Relatório de aula prática sobre a atividade da enzima pirofosfatase (aplicação de curva padrão)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL 
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PORTO ALEGRE 
2020 
 
 
 
 
 
 
1. PRINCÍPIO DO MÉTODO: 
A atividade de uma enzima em relação a sua exposição a meios com pHs 
diferentes pode ser mensurada através de quanto produto foi gerado, no mesmo 
tempo, para cada meio testado. 
No caso da enzima pirofosfatase, por exemplo, podemos definir em qual faixa 
de pH sua ação será máxima sob o substrato pirofosfato se analisarmos sua 
ação em um mesmo período de tempo em meios com valores distintos de pH, 
analisando posteriormente quanto fosfato inorgânico (produto da reação) foi 
produzido em cada meio. 
Para quantificarmos o fosfato inorgânico presente em uma amostra podemos 
utilizar o método Fiske-Subbarow, que consiste na reação de molibdato de 
amônio com fosfato inorgânico (Pi) em meio ácido e na presença de um agente. 
Nessas condições haverá formação de uma cor azulada nas amostras, que varia 
de intensidade de acordo com a concentração de Pi presente em cada uma. 
 Esquema reduzido da reação: PPi + H2O 2 Pi 
Importante salientar que quanto maior é a intensidade do azul, maior é a 
quantidade de fosfato inorgânico encontrado nessa solução, ou seja, esses dois 
elementos são diretamente proporcionais. 
 
2. OBJETIVO: 
O presente relatório objetiva analisar em qual faixa de pH a enzima 
pirofosfatase possui maior atividade, almejando com o resultado a máxima 
velocidade enzimática. 
 
 
3. METODOLOGIA: 
3.1 Elaboração da curva padrão: 
Para realizar a quantificação de fosfato inorgânico totais de uma amostra com 
base em espectrofotometria necessitamos primeiro elaborar uma curva padrão 
com base na análise de amostras no espectrofotômetro cujas concentrações 
sejam conhecidas. 
Para tanto, amostras de soluções com concentrações maiores ou menores 
de ortofosfato passam por análise no espectrofotômetro, equipamento capaz de 
emitir ondas eletromagnéticas em frequências exatas e pré-estabelecidas que 
passam pela amostra, sendo parte barradas e parte transmitidas, gerando assim 
valores de absorbância. 
As amostras precisam ser feitas com o mínimo erro possível, 
preferencialmente através do uso de pipetas eletrônicas para dosagem do 
conteúdo de fosfato inorgânico e água destilada de cada tubo a ser analisado na 
espectrofotometria, e com utilização de triplicatas. 
As triplicatas objetivam mitigar possíveis inconsistências na pipetagem. Dos 
três valores gerados descarta-se aquele mais discrepante (se houver) e 
posteriormente faz-se a média, gerando um valor só de absorbância para cada 
concentração. 
Quanto as concentrações, elas devem ser estabelecidas preferencialmente 
em intervalos iguais, como vemos na tabela 1, utilizada como base no processo 
de diluição do conteúdo de fosfato inorgânico entre as amostras a serem 
utilizadas na elaboração da curva padrão. 
Linhas Concentração de Pi 
(μL) 
Concentração de Água 
(μL) 
A 0 250 
B 50 200 
C 100 150 
D 150 100 
E 200 50 
Tabela 1: Concentração de fosfato inorgânico e concentração de água utilizada em cada 
amostra. 
Percebemos o aumento gradativo da concentração de fosfato inorgânico em 
cada amostra, assim como o fato de que a primeira amostra (A) não possui 
nenhum conteúdo de fosfato. Essa amostra recebe o nome de branco da reação, 
tendo como principal função indicar ao aparelho o que não deve ser levado em 
conta no cálculo da absorbância. 
Posteriormente, de posse dos valores de absorbância calculamos o fator de 
calibração individual de cada amostra (exceto a do soro) com base na fórmula 
Fc = Q / A, em que Fc representa o Fator de Calibração, Q representa a 
Quantidade de fosfato inorgânico e A a Absorbância. 
Fórmula 1: F = Q/A 
Os valores de absorbância das amostras individuais são então unidos e 
através de média simples obtemos o Fator de Calibração médio (FCm). Esse 
fator pode ser usado na fórmula um para que cheguemos ao valor da quantidade 
de ortofosfato das soluções com diferentes pH (lembrando que dessas soluções 
só possuímos o valor de absorbância). 
Para finalizar a curva padrão, plotamos um gráfico da curva no software 
Excel, gerando também o coeficiente de ajuste. 
3.2 Elaboração das amostras enzimáticas para diferentes faixas de pH 
Depois de realizada a curva padrão utilizaremos seis tubos com volumes 
iguais de tampão (específico para cada faixa de pH), de MgCl2 (responsável por 
gerar o cofator Mg2+ essencial para a enzima), de água destilada e de pirofosfato. 
A ordem de inserção dos componentes deve ser seguida rigidamente. 
Por último adiciona-se a enzima pirofosfatase (que catalisa a quebra do 
pirofosfato em duas moléculas de fosfato inorgânico), porém essa com 
concentração zerada na amostra A (branco). Na tabela dois observamos as 
concentrações dos elementos citados em seus respectivos tubos. 
Tubos pH Tampão 
(μL) 
MgCl2 
(μL) 
Água 
(μL) 
PPi 
(μL) 
Pirofosfatase 
(μL) 
A -- 150 20 40 20 0 
B 6,2 150 20 40 20 20 
C 6,7 150 20 40 20 20 
D 7,2 150 20 40 20 20 
E 7,9 150 20 40 20 20 
F 8,4 150 20 40 20 20 
Tabela 2: Concentrações de interesse de cada amostra e seus respectivos pH. 
Importante destacar que a adição da enzima deve ser feita da maneira mais 
rápida possível. Uma vez que no final do processo calcularemos a velocidade 
enzimática em relação a um mesmo tempo, torna-se salutar que haja a mínima 
diferença entre a finalização de cada amostra para que em nenhuma delas a 
enzima aja por mais tempo sobre o substrato. 
Depois da adição de todos reagentes necessários é preciso colocar todas as 
amostras em incubadoras por vinte minutos à uma temperatura de trinta e sete 
graus celsius. 
Após, esse procedimento de incubação, realizamos em todas as amostras a 
pipetagem de 1000 μL de molibdato de amônio (preparado com ácido). Esse 
processo faz com que a pirofosfatase desnature, parando assim a atividade 
catalítica. A adição desse composto deve ser realizada o mais rápido possível, 
para fazer com que o tempo de ação da enzima seja próximo entre amostras. 
Para obtermos um resultado mais exato, coloca-se 20 μL de enzima no tubo 
Branco, que será desnaturada instantaneamente devido a concentração de 
molibdato de amônio anteriormente adiciona à essa amostra. O aparelho de 
análise posteriormente utilizará a amostra A como referência para descontar a 
cor inespecífica nas demais amostras. 
O próximo passo é acrescentar em todos os tubos 80 μL de agente redutor 
que fornecerá elétrons e promoverá uma mudança de cor nas amostras, 
seguindo o método Fiske-Subbarow. É necessário incubar essas amostras por 
sete minutos em temperatura ambiente. 
Depois da incubadora, é feita a pipetagem, em triplicata, de 200 μL da 
solução na mesma microplaca utilizada para a realização da curva padrão. Só 
que essas amostras vão ficar nas colunas de 4 até 6, e nas linhas de A até F. 
O aparelho fará então a leitura em 640 nm, nos gerando um valor de 
absorbância para cada amostra da triplicata. Análogo ao procedimento de 
formação da curva padrão, urge a necessidade de descontarmos amostras 
discrepantes e posteriormente elaborarmos uma média simples, da qual sairá 
um resultado para cada triplicata. 
Nesse ponto, de posse do resultado de absorbância de cada triplicata, 
precisamos interpretar esse valor para chegarmos ao objetivo do processo: 
quantificar o Pi presente em cada amostra. Isso pode ser feito através de uma 
inversão da fórmula 1. 
Se antes tínhamos a concentração e o valor de absorbância para então 
calcularmos o fator de calibração, agora utilizaremos o fator de calibração obtido 
na curva padrão (3.1) e multiplicaremos pelo valor de absorbância para então 
chegarmos a quantidade de Pi em cada amostra. 
 
4. RESULTADOS: 
 
Na tabela 3 podemos ver os valores utilizados paraa construção da curva 
padrão: 
 
Padrões Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs 
(média) 
Quantidade de 
Pi (µmol) 
Fc 
(parcial) 
FcM 
(médio) 
B 0,002 -0,001 -0,001 0 0 - - 
1 0,069 0,082 0,076 
0,0757 0,05 
0,6608 
 
 
 
0,7650 
2 0,116 0,121 0,111 0,1160 
0,10 
0,8621 
3 0,193 0,217 0,198 0,2027 
0,15 
0,7401 
4 0,250 0,252 0,062 0,2510 
0,20 
0,7968 
Tabela 3: Valores para construção da curva padrão 
Cálculo dos valores para tabela 3: 
Abs média: 
1 – (0,069+ 0,082 + 0,076) / 3 = 0,0756 
2 – (0,116 + 0,121 + 0,111 0) /3 = 0,01156 
3 – (0,193 + 0,217 + 0,198 0) / 3 = 0,2026 
4 – (0,250 + 0,252) / 2 = 0,251 (o valor 0,062 foi descartado por ser 
muito discrepante quanto comparado com os demais da triplicata. 
Quantidade de Pi 
Tubo Branco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 
Q = 0 
(sem Pi) 
1 μmol – 1000 μL 
Q – 50 μL 
Q = 0,05 
1 μmol – 1000 μL 
Q – 100 μL 
Q = 0,1 
1 μmol – 1000 μL 
Q – 150 μL 
Q = 0,15 
1 μmol – 1000 μL 
Q – 200 μL 
Q = 0,2 
 
Fator de calibração (Fc) = Q/A 
 
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 
(0,05/0,0757) 
 
 
Fc1= 0,6608 
(0,1/0,1160) 
 
 
Fc2= 0,8621 
(0,15/0,2027) 
 
 
Fc3= 0,7401 
(0,2/0,2510) 
 
 
Fc4=0,7968 
 
 
 
 
Gráfico da curva padrão: 
 
Gráfico 1: Curva padrão. 
 
Na tabela 4 observamos a concentração de Pi em cada amostra em 
relação a faixas distintas de pH, assim como a velocidade em (nmol/min). O 
dado de velocidade indica quantos nmols foram produzidos na reação enzima 
e substrato para cada minuto de ação. 
 
 
 
 
y = 1,2566x + 0,0033
R² = 0,9903
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
A
b
so
rb
Â
n
ci
a
Quantidade de pirofosfato (em µmol) 
Pi X A
FcM = (0,6608+0,8621+0,7401+0,7968) / 4 = 0,7650 
 
Quantidade de Pi 
(produzido em 20 min) 
 
 
Velocidade 
(nmol/min) 
 
Abs 1 
 
Abs 2 
 
Abs 3 
Abs 
(média) 
 
(µmol) 
 
(nmol) 
B 0,001 -0,002 0,001 0,0000 0 0 0 
pH 6,2 0,187 0,185 0,171 0,1810 0,1385 138,4562 6,9228 
pH 6,7 0,214 0,220 0,233 0,2223 0,1701 170,0742 8,5037 
pH 7,2 0,279 0,282 0,273 0,2780 0,2127 212,6565 10,6328 
pH 7,9 0,247 0,234 0,244 0,2417 0,1849 184,8633 9,2432 
pH 8,4 0,168 0,196 0,177 0,1803 0,1379 137,9463 6,8973 
Tabela 4: valores de pH comparados, absorbância média, concentração de fosfato 
inorgânico (em µmol e nmol) e velocidade (nmol/min) 
Abs média: 
pH 6,2 = (0,187 + 0,185 + 0,171) = 0,180 
pH 6,7 = ( 0,214 + 0,220 + 0,233) = 0,2223 
pH 7,2 = (0,279 + 0,282 + 0,273) = 0,2780 
pH 7,9 = (0,247 + 0,234 + 0,244) = 0,2417 
pH 8,4 = 0,168 + 0,196 + 0,177) = 0,1803 
 
*Os valores de quantidade de Pi foram obtidos multiplicando a absorbância 
média indicada em cada triplicata pelo valor do fator de calibração médio. 
Pi = AxFc 
pH 6,2 Pi = 0,1810x0,7650 Pi = 0,1385 µmol Converter de µmol para 
pH 6,7 Pi = 0,2223x0,7650 Pi = 0,1701 µmol nmol 
pH 7,2 Pi = 0,2780x0,7650 Pi = 0,2127 µmol x1000 
pH 7,9 Pi = 0,2714x0,7650 Pi = 0,1849 µmol 
pH 8,4 Pi = 0,1803x0,7650 Pi = 0,1379 µmol 
*A conversão de µmol em nmol foi feita multiplicando os valores encontrados em 
µmol por mil. 
 
 
No gráfico 2 vemos o comportamento da enzima em relação aos valores distintos 
de pH: 
 
Gráfico 2: velocidade em relação ao pH. 
5. CONCLUSÕES: 
Concluímos que a faixa de pH 7,2 favorece mais o funcionamento da enzima, 
como podemos avaliar pela barra maior no gráfico 2. Nesse ponto a velocidade 
enzimática estará otimizada. Enzimas funcionam de formas diferentes em pHs 
diferentes, funcionando de forma menos acelerada ou até se desnaturando em 
pHs muito longínquos do ideal. 
A metodologia utilizada mostrou-se eficiente ao quantificar de forma pouco 
onerosa o quanto de fosfato inorgânico foi gerado em cada faixa de pH. Além 
disso, uma vez gerada a curva padrão não haveria necessidade de gerar outra, 
tornando o processo ainda mais simples no caso de novas amostragens. 
 
0
2
4
6
8
10
12
0 6,2 6,7 7,2 7,9 8,4
P
H
Velocidade (nmol/min)
Velocidade x Ph