentração do substrato 
 
 
 
 
Onde os valores de P1 e P2 são, respectivamente V​max​ e Km, na equação, quando 
comparamos com a equação de Michaelis Menten. 
 
 y = (P1 x)*(P2 + x) 
 
 
 
o V = V m [S]*Km + [S] 
 
 
Dados retirados da tabela 4. 
b) 1/v x 1/[S] (Representação de Lineweaver-Burk) 
 
Primeiramente obteve-se os seguintes valores de 1/[S] e 1/v mostrados na 
tabela 5. 
 
Tabela 5: dados para representação de Lineweaver-Burk 
1/[S] 1/v 
20 283,8709677 
14,28571 182,0689655 
10 149,1525424 
6,666667 110 
5 95,30685921 
2,5 65,02463054 
2 61,68224299 
1 47,05882353 
0,5 40,74074074 
0,2 38,20549928 
 
Com os dados obtidos, plotou-se a reta representada pelo gráfico 3. 
 
Gráfico 3: Representação de Lineweaver-Burk 
 
 
Com sua equação de reta, conseguimos definir os valores de Km/V 
(coeficiente angular) e -1/Km (coeficiente linear). 
 
Igualando y=0, conseguimos obter o valor de -1/Km: 
 
0 11, 14x 34, 07 = 7 5 
, 4579x = − 2 9 
 
Logo, temos que Km=0,339467 
 
Sendo x=Km/Vmax e y=1/Vmax 
 
Com isso, temos Vmax=0,02898 umol/min. 
 
 
c) [S]/v x [S] (Representação de Hanes) 
 
O tratamento gráfico pela representação de Hanes foi desenvolvido plotando 
o gráfico da [S]/v (umol/min) x [S] 10​-3​ mol. L​-1​. 
 
Tabela: 6 dados para a representação de Hanes 
[S] (10-3 mol. L-1) [S]/v 
0,05 14,19355 
0,07 12,74483 
0,1 14,91525 
0,15 16,5 
0,2 19,06137 
0,4 26,00985 
0,5 30,84112 
1 47,05882 
2 81,48148 
5 191,0275 
 A partir dos dados disponíveis na tabela 6 obtemos o gráfico 4. 
 
 
Gráfico 4: gráfico da representação de Hanes [S]/v (umol/min) x [S] 10​-3​ mol. L​-1 
 
 
Conhecendo a equação da reta como y = 35,805x + 11,476, temos o x a 
igualdade para encontrar 1/V​max​, por manipulação matemática encontraremos V​max​, e 
em sequência extrapolamos a reta ao eixo y=0 para encontrarmos KM. 
 
KM = 0,32501 M 
 V​max​ = 0,027929 umol/min 
 
 
d) v x v/[S] (Representação de Hofstee) 
 
E por fim, o último gráfico, chamado de Tratamento de Edie-Hostfee, 
elaborado de forma semelhante ao apresentado acima, plotando um gráfico de v x 
v/[S], temos o gráfico 5. 
 
Tabela 7: Dados para a representação de Edie-Hofstee 
v/[S] v (umol/min) 
0,070455 0,003523 
0,078463 0,005492 
0,067045 0,006705 
0,060606 0,009091 
0,052462 0,010492 
0,038447 0,015379 
0,032424 0,016212 
0,02125 0,02125 
0,012273 0,024545 
0,005235 0,026174 
 
Gráfico 5: representação de Edie-Hofstee 
 
 
O tratamento matemático é o mesmo utilizado aos gráficos anteriores, 
definindo a equação da reta como y = -0,3113 x + 0,0275, isolamos, e encontramos 
V​max​ e KM, temos: 
 
Sendo o coeficiente angular da equação -Km e o coeficiente linear da 
equação sendo V​max. 
 
V​max ​= 0,0275 umol/min 
KM = 0,3113 M 
 
 
Explicação dos dados: 
 
Obteve-se na tabela 8 os seguintes valores de Km e Vmax obtidos pelas 
curvas. 
 
Tabela 8: Valores de Km e Vmax obtidos com as representações gráficas 
Gráfico 
Michaelis 
Menten 
Lineweaver 
Burk 
Hanes 
Woolf 
Edie 
Hofstee 
Km (M) 0,3285 0,3394 0,3250 0,3113 
Vmax 
(umol/m
in 0,0281 0,0290 0,0280 0,0275 
 
Quando comparamos os valores obtidos pelos gráficos, temos valores muito 
próximos tanto de Km quanto de Vmax, onde as pequenas variações são devido a 
confiabilidade do gráfico, sendo os gráficos de Lineweaver Burk e Hanes os mais 
simples para serem utilizados porque os valores de Km e Vmax são dados direto 
pelos coeficientes angular e linear da equação de reta. 
A Equação de Hanes foi investigada por Lineweaver e Burk que concluíram que a 
Equação 2 (Burk) produzia melhores resultados para baixas concentrações de 
substrato. Entretanto, Wilkinson ao fazer uma análise estatística detalhada das 
Equações 2 e 3 (Burk e Hanes) concluiu que esta última era superior (Carvalho, et 
al, 2010). 
 
Também verificou-se se as velocidades são iniciais. 
Velocidade inicial é aquela obtida até o consumo de 5% do substrato. Assim, 
calculamos a porcentagem de produto formada (pNF-), se ela for menor de 5%, a 
velocidade da reação ainda é considerada velocidade inicial, se for maior, não é. 
Dessa forma temos que apenas o tubo 10 está dentro da velocidade inicial. 
 
Tabela 9: Velocidade Inicial 
tubo pNFF (uL) [pNF-] (umol/L) % 
1 50 3,409090909 6,818182 
2 70 9,886363636 14,12338 
3 100 17,32954545 17,32955 
4 150 27,10227273 18,06818 
5 100 32,67045455 32,67045 
6 200 38,80681818 19,40341 
7 250 27,89772727 11,15909 
8 50 24,94318182 49,88636 
9 100 20,11363636 20,11364 
10 250 12,44318182 4,977273 
 
 
 
● Referência Bibliográfica 
 
NELSON, David L.; COX, Michael M. ​Lehninger: princípios de bioquímica​. 2015. 
 
Bioquímica Básica . A. Marzzoco & B.B. Torres, , 4a Ed.2007, Editora Guanabara 
Koogan. 
 
Carvalho, et al, 2010, ​Uso de equações lineares na determinação dos 
parâmetros de Michaelis-Menten​.