Epigenética bases moleculares, efeitos na fisiologia e na pato

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Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Embrapa Pecuária Sudeste
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
EPIGENÉTICA
Bases moleculares, efeitos na fisiologia e na patologia, e implicações para a
produção animal e a vegetal
2ª edição
Simone Cristina Méo Niciura
Naiara Zoccal Saraiva
Editoras Técnicas
Embrapa
Brasília, DF
2015
Embrapa Pecuária Sudeste
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Alencar
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Embrapa Informação Tecnológica
Coordenação editorial: Selma Lúcia Lira Beltrão, Lucilene Maria de Andrade, Nilda Maria da Cunha Sette
Supervisão editorial: Wyviane Carlos Lima Vidal
Revisão de texto: Francisco C. Martins
Revisão do e-book: Jane Baptistone de Araújo
Normalização bibliográfica: Márcia Maria Pereira de Souza
Editoração eletrônica: Alexandre Abrantes Cotta de Mello, Leandro de Sousa Fazio, Rodrigo Carvalho Alva
Capa: Júlio César da Silva Delfino
Foto da capa: Roberta Cordeiro Gaspar
1ª edição
1ª impressão (2014): 1.000 exemplares
2ª edição
E-book (2015)
Todos os direitos reservados
Para uso exclusivo de GUSTAVO RAFAEL MAZZARON BARCELOS. A reprodução não autorizada desta publicação, no
todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Embrapa Informação Tecnológica
Epigenética : bases moleculares, efeitos na fisiologia e na patologia, e implicações para a produção animal e a vegetal /
Simone Cristina Méo Niciura, Naiara Zoccal Saraiva, editoras técnicas. – 2. ed. – Brasília, DF : Embrapa, 2015.
E-book : il. color.
E-book, no formato ePub, convertido do livro impresso.
ISBN 978-85-7035-437-2
1. Biotecnologia. 2. Genética molecular. 3. Gameta. 4 Embrião. I. Niciura, Simone Cristina Méo. II. Saraiva, Naiara
Zoccal. III. Embrapa Pecuária Sudeste.
CDD 575.1
© Embrapa 2015
Autores
Alexandre de Lima Oliveira
Biólogo, mestre em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, doutorando da Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos, SP
Bianca Baccili Zanotto Vigna
Bióloga, doutora em Genética e em Biologia Molecular, pesquisadora da Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, SP
Daniel Robert Arnold
Zootecnista, doutor em Reprodução Animal, pesquisador da In vitro Brasil S/A, Mogi Mirim, SP.
Felipe Perecin
Médico-veterinário, doutor em Medicina Veterinária, professor da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP
Flavia Lombardi Lopes
Médica-veterinária, doutora em Reprodução Animal, pesquisadora da Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba da
Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, SP
Marina Ibelli Pereira Rocha
Bióloga, mestre em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, doutoranda da Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos, SP
Mateus Mondin
Engenheiro-agrônomo, doutor em Genética e Melhoramento de Plantas, professor da Escola Superior de Agricultura Luiz
de Queiroz da Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP
Naiara Zoccal Saraiva
Médica-veterinária, doutora em Medicina Veterinária, pesquisadora da Embrapa Amazônia Oriental, Belém, PA
Natália Sousa Teixeira-Silva
Bióloga, mestre em Genética e Melhoramento de Plantas, doutoranda da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da
Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP
Roberta Cordeiro Gaspar
Médica-veterinária, mestre em Medicina Veterinária, Jaboticabal, SP
Simone Cristina Méo Niciura
Médica-veterinária, doutora em Medicina Veterinária, pesquisadora da Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, SP
Suelen Scarpa de Mello
Bióloga, mestre em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, doutoranda da Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos, SP
Vanessa Candiotti Buzatto
Graduanda em Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP
Os autores agradecem às pessoas e às instituições que contribuíram na elaboração
deste livro, tornando viável a difusão de conhecimentos que a partir de agora estarão ao
alcance de todos.
Apresentação
O conceito de epigenética ainda é recente e seus efeitos sobre o desenvolvimento
vêm sendo amplamente estudados nos últimos anos, principalmente na área da saúde
humana. Assim, por sua forte atuação voltada à pesquisa agropecuária, a Embrapa
vislumbrou a oportunidade de conduzir estudos em epigenética referentes à produção, à
reprodução e à sanidade animal e vegetal, para aumentar a quantidade e a qualidade dos
produtos e alimentos gerados, além de melhorar a eficiência de produção.
Por sua característica de sofrer modificação causada pelo ambi​ente, o estudo da
epigenética permite aumentar a compreensão da interação entre o genótipo e o ambiente,
e seus efeitos sobre o fenótipo dos indivíduos. Consequentemente, a avaliação epigenética
de genes relacionados a características quantitativas – que sofrem bastante influência do
ambiente e que apresentam grande interesse comercial – visa ao complemento dos
estudos tradicionalmente desenvolvidos em genética quantitativa e molecular.
Os autores desta obra são jovens cientistas de diferentes instituições de ensino e
pesquisa – Embrapa, Universidade de São Paulo (USP), Universidade Estadual de São
Paulo (Unesp), e Universidade Federal de São Carlos (UFScar) – que desejam
compartilhar os conhecimentos adquiridos em seus estudos na área de epigenética. Este
livro tem como público-alvo não só estudantes, pesquisadores e professores das áreas de
ciências biológicas, agrárias e afins, mas também interessados no assunto que queiram
obter informações técnico-científicas sobre um tema que, com certa frequência, é
veiculado na mídia impressa e eletrônica.
Rui Machado
Chefe-Geral da Embrapa Pecuária Sudeste
Prefácio
Atualmente, a epigenética constitui um dos temas de maior inte​resse no estudo de
processos biológicos em humanos, em animais e em plantas, pois fornece o elo entre o
genótipo e o meio ambiente, tornando evidente que a manifestação do fenótipo nos
indivíduos depende da interação entre esses três fatores. Assim, a epigenética permite
elucidar eventos anteriormente atribuídos ao acaso ou que não podiam ser explicados
apenas pela genética, além de reacender o debate sobre as teorias evolutivas e as ideias
de Lamarck, uma vez que demonstra que caracteres adquiridos pelos pais podem ser
transmitidos a seus descendentes.
Apesar de não ser um conceito novo, a epigenética só passou a ser sistematicamente
estudada nas últimas 2 décadas. No início, pesquisas feitas, principalmente com seres
humanos e com camundongos, foram restritas a genes imprinted e a genes candidatos
específicos e, posteriormente, aos RNAs não codificadores. Só nos últimos anos – com o
advento das tecnologias de biologia molecular em larga escala – é que houve expansão
das pesquisas nesse novo campo da genética para outras espécies animais e vegetais,
bem como em escala genômica.
Grande parte dos estudos nesse tema ainda se encontra relacionada a seu papel na
etiologia de doenças, principalmente de câncer em humanos e, apesar de sua evidente
importância, ações isoladas têm sido promovidas em animais ou em plantas destinadas à
produção. Entretanto, poucas das informações obtidas têm sido incorporadas aos modelos
aplicados no melhoramento genético.
Por suaimportância e pela escassez de literatura em língua portuguesa, este livro é
de suma importância para quem deseja se inteirar do tema em questão. Numa linguagem
conceitual, clara e concisa, ele aborda conceitos adquiridos e gerados em estudos sobre
epigenética, desenvolvidos por pesquisadores da Embrapa em parceria com outros
pesquisadores e professores de diversas instituições de ensino e pesquisa, sem omitir
nenhum detalhe relacionado a esse novo segmento da genética.
Os capítulos iniciais, além de breve histórico, abordam a importância e os conceitos
relacionados ao tema. Além disso, descrevem os tipos de modificações epigenéticas
existentes no genoma, bem como as ferramentas de biologia molecular que podem ser
usadas para detectar sua variação. Também versam sobre o papel da epigenética durante
o desenvolvimento normal e patológico de mamíferos e plantas. Os últimos capítulos
tratam das implicações da epigenética para a biotecnologia e para a produção animal e
vegetal.
Os autores entendem que, de forma alguma, o conteúdo desta obra encerra por
completo a abrangência desse tema e estão ávidos por receberem contribuições para
revisões e complementações futuras do texto ora apresentado.
As editoras
Capítulo 1
Epigenética
Histórico e conceitos
Simone Cristina Méo Niciura
Vanessa Candiotti Buzatto
Introdução
Na última década, grande quantidade de notícias e publicações técnico-científicas tem
sido veiculada pela imprensa sobre o tema epigenética. No Brasil, nos últimos anos,
destaca-se a proibição da fabricação de mamadeiras de plástico policarbonato, em
decorrência do aumento de riscos de puberdade precoce, câncer, alterações no sistema
reprodutivo, infertilidade, aborto e obesidade associados à ingestão de bisfenol-A (BPA),
presente no policarbonato e no revestimento interno de latas de bebidas e de alimentos
(FOLHA DE SÃO PAULO, 2011; JORNAL NACIONAL, 2011).
Outras notícias destacaram os efeitos controversos da escassez de alimentos, como
o ocorrido na Suécia, no século 19, o “inverno, da fome” na Holanda, no período 1944–
1945, e a falta de alimentos na China, no final da década de 1950, sobre a longevidade, o
peso na idade adulta, o aparecimento de patologias e o desenvolvimento de esquizofrenia
nas gerações futuras (GNT.DOC, 2010; SUPERINTERESSANTE, 2011; UOL, 2011).
Algumas reportagens também evidenciaram os efeitos do Atentado de 11 de Setembro de
2001, nos Estados Unidos, sobre o desenvolvimento de estresse (níveis de cortisol) nos
descendentes; e os efeitos da nutrição e do estilo de vida, incluindo o tabagismo e a
ingestão de álcool, sobre a saúde, a obesidade, o risco de desenvolvimento de câncer e a
longevidade das pessoas e de seus descendentes (CIÊNCIA DIÁRIA, 2010; GALILEU,
2009; GNT.DOC, 2010). Por causa da epigenética, hoje em dia pode-se dizer que somos
não só o que comemos (HUNTER, 2008), mas também o que nossos pais (BAKER IDI
HEART AND DIABETES INSTITUTE, 2009) e até o que nossos avós comeram
(RESEARCH PRESS, 2012).
Definição e história da epigenética
O termo epigenética, que literalmente significa “genética acima”, foi usado pela
primeira vez por Conrad Waddington, na década de 1940, para descrever as interações de
genes com o meio ambiente e os possíveis caminhos que cada célula pode tomar durante
o desenvolvimento (TOST, 2008). Atualmente, a epigenética é definida como o estudo de
processos que produzem um fenótipo herdável, mas que não dependem estritamente da
sequência de DNA (LIEB et al., 2006), ou seja, eventos epigenéticos são aqueles que
alteram o fenótipo sem modificar o genótipo (KENDREW, 1994) e que são herdáveis.
Como se vê, não é só a sequência de DNA que determina o fenótipo, mas também as
variações epigenéticas, e ambas as modificações, genéticas e epigenéticas, atuam em
sinergia para a manifestação do fenótipo (MURRELL et al., 2005).
A genética tradicional baseia-se no pareamento de bases adenina (A), timina (T),
guanina (G) e citosina (C) na dupla-hélice do DNA e nas variações em sua sequência.
Exemplos de modificações genéticas que levam a alterações fenotípicas incluem os
polimorfismos de base única (single nucleotide polymorphisms ou SNPs), as variações no
número de cópias (copy number variation ou CNVs), os sítios de ligação de fatores de
transcrição, os promotores alternativos e o splicing alternativo. Por sua vez, a epigenética
refere-se às modificações reversíveis dos nucleotídeos por diferentes formas químicas,
sem alteração de sua sequência. Tais modificações são chamadas de epigenéticas, pois
epi significa “fora de” ou “acima de, além de” (CALLADINE et al., 2004). Assim, a
epigenética estuda as camadas adicionais de informação no topo da sequência genômica,
o que estende de forma dramática o potencial de informação do código genético (TOST,
2008).
Enquanto o genoma é estável (só alterado por mutagênese ou por erros na
replicação), herdável e único a cada indivíduo, apesar de também ser estável e herdável, a
epigenética é modificável de maneira reversível e única a cada tipo celular (OHGANE et
al., 2008). Por isso, as diferenças nos padrões de expressão gênica que resultam no
desenvolvimento de órgãos e tecidos geralmente ocorrem pelo estabelecimento de marcas
epigenéticas (REIK, 2007). Assim, como cada célula de um mesmo organismo contém a
mesma informação genética em seu DNA, é a regulação diferencial dos genes, por meio
da epigenética, no tempo (durante o desenvolvimento) e no espaço (tecido) que determina
o destino celular (morfologia e função) e o fenótipo do indivíduo (BLOMEN; BOONSTRA,
2011).
As marcas epigenéticas são introduzidas nos cromossomos de maneira reversível e
replicadas, estavelmente, durante as divisões celulares (KENDREW, 1994). A regulação
gênica epigenética consiste na propagação estável do estado de atividade gênica durante
as divisões celulares de mitose (herança epigenética entre células) e, algumas vezes, de
meiose (herança epigenética entre gerações ou transgeracional) (BIRD, 2007; STAM,
2009). As modificações epigenéticas ocorrem, naturalmente, nos organismos e participam
de vários processos fisiológicos, como (YOUNG; FAIRBURN, 2000):
• Expressão de genes específicos de tecidos.
• Inativação de um dos cromossomos X nas fêmeas (compensação de dosagem).
• Inativação do centrômero.
• Regulação do imprinting genômico.
Entretanto, modificações nos padrões epigenéticos normais podem levar ao
aparecimento de patologias. Assim, a epigenética está envolvida tanto em processos
fisiológicos, como o desenvolvimento, o crescimento e o envelhecimento, como em
patológicos, na etiologia de algumas doenças em humanos e em animais (BONETTA,
2008).
Como exemplo de regulação epigenética, observa-se que todas as fêmeas de abelha
desenvolvem-se a partir de larvas geneticamente idênticas, mas a dieta com geleia real
transforma uma abelha operária numa rainha fértil (YOUNG, 2008). As diferenças
fenotípicas entre gêmeos idênticos também podem ser atribuídas aos efeitos epigenéticos
(KAMINSKY et al., 2009). Assim, os estudos de comparação das variações fenotípicas
existentes entre gêmeos idênticos (monozigóticos) e entre gêmeos fraternos (dizigóticos)
foram os pioneiros para determinar a influência ambiental e genética, respectivamente, na
etiologia de algumas doenças em humanos (BOUCHARD; MCGUE, 2003; GENETIC
SCIENCE LEARNING CENTER, 2012; WONG et al., 2005).
O mais intrigante é que as modificações epigenéticas podem ser influenciadas por
fatores ambientais, principalmente por dieta, comportamento, estresse e toxinas, e por
fatores estocásticos (FAULK; DOLINOY, 2011). Em camundongos, já foi demonstrado que
o consumo de alimentos ricos em ginesteína e em ácido fólico, durante a gestação, afetam
as marcas epigenéticas e o desenvolvimento até a fase adulta dos descendentes (YOUNG,
2008). Em humanos, a ocorrência de diabetes mellitus do tipo 2 e a quantidade de massa
gorda corporal de umindivíduo adulto podem ser influenciadas pelas condições nutricionais
durante a vida intrauterina (TREMBLAY; HAMET, 2008). Assim, surge uma oportunidade
para se desenvolver novos medicamentos ou orientações nutricionais que possam
modificar as marcas epigenéticas de maneira favorável (YOUNG, 2008).
Além disso, a complexidade da herança epigenética, principalmente a transgeracional,
colocou em destaque a teoria evolutiva, antes desacreditada, de Lamarck, de que as
influências ambientais podem ser transmitidas dos pais para os descendentes (HANDEL;
RAMAGOPALAN, 2010). A epigenética também já foi relacionada:
• Ao comportamento (WEAVER et al., 2004).
• Ao cuidado materno (CHAMPAGNE et al., 2006).
• A modificações em cérebro de pessoas suicidas (POULTER et al., 2008).
• Ao efeito de glicocorticoides (WEAVER, 2009).
• A doenças periodontais (GOMEZ et al., 2009).
• À hibernação em mamíferos (MORIN; STOREY, 2009).
• À obesidade (CAMPIÓN et al., 2009).
• À homossexualidade (RICE et al., 2012; VEJA, 2012), entre outros.
E mais, doenças familiares sem causas genéticas definidas – esquizofrenia, desordem
bipolar, diabetes e câncer – têm sido estudadas e melhor compreendidas sob a ótica da
epigenética (BELL; SPECTOR, 2012).
Neste livro, os tipos de modificações epigenéticas são abordados nos Capítulos 2, 3 e
4; já o Capítulo 5 discorre sobre as técnicas moleculares aplicadas em sua avaliação; o
Capítulo 6 trata do envolvimento da epigenética nos aspectos fisiológicos relacionados ao
genomic imprinting; o Capítulo 7 discorre sobre a influência da epigenética no
desenvolvimento e no envelhecimento; o Capítulo 8 trata dos eventos patológicos em
mamíferos; o Capítulo 9 relata as implicações da epigenética na biotecnologia e na
produção animal; e o Capítulo 10 aborda as especificidades da epigenética em plantas.
Considerações finais
Além do código genético, fatores epigenéticos interferem na expressão gênica e no
fenótipo dos indivíduos. Assim, a epigenética associada à genética tem aumentado a
compreensão de muitos processos fisiológicos e patológicos que ocorrem nos seres vivos.
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Capítulo 2
Modificações epigenéticas I
Conformação da cromatina e modificação do DNA
Simone Cristina Méo Niciura
Introdução
As modificações epigenéticas têm sido classificadas em quatro grandes classes
(FINGERMAN et al., 2013):
• Conformação ou acessibilidade da cromatina e posicionamento dos
nucleossomos.
• Modificações do DNA (metilação e outras modificações de citosina).
• Modificações pós-traducionais das histonas, apresentadas no Capítulo 3.
• Regulação gênica associada aos RNA não codificadores ncRNAs, apresentada
no Capítulo 4.
Os três primeiros tipos de modificações estão associados a alterações na estrutura
da cromatina. Assim, para melhor compreensão dessas modificações epigenéticas, vale
lembrar que, de acordo com a conformação e a função, a cromatina pode ser denominada
de eucromatina ou heterocromatina. A eucromatina – porção do genoma de replicação
precoce no ciclo celular – caracteriza-se por estrutura conformacional mais permissiva e é
abundante em genes transcritos. A heterocromatina – porção de replicação tardia – é
altamente condensada e contém poucos genes expressos. A heterocromatina pode ser
facultativa, ou seja, pode sofrer modificação de acordo com o tipo celular e durante o
tempo; ou constitutiva, que possui papel estrutural, como para a formação dos
centrômeros e dos telômeros.
Outra informação importante é que os cromossomos eucarióticos são empacotados
em estruturas condensadas da cromatina, cuja unidade primária, o nucleossomo, é
composta de 145 a 147 pares de base de DNA (~147 bp) enovelados num octâmero de
histonas (MIELE et al., 2008), contendo duas cópias de cada uma das proteínas histonas:
H2A, H2B, H3 e H4 (IACOBUZIO-DONAHUE, 2009) (Figura 1). Cada nucleossomo é
separado por cerca de 50 bp, que por sua vez são empacotadas pela histona de ligação
H1 (IACOBUZIO-DONAHUE, 2009).
Figura 1. Estrutura dos nucleossomos (em roxo) com a fita de DNA (alaranjada) enovelada
no octâmero de histonas (duas cópias das histonas H2A, H2B, H3 e H4); e histona H1
(verde) que se liga à fita de DNA entre dois nucleossomos.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
As histonas nucleossomais, canônicas ou centrais (H2A, H2B, H3 e H4), podem ser
quimicamente modificadas (ver Capítulo 3) ou substituídas por variantes de histonas
(ERNST et al., 2011; MARTINS et al., 2012), codificadas por genes diferentes da
contrapartida canônica. As principais variantes de histonas são:
• H2A.X – Difere da histona H2A na cauda-C, na qual uma serina na posição 139
pode ser fosforilada, transformando-se em γ-H2A.X; variante que se localiza
em quebra de dupla fita e marca o DNA para o reparo.
• H2A.Z – Presente em promotores e em sítios de início de transcrição; associada
a regiões livres de nucleossomos.
• MacroH2A – Presente no cromossomo X inativo em mamíferos.
• CEMP-A ou CenH3 – Inserida em sequências centroméricas; componente do
cinetócoro.
• H3.3 – Participação no estabelecimento de heterocromatina em regiões
pericentroméricas.
• H3t – Participação na substituição de histona por protamina na cromatina
espermática.
Essas variantes de histonas alteram o empacotamento do DNA e promovem mudança
da topologia da fibra de cromatina, estabilizando-a (por exemplo, H3.3) ou tornando-a
menos estável (por exemplo, H3t).
Conformação ou acessibilidade da cromatina e
posicionamento dos nucleossomos
Tanto a estrutura em alta ordem da cromatina quanto a organização dos nucleossomos
influenciam o acesso dos fatores de transcrição às sequências alvo no DNA (BALLARÉ
et al., 2013). As modificações de conformação da cromatina restringem, por compactação,
ou facilitam, por descompactação ou abertura, o acesso do DNA aos fatores de
transcrição e à maquinaria de transcrição. Em consequência disso, silenciam ou ativam a
expressão gênica.
Há várias camadas de organização da cromatina no núcleo de uma célula mamífera a
partir de sua composição mais básica (a sequência do DNA e o enovelamento nos
nucleossomos). A estrutura primária da cromatina consiste (SAJAN; HAWKINS, 2012;
ZHOU et al., 2011):
• No estado de metilação do DNA.
• Nas modificações das histonas.
• Na organização de vários nucleossomos em fila, de maneira a formar uma fibra
de 11 nm de diâmetro.
Em seguida, a inclusão das histonas H1 leva à formação de uma fibra em zigue-zague
mais condensada, com 30 nm de diâmetro (estrutura secundária) (SAJAN; HAWKINS,
2012). A estrutura de alta ordem da cromatina é formada pelas dobras (loops) de
cromatina mediadas pelas interações de proteínas não histônicas em regiões genômicas
distais (estrutura terciária), as quais permitem a aproximação física entre elementos distais
e proximais, e pelo posicionamento tridimensional dos domínios de cromatina em relação à
lâmina nuclear no interior do núcleo (estrutura quaternária) (SAJAN; HAWKINS, 2012).
As regiões transcricionalmente ativas (eucromatina) localizam-se mais distantes da
lâmina nuclear em relação às regiões silenciosas (heterocromatina), e as modificações
epigenéticas também impactam na estrutura em alta ordem da cromatina, por alterarem as
propriedades químicas das histonas e de certas bases do DNA (SAJAN; HAWKINS, 2012).
A determinação do posicionamento dos nucleossomos depende da combinação entre
sequência do DNA, enzimas remodeladoras do nucleossomo dependentes de ATP e
fatores de transcrição (maquinaria de RNA polimerase III) (STRUHL; SEGAL, 2013).
Algumas sequências do DNA (como AA/TT/AT/GC a intervalos de 10 bp), que são mais
“dobráveis”, permitem que a fita adquira a curvatura necessária para acomodar os
nucleossomos cuja estabilidade também é aumentada pelo estado de metilação do DNA
(SAJAN; HAWKINS, 2012; ZENTER; HENIKOFF, 2013). Além disso, a posição do DNA no
nucleossomo afeta a metilação daquele, pois as metiltransferases de DNA (DNMTs) têm
preferência pelo DNA ligado ao nucleossomo que, em consequência, é mais metilado que o
DNA adjacente.
O posicionamento do nucleossomo pode ocorrer a intervalo perfeito (~147 bp), parcial
(preferência por algumas localizações) ou sem padrão (pode ocupar qualquer posição
genômica) (STRUHL; SEGAL, 2013). A localização precisa do nucleossomo +1 (primeiro
nucleossomo após o sítio de início de transcrição – TSS) é um fator determinante do
padrão de posicionamentodos nucleossomos, pois há relação entre o posicionamento do
nucleossomo +1, o TSS e o complexo de pré-iniciação da transcrição (STRUHL; SEGAL,
2013).
Dependendo dos níveis de expressão gênica, o posicionamento dos nucleossomos
difere (VAVOURI; LEHNER, 2012). Em humanos, somente os promotores amplos – que
iniciam a transcrição a partir de uma região maior que 4 bp e são regulados por ilhas CpG
– possuem associação significativa com o posicionamento e a modificação dos
nucleossomos (NOZAKI et al., 2011; VAVOURI; LEHNER, 2012). Já o alinhamento dos
nucleossomos – bem mais ordenado nos promotores amplos – pode ser necessário para
criar uma região livre de nucleossomo que antecede ao TSS, de modo a conferir
acessibilidade do DNA aos fatores de transcrição (NOZAKI et al., 2011).
As regiões livres de nucleossomos são sensíveis à digestão por DNaseI e chamadas
de sítios hipersensíveis à DNaseI (BALLARÉ et al., 2013). Geralmente, os nucleossomos
são enriquecidos nos éxons e preferencialmente localizados nas regiões íntron-éxon ou
éxon-íntron (ZHANG et al., 2010) e depletados em muitos enhancers, promotores e
regiões de terminação da transcrição (STRUHL; SEGAL, 2013).
Além do posicionamento e da ocupação por nucleossomos, a taxa de renovação
(turnover) de nucleossomos – mais alta em promotores e mais baixa em corpos gênicos –
também participa da regulação da expressão gênica e da delimitação dos estados de
cromatina. Cada ciclo de turnover de nucleossomos apaga as modificações de histonas de
um determinado local e a supressão do turnover evita o início espúrio da transcrição em
corpos gênicos (ZENTER; HENIKOFF, 2013). A trimetilação da histona H3 no resíduo de
lisina 36 (H3K36me3), estabelecida pela metiltransferase SET2, impede o turnover de
nucleossomos.
Modificações do DNA
Metilação do DNA
A metilação do DNA é um tipo de modificação química do DNA – que é herdável e
pode ser estabelecida e removida sem mudar a sequência original do DNA. Ela participa:
• Na regulação da expressão gênica (ativação e silenciamento).
• Na manutenção da identidade celular (BLOMEN; BOONSTRA, 2011).
• Na regulação da maioria dos genes imprinted (FEIL; BERGER, 2007).
• Na inativação de elementos de transposição.
• No silenciamento de elementos repetitivos.
• Na estabilidade cromossômica.
• Como um sinal epigenético de memória, transmitido durante a replicação do DNA
(PAULSEN et al., 2008).
A metilação do DNA, ou melhor, a metilação de uma citosina localizada em posição 5’
a um resíduo de guanina (dinucleotídeo CpG, ou seja, citosina ligação fosfato guanina) na
sequência do DNA, é a principal marca do silenciamento gênico epigenético em mamíferos.
O principal mecanismo que guia o estabelecimento do padrão de metilação é um fator em
cis, ou seja, a própria sequência do DNA (BIRD, 2011).
A metilação ocorre por meio da adição, por ligação covalente, de um grupamento metil
(-CH3) na posição 5 do anel pirimídico de uma citosina, transformando-a em 5-metil-
citosina (5mC) (Figura 2). Assim, a metilação é uma modificação pós-sintética, à medida
que os nucleotídeos só são modificados após terem sido incorporados ao DNA. A 5mC é
considerada o “quinto nucleotídeo” e constitui cerca de 1% de todas as bases de DNA
(TOST, 2010).
 
Figura 2. Metilação do DNA: adição de um grupamento metil (-CH3) na posição 5 do anel
pirimídico de uma citosina, pela enzima metiltransferase de DNA (DNMT), transformando-a
em 5-metil-citosina.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
O DNA é metilado (Figura 2) por meio da ação das metiltransferases de DNA
(DNMTs). Na metilação, o doador universal do grupamento metil é a S-adenosil-L-metionina
(SAM), sintetizada a partir de doadores de metil (metionina e colina) e co-fatores (ácido
fólico, vitamina B12 e fosfato de piridoxal) (TOST, 2010). As DNMTs catalisam a
transferência de um grupo metil da SAM para a citosina. Em mamíferos, já foram
identificadas três famílias de metiltransferases de DNA: a) DNMT1, composta pelas
isoformas somáticas DNMT1s (190 kDa) e oocitária DNTM1o (175 kDa); b) DNMT2; c)
DNMT3, composta pelas DNMT3A, DNMT3B e DNMT3L.
A DNMT1 é a enzima envolvida na manutenção dos padrões de metilação a cada
replicação do DNA e metila, preferencialmente, o DNA hemimetilado (Figura 3A).
A DNMT1o, específica do gameta feminino (oócito), parece ser importante na manutenção
do padrão de imprinting na segunda onda de desmetilação global do genoma, que ocorre
após a fecundação (ver Capítulos 6 e 7) (FAULK; DOLINOY, 2011; RIVERA; ROSS, 2013).
A DNMT2, que parece ter pouca atividade in vitro de metilação do DNA, tem função de
metiltransferase específica de RNA transportador (t-RNA) (PAULSEN et al., 2008).
As DNMT1o e DMNT3B têm atividade de metilação de novo durante a embriogênese
(Figura 3B); a DNMT3A está associada à heterocromatina (BLOMEN; BOONSTRA, 2011);
e a DNMT3L está envolvida no desenvolvimento da linhagem germinativa (TOLLEFSBOL,
2004) e aumenta a atividade das DNMT3A e DNMT3B (RIVERA; ROSS, 2013).
 
Figura 3. Ação das metiltransferases de DNA (DNMTs) na fita de DNA (em roxo) e nas
metilações (círculos alaranjados). A) Manutenção de metilação: após a replicação do DNA
nas divisões celulares, a DNMT1 promove a metilação da fita de DNA hemimetilada; B)
Metilação de novo: a DNMT3A e a DNMT3B promovem metilação de uma dupla-fita de DNA
não metilada.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
As enzimas que promovem a desmetilação do DNA são menos conhecidas.
A desmetilação pode ocorrer de maneira passiva, pela replicação do DNA na ausência de
DNMT1, ou de maneira ativa, por processos enzimáticos. Na ausência de SAM, a
desaminação da citosina metilada em timina induz a um processo de reparo, envolvendo a
glicosilase e a AID citidina desaminase, que pode levar à desmetilação. A desmetilação
ativa também ocorre por oxidação da 5mC em 5-hidroxi-metil-citosina (5hmC) pelas
dioxigenases da família ten-eleven translocation (Tet 1, 2 e 3) (GU et al., 2011).
Silenciamento gênico
Na região promotora de genes, a metilação do DNA está relacionada ao silenciamento
gênico (ENRIGHT et al., 2003), e 88% dos promotores ativos são regulados por metilação
(TOST, 2010). O silenciamento gênico, mediado por metilação, pode ocorrer de duas
maneiras (MUTHUSAMY et al., 2010), conforme mostra a Figura 4:
Silenciamento direto – Quando a própria metilação do DNA impede a ligação de
fatores de transcrição ou afeta o estado de condensação e a estrutura da cromatina.
Silenciamento indireto – Quando a metilação do DNA promove o recrutamento de
proteínas ligadoras de metil (MBP) que formam complexos repressores. É o mecanismo
mais comumente usado para o silenciamento gênico.
Figura 4. Silenciamento gênico mediado por metilação do DNA. A) Mecanismo direto: a
metilação do DNA (pirulitos alaranjados) impede a ligação de fatores de transcrição (FT) e o
acoplamento da maquinaria de transcrição ao promotor, promovendo o silenciamento
gênico; B) Mecanismo indireto: a metilação do DNA recruta proteínas ligadoras de metil (em
rosa) que formam complexos repressores (R) no promotor, que suprimem a expressão do
gene. TSS = sítio de início de transcrição.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
A maioria das citosinas em CpG, principalmente em regiões repetitivas, elementos de
transposição e regiões intergênicas é constantemente metilada, e o DNA é mantido em
estado de heterocromatina, garantindo a estabilidade genômica e evitando a ocorrência de
inserções, translocações e recombinações. Nessas regiões, a citosina metilada sofre altas
taxas de mutação, pois ela é convertida em timina por desaminação hidrolítica espontânea
(SHEN et al., 1994).
Por sua vez, citosinas não metiladas – que não sofrem altas taxas de mutação
espontânea – aparecem em clusters CpG localizados em sequências regulatórias de
genes. Esses clusters, chamados de ilhas CpG, são mantidos livresde metilação,
facilitando o estabelecimento de uma estrutura de cromatina aberta e a promoção do início
da transcrição. Assim, as ilhas CpG são marcos genômicos que compreendem os
promotores da maioria dos genes (ILLINGWORTH et al., 2010). As regiões adjacentes
(até 2 kb) às ilhas CpG também são reguladas por metilação do DNA e são chamadas de
CpG shores. Essas CpG shores estão associadas ao controle da expressão gênica
específica de tecido que ocorre durante a diferenciação tecidual normal (IRIZARRY et al.,
2009).
A primeira caracterização das ilhas CpG foi feita por Gardiner-Garden e Frommer
(1987), que descreveram que uma ilha CpG deve conter mais de 50% de conteúdo G+C,
razão GC observada/GC esperada maior que 0,6 e tamanho mínimo de 200 bp. Após o
sequenciamento do genoma de mamíferos, foi observado que essa definição de ilhas CpG
englobava sequências que não são associadas a regiões promotoras, mas a elementos
repetitivos. Assim, Takai e Jones (2003) desenvolveram um critério mais rigoroso para
detectar ilhas CpG funcionais:
• O conteúdo G+C deve ser superior a 55%.
• A razão GC observada/GC esperada, superior a 0,65.
• O tamanho mínimo de 500 bp.
Essa definição inclui quase todas as ilhas CpG regulatórias e exclui aquelas
associadas a elementos repetitivos (PAULSEN et al., 2008). Há também um algoritmo que
foi desenvolvido para detectar ilhas CpG, o CpGcluster, o qual se baseia na distribuição da
distância física entre dinucleotídeos CpG vizinhos no cromossomo e não considera o
conteúdo G+C, o tamanho e nem a fração CpG para identificar uma ilha CpG
(HACKENBERG et al., 2006).
Ferramentas estatísticas disponíveis on-line, como o MethPrimer1 (LI; DAHIYA, 2002)
e o Emboss2, podem ser usadas para identificar as ilhas CpG em genes de interesse.
Diferentemente da metilação das ilhas CpG, em regiões promotoras que levam ao
silenciamento gênico, os altos níveis de metilação de DNA no corpo dos genes tendem a
estar associados a genes ativamente transcritos (WU et al., 2012).
Proteínas ligadoras de metil (MBP)
Há várias proteínas que interagem com especificidade à 5mC e regulam a expressão
gênica de maneira indireta, como as proteínas de domínio de ligação metil-CpG (MBP),
que podem ser consideradas como intérpretes do sinal covalente do DNA. Em muitos
casos, essas proteínas exercem papel de ponte entre o DNA e as modificações da
cromatina, além de servirem como moduladores da transcrição gênica. Em mamíferos, as
MBP são divididas em três famílias estruturalmente diferentes (FOURNIER et al., 2012):
a) Família MBD (MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 e MBD4), que se ligam,
simetricamente, a dinucleotídeos CpG metilados via domínio MBD:
• A MeCP2 está associada à repressão transcricional, pois recruta enzimas
desacetilases de histonas (HDACs) e associa-se à DNMT1, e à regulação da
conformação de cromatina de alta ordem.
• A MBD1 mantém a metilação em H3K9 em locos metilados, o que assegura a
herança do estado de metilação, e contribui na formação da heterocromatina,
ao interagir com a proteína 1 associada à heterocromatina (HP1).
• A MBD2, assim como a MeCP2, associa-se à DNMT1.
• A MBD3 possui uma mutação e não interage com 5mC em humanos. E em
outras espécies mamíferas interage com remodeladores de cromatina
dependentes de ATP e HDACs e participa na manutenção de imprinting.
• A MBD4 está envolvida no reparo de DNA e na desmetilação do DNA por
glicolisação e excisão de base.
b) Proteínas Kaiso (ou ZBTB33) e semelhantes a Kaiso (ZBTB4; ZBTB38), que se
ligam a sequências consenso não metiladas:
• A proteína Kaiso interage com o complexo correpressor NCoR, cujo
recrutamento é necessário na hipoacetilação de histonas e na metilação de
H3K9 no promotor de genes-alvo.
• A ZBTB38 interage com os correpressores CtBPS que reprimem a transcrição
num processo independente de metilação.
c) Proteínas de domínio SRA, domínio associado a Set e Ring (UHRF1 e UHRF2),
ligam-se à H3K9 trimetilada (H3K9me3) pelo domínio TTD; ao DNA metilado pelo domínio
SRA; e possuem atividade de E3 ubiquitina quinase pelo domínio RING:
• A UHRF1 reconhece e liga-se à arginina 2 da histona H3 (H3R2) não modificada,
está envolvida na formação da heterocromatina pericentromérica, contribui para
a memória epigenética (manutenção do padrão de metilação do DNA da célula-
mãe para as células-filhas durante as divisões celulares) pelo recrutamento de
DNMT1 e participa na manutenção de marcas de histonas.
Assim, o processo de metilação e de desmetilação do DNA é controlado pela ação de
três classes de enzimas e de proteínas:
• As metiltransferases de DNA.
• A maquinaria de desmetilação.
• As proteínas que interagem com 5mC e DNMT.
A metilação do DNA está relacionada com as modificações da cromatina, e as
enzimas que modificam o DNA interagem com as enzimas que modificam as histonas
(PAULSEN et al., 2008).
A metilação do DNA é mecanicamente e funcionalmente ligada a outros mecanismos
epigenéticos, principalmente a metilação de lisina nas histonas: a metilação do DNA é
correlacionada com a ausência de metilação de H3K4 e, mais fracamente, com a presença
de metilação de H3K9. Além disso, a metilação de DNA é antagonista da variante de
histona H2A.Z (FOURNIER et al., 2012).
Outras modificações do DNA
A 5hmC (Figura 5), produto da oxidação da 5mC pelas enzimas da família Tet, é uma
intermediária da desmetilação ativa do DNA que se acumula com a idade (SONG et al.,
2012) e já foi detectada no cérebro e em células-tronco embrionárias, mas está ausente
em linhagens celulares de câncer (LEE et al., 2011).
Além de ser um produto da desmetilação ativa, a 5hmC também promove
desmetilação, pois evita a metilação de citosina por DNMT1, levando à desmetilação
passiva durante as divisões celulares; ainda em decorrência da sua baixa afinidade por
MeCP2, MBD1, MBD2 e MBD4, resulta na ativação da transcrição de genes (DAHL et al.,
2011). A 5hmC é mais frequentemente encontrada em sequências ricas em G e em regiões
imediatamente adjacentes a sítios de ligação de fatores de transcrição, e 50% das 5hmCs
estão localizadas em elementos regulatórios distais, como sítios de ligação de p300,
enhancers, sítios de ligação de CTCF e sítios de hipersensibilidade à DNaseI (SONG
et al., 2012; YU et al., 2012).
Mais recentemente, outras modificações de citosina, intermediárias da desmetilação
de 5mC produzidas pela Tet, foram descritas (Figura 5):
• 5-formil-citosina (5fC), dez vezes menos frequente que a 5hmC.
• 5-carboxil-citosina (5caC), dez vezes menos frequente que a 5fC.
Figura 5. Modificações de citosina no DNA. A citosina (C) é modificada em 5-metil-citosina
(5mC) pelas metiltransferases de DNA (DNMTs); a 5mC é modificada em 5-hidroxi-metil-
citosina (5hmC), 5-formil-citosina (5fC) e 5-carboxil-citosina (5caC) pelas dioxigenases da
família ten-eleven translocation (Tet). A 5caC é removida por cascata de descarboxilação.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Essas modificações diminuem a velocidade de transcrição pela RNA polimerase II, e a
presença de 5fC é mais frequente em ilhas CpG de promotores e de éxons (SONG et al.,
2012).
Modificações epigenéticas do RNA
Além das modificações do DNA, já foram descritas mais de 100 tipos de modificações
epigenéticas no RNA, a maioria em tRNA e em RNA ribossômico (rRNA). A metil-6-
adenosina (m6A) é a modificação mais abundante do RNA poliadenilado e a mais frequente
em RNA mensageiro (mRNA) (SONG et al., 2012). A m6A é observada em vários genes,
com maior frequência no início da 3’UTR, além de íntrons, 5’UTR, éxons, junções de
splicing, RNAs não codificadores (ncRNAs) e regiões intergênicas (SALETORE et al.,
2012).
A m6A inibe a edição do RNA, pois regula o processamento do RNA em transcrito
maduro e, por se apresentar em grande quantidade próxima ao códon de terminação (stop
códon), pode regular a terminação da tradução (SALETOREet al., 2012).
Considerações finais
Entre os tipos de modificações epigenéticas que afetam a conformação da cromatina,
destacam-se o posicionamento dos nucleossomos formados por duas cópias de cada uma
das histonas H2A, H2B, H3 e H4, o estado de compactação, a estrutura de enovelamento
da cromatina, e a metilação do DNA. Enquanto numa determinada região do DNA a
ausência de nucleossomos torna essa sequência mais acessível aos fatores de transcrição
e mais transcricionalmente ativa, a metilação do DNA na citosina (5mC) de sítios CpG,
promovida pelas metiltransferases de DNA (DNMTs), é a principal marca de silenciamento
gênico.
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Capítulo 3
Modificações epigenéticas II
Modificações pós-traducionais de histonas
Simone Cristina Méo Niciura
Introdução
Conforme visto no Capítulo 2, as histonas são constituintes dos nucleossomos que
afetam, diretamente, a estrutura da cromatina e apresentam sítios para modificações pós-
traducionais e superfície para a interação com outras proteínas. As modificações de
histonas estão ligadas, essencialmente, a todos os processos celulares que requerem o
acesso ao DNA (ZENTER; HENIKOFF, 2013):
• Condensação.
• Transcrição.
• Replicação.
• Reparo.
Assim, além da metilação do DNA, o estado de condensação da cromatina e a
regulação da expressão gênica também são determinados pelas modificações nas histonas
(Figura 1).
Figura 1. Resíduos de arginina (R), histidina (H), lisina (K), serina (S) e treonina (T) nas
histonas (em roxo) H2A, H2B, H3 e H4, modificados por acetilação, metilação, fosforilação e
ubiquitinação. DNA (em alaranjado), que pode estar metilado, enovelado nas histonas.
Fonte: modificado de Spivakov e Fisher (2007).
Por sua maior acessibilidade ao nucleossomo, a região aminoterminal (cauda-N) das
histonas é o sítio mais sujeito a modificações pós-traducionais, que podem ser,
principalmente, de metilação, acetilação, fosforilação e ubiquitinação. A maioria das
modificações de histonas consiste na adição de pequenos grupamentos químicos, exceto a
ubiquitinação, que envolve a adição de um domínio globular de 76 aminoácidos, e a
SUMOilação, com adição de um domínio de ~100 aminoácidos (ZENTER; HENIKOFF,
2013). As modificações mais estudadas são a acetilação, de natureza transitória, e a
metilação, marca celular de longa duração, de resíduos de lisina na cauda aminoterminal
das histonas H3 e H4 (IACOBUZIO-DONAHUE, 2009).
As modificações de histonas podem ocorrer em vários sítios e já foram descritos mais
de 60 resíduos de aminoácidos com modificações, algumas delas mostradas na Tabela 1.
Tabela 1. Resíduos de lisina (K), serina (S) e arginina (R) na cauda aminoterminal das histonas H2A, H2B, H3
e H4, modificados por acetilação, metilação, fosforilação e ubiquitinação.
Histonas Acetilação Metilação Fosforilação Ubiquitinação
H2A K: 5 e 9 – S: 1 K: 119
H2B K: 5, 12, 15 e 20 – – K: 123
H3 K: 9, 14, 18 e 23
K: 4, 9, 27, 36 e 79
R: 2, 17 e 26
S: 10 e 28 –
H4 K: 5, 8, 12 e 16
K: 20
R: 3
S: 1 –
Fonte: modificado de Whitelaw e Garrick (2005).
Acetilação e desacetilação de histonas
O aminoácido que sofre monoacetilação (ac) é a lisina (Figura 2) em histona H2A,
H2B, H3 e H4 (NIGHTINGALE et al., 2006). A acetilação de histonas neutraliza a carga
positiva nos resíduos de lisina, enfraquecendo as interações eletrostáticas entre as
histonas e o esqueleto fosfato do DNA, o que favorece a expressão gênica. Além disso, a
acetilação de histonas promove o recrutamento e a ligação de proteínas regulatórias.
A acetilação de lisina nas histonas H3 e H4 está correlacionada com a cromatina ativa
ou aberta, pois permite que vários fatores de transcrição tenham acesso aos promotores
gênicos (IACOBUZIO-DONAHUE, 2009). Assim, a acetilação da lisina (K) 5 na histona H4
(H4K5ac) reflete o estado total hiperacetilado da histona H4, e a acetilação de H3K9 e de
H3K14 ocorre na região promotora de genes ativos. Além da acetilação de resíduos na
cauda-aminoterminal, já foi descrita a acetilação de uma lisina no domínio globular da
histona H3: H3K56ac (KOUZARIDES, 2007).
A acetilação das histonas é promovida pelas enzimas acetiltransferases de histonas
(HATs), também chamadas de acetiltransferases de lisina (KATs), enquanto a desacetilação
é feita pelas desacetilases de histonas (HDACs), conforme mostra a Figura 2 (ALLIS et al.,
2007; IACOBUZIO-DONAHUE, 2009).
Figura 2. Acetilação de lisina (Kac) pelas acetiltransferases de histonas (HATs) e
desacetilação pelas desacetilases de histonas (HDACs).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Geralmente, as HATs modificam mais do que uma lisina, e várias HATs fazem parte de
grandes complexos multiproteicos reguladores da transcrição. A Tabela 2 mostra as
principais HATs de humanos, seus substratos de histonas e suas funções.
Tabela 2. Modificações de acetilação em resíduos de lisina (K) das histonas H2A, H2B, H3 e H4, substratos
para as acetiltransferases de histonas (HATs) em humanos e suas funções.
Substrato HAT (1) Função
H4K5, H4K12 KAT1 (HAT1) Deposição de histona, reparo de DNA
H3K9, H3K14, H3K18,
H2B KAT2A (hGCN5) Ativação da transcrição
H3K9, H3K14, H3K18,
H2B KAT2B (PCAF) Ativação da transcrição
H2AK5, H2BK12,
H2BK15 KAT3A (CBP) Ativação da transcrição
H2AK5, H2BK12,
H2BK15 KAT3B (P300) Ativação da transcrição
H3 > H4 KAT4 (TAF1) Ativação da transcrição
H4K5, H4K8, H4K12 e
H4K16 KAT5 (TIP60 ou PLIP) Ativação da transcrição, reparo de DNA
H3K14 KAT6A (MOZ ouMYST3) Ativação da transcrição
H3K14 KAT6B (MORF ouMYST4) Ativação da transcrição
H4K5, H4K8, H4K12 > H3 KAT7 (HBO1 ouMYST2) Transcrição, replicação do DNA
H4K16 KAT8 (HMOF ouMYST1)
Limites de cromatina, compensação de dosagem, reparo
de DNA
H3 KAT9 (ELP3) –
H3K9, H3K14, H3K18 KAT12 (TFIIIC90) Transcrição por DNA polimerase III
H3, H4 KAT13A (SRC1) Ativação da transcrição
H3, H4 KAT13B (ACTR) Ativação da transcrição
H3, H4 KAT13C (P160) Ativação da transcrição
H3, H4 KAT13D (CLOCK) Ativação da transcrição
(1) Os sinônimos pelos quais as HATs também são conhecidas encontram-se entre parênteses.
Fonte: Allis et al. (2007).
As HATs são coativadores transcricionais que não se ligam, diretamente, ao DNA, mas
a ativadores, como as proteínas de bromodomínios, as quais se ligam a resíduos
específicos de lisinas nas histonas (ABCAM, 2011; KOUZARIDES, 2007):
• ATAD2 (H3K14ac).
• BRD2,3,4,7 (H3ac, H4ac).
• BRDT (H4K5ac, H4K8ac, H3K18ac).
• CBP/p300 (H3ac, H4ac, H3K36ac, H4K20ac).
• GCN5 (H4K16ac).
• hBRG1 (H3K14ac).
• PB-2 (H3K14ac).
• P/CAF (H3ac, H4ac, H4K16ac).
• Polybromo/BAF180 (H3ac).
• TAF1 (H3ac, H4ac).
• TRIM24 (H3K23ac).
Há aproximadamente 18 famílias de HDACs (COPELAND et al., 2009), que
geralmente parecem não apresentar muita especificidade para um resíduo de lisina
acetilada em particular (KOUZARIDES, 2007). Entretanto, há enzimas específicas, como
(ABCAM, 2011):
• SIRT4 para H4K16.
• SIRT6 para H3K9.
• HDAC1 e HDAC2 para H3K56.
Metilação e desmetilação de histonas
Os aminoácidos sujeitos à modificação por mono- (me1), di- (me2) e trimetilação
(me3) de histonas são lisina (me1, me2 e me3) e arginina (me1 e me2), conforme é
mostrado na Figura 3 (NIGHTINGALE et al., 2006). A metilação não altera a carga do
aminoácido, mas promove uma modificação química (grupamento metil) que aumenta a
hidrofobicidade e a basicidade, o que leva à maior afinidade por moléculas aniônicas, como
o DNA, e ao maior recrutamento e ligação de proteínas regulatórias.
Figura 3. Metilação de lisina e arginina pelas metiltransferases de proteínas que transferem um grupo metil (-
CH3) do doador universal S-adenosil-L-metionina (SAM), resultando no aminoácido metilado e no produto S-
adenosil-L-homocisteína (SAH): A) mono- (Kme1), di- (Kme2) e trimetilação de lisina (Kme3) pelas
metiltransferases de lisina (PKMTs); B) mono- (Rme1) e dimetilação assimétrica (Rme2a) ou simétrica de
arginina (Rme2s) pelas metiltransferases de arginina (PRMTs).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
As proteínas ligadoras de metil de histonas (HMBPs), do inglês histone methyl-binding
proteins, promovem o recrutamento de outras proteínas regulatórias associadas à
cromatina, como proteínas PHD, Polycomb e proteína 1 associada à heterocromatina
(HP1), que mantém a metilação de H3K9. Além disso, as chances de transcrição são
aumentadas pela interação das histonas metiladas com as proteínas de cromodomínios
(Tabela 3).
Tabela 3. Modificações de metilação de resíduosde lisina (K) e arginina (R) nas histonas H1, H2A, H3 e H4,
substratos para metilltransferases de proteínas (PMTs), desmetilases e proteínas regulatórias PHD e de
cromodomínios (cromo).
Substrato PMT (1) Desmetilases (1) PHD Cromo
H1K25 KMT1C (G9a ou EHMT2)
KMT1D (EHMT1)
KMT6 (EZH2)
KDM4D (JMJD2D) – –
H1K186 KMT1C (G9a ou EHMT2)
KMT1D (EHMT1)
– – –
H2AR3 PRMT6 – – –
H2AR11 PRMT1
PRMT6
– – –
H2AR29 PRMT1
PRMT6
– – –
H3R2 PRMT4 (CARM1)
PRMT6
JMJD6 – –
H3K4 KMT2A (MLL1)
KMT2B (MLL2)
KMT2C (MLL3)
KMT2D (MLL4)
KMT2E (MLL5)
KMT2F (SETD1A)
KMT2G (SETD1B)
KMT2H (ASH1)
KMT3E (SMYD3)
KMT7 (SET7/9)
WHSC1L1 (NSD3)
PRDM0
KDM1 (LSD1 ou BHC110)
KDM2A (JHDM1a ou
FBXL11)
KDM2B (JHDM1B)
KDM5A (JARID1A ou RBP2)
KDM5B (JARID1B ou PLU1)
KDM5C (JARID1C ou
SMCX)
KDM5D (JARID1D ou
SMCY)
PHF8 (JHDM1F)
NO66
BPTF/dmNURF301
ING1,2,3,4,5
KIAA1718
Lid
PHF2,8
PHO23
Pygo
RAG2
TAF3
CHD1
hMRG15
PHF20L1
H3R8 PRMT5 – – –
H3K9 KMT1A (SUV39H1)
KMT1B (SUV39H2)
KMT1C (G9a ou EHMT2)
KMT1D (EHMT1)
KMT1E (ESET ou
SETDB1)
KMT1F (CLL8 ou
SETDB2)
KMT8 (RIZ1)
KDM1 (LSD1 ou BHC110)
KDM1B (LSD2)
KDM3A (JHDM2a)
KDM3B (JHDM2b)
KDM4A (JMJD2A ou
JHDM3A)
KDM4B (JMJD2B)
KDM4C (JMJD2C ou
GASC1)
KDM4D (JMJD2D)
KDM7 (JHDM1D)
PHF8 (JHDM1F)
CHD4
ICBP90 (Np95)
JARID1C
SMCX
BX1,3,5
CBX2,4,6,7,8
CDY1
HP1/spSwi6
L3MBTL1/2
MPP8
PC1/PC2/PC/LHP1
SFMBT
Tip60
H3R17 PRMT4 (CARM1) – – –
H3R26 PRMT4 (CARM1) – – –
H3K27 KMT1C (G9A ou EHMT2)
KMT1D (EHMT1)
KDM6A (UTX)
KDM6B (JMJD3)
– CBX2,4,6,7,8
PC1/PC2/PC/LHP1
KMT6 (EZH2)
KMT6B (EZH1)
WHSC1L1 (NSD3)
PHF8 (JHDM1F)
KDM7 (JHDM1D)
H3K36 KMT2H (ASH1L)
KMT3A (SETD2)
KMT3B (NSD1)
KMT3C (SMYD2)
WHSC1 (NSD2)
SETMAR
KDM2A (JHDM1a ou
FBXL11)
KDM2B (JHDM1b ou
FBXL10)
KDM4A (JMJD2A ou
JHDM3A)
KDM4B (JMJD2B)
KDM4C (JMJD2C ou
GASC1)
KDM8 (JMJD5)
NO66
– hMRG15
MSL3
H3K79 KMT4 (DOT1L) – – –
H4R3 PRMT1
PRMT5
PRMT6
JMJD6 – –
H4K20 KMT5A (SETD8)
KMT5B (SUV420H1)
KMT5C (SUV420H2)
KMT3B (NSD1)
WHSC1 (NSD2)
PHF8 (JHDM1F) – L3MBTL1
PHF20L1
SFMBT
(1) Os sinônimos, pelos quais as metiltransferases e as desmetilases também são conhecidas, figuram entre
parênteses.
Fonte: Abcam (2011), Allis et al. (2007), Copeland et al. (2009) e Histome (2013).
Em decorrência de suas características e das variações nas proteínas recrutadas, a
metilação de histonas pode promover a repressão ou a ativação gênica, dependendo de
qual resíduo de aminoácido é modificado. Por exemplo, a metilação de H3K4, H3K36 e
H3K79 provoca ativação gênica, enquanto a metilação de H3K9, H3K27 e H4K20 promove
silenciamento (SEGA et al., 2007; TALASZ et al., 2005).
A metilação das histonas é promovida pelas metiltransferases de proteínas (PMTs),
que provocam a metilação de resíduos de lisina (metiltransferases de lisinas ou PKMTs) ou
arginina (metiltransferases de argininas ou PRMTs) pela transferência de metil do doador
universal S-adenosil-L-metionina (SAM), resultando no subproduto S-adenosil-L-
homocisteína (SAH) (Figura 3); já a desmetilação é promovida pelas desmetilases
(COPELAND et al., 2009) (Tabela 3).
Com exceção da DOT1L, todas as PKMTs humanas contêm um domínio catalítico de
130 aminoácidos, chamado de domínio SET. O enhancer of zeste homologue 2 (EZH2 ou
KMT6) é uma proteína de domínio SET que forma a subunidade catalítica do complexo
repressivo Polycomb 2 (PRC2), que metila H3K27 (COPELAND et al., 2009).
Em parte, a metilação de histona afeta a expressão gênica por meio de sua
associação à metilação do DNA, uma vez que as proteínas envolvidas na metilação do
DNA (DNMTs) também interagem, diretamente, com as PMTs (IACOBUZIO-DONAHUE,
2009).
Proteínas regulatórias Polycomb
As proteínas do grupo Polycomb (PcG) são reguladoras epigenéticas essenciais para
o desenvolvimento normal e a manutenção da expressão gênica específica de tecido em
organismos multicelulares (ZHOU et al., 2011). As proteínas PcG de mamíferos estão
envolvidas (CASA; GABELLINI, 2012):
• Na memória celular durante o desenvolvimento e a diferenciação.
• Na proliferação celular.
• No genomic imprinting.
• Na inativação do cromossomo X em fêmeas.
• No desenvolvimento de câncer.
As proteínas desse grupo podem desempenhar sua atividade por interações de longa
distância e em diferentes cromossomos, colaboram com os repressores para manter o
silenciamento gênico e são contrabalanceadas pelas proteínas do grupo Tritorax (TrxG),
que promovem a ativação gênica (CASA; GABELLINI, 2012; DE FELICI, 2011).
As proteínas PcG formam dois complexos multiproteicos principais: complexos
repressivos Polycomb 1 (PRC1) e 2 (PRC2). O PRC1 possui o domínio Ring1B, que é
uma ligase de ubiquitina E3, promove ubiquitinação de H2AK119 e, assim, evita a
elongação do transcrito e promove, também, a compactação da cromatina (BLOMEN;
BOONSTRA, 2011; CASA; GABELLINI, 2012). O PRC2, via subunidade catalítica EZH2,
leva à H3K27me3, marca fundamental da ligação Polycomb associada ao silenciamento
epigenético estável (ANGEL et al., 2011; DE FELICI, 2011). O PRC2 também contém a
subunidade não catalítica embryonic ectoderm development (EED) que interage com as
HDACs (DE FELICI, 2011).
As modificações ativas, associadas à ativação gênica H3K4me3 e H3K27ac, são
reguladas pelo grupo TrxG e facilitam a elongação transcricional (BLOMEN; BOONSTRA,
2011).
Outras modificações de histonas
Outras possíveis modificações de histonas – como fosforilação, ubiquitinação,
SUMOilação, ADP-ribosilação, citrulinação, biotinilação e glicosilação – são descritas a
seguir.
Fosforilação de histonas
A fosforilação (ph) de histonas ocorre em serina (S), treonina (T) e tirosina (Y)
(Figura 4) (HISTOME, 2013; NIGHTINGALE et al., 2006) e transmite uma carga negativa
para o resíduo modificado. Como o esqueleto fosfato do DNA possui carga negativa, cria
repulsão de cargas, o que potencialmente enfraquece a associação do DNA com as
histonas (ZENTER; HENIKOFF, 2013).
Figura 4. Serina (S), treonina (T) e tiro​sina (Y) fosforiladas (ph).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
A H3S10ph promove ativação transcricional, e a H3T118ph interfere no enovelamento
dos nucleossomos e torna a cromatina mais acessível, enquanto a fosforilação em H3 e
em H1 leva à condensação cromossômica na mitose, e em H2A.XS139ph (ou y-H2A.X)
leva à apoptose. A fosforilação é feita por quinases, e a desfosforilação por fosfatases
(Tabela 4).
Tabela 4. Modificações de fosforilação em resíduos de serina (S), treonina (T) e
tirosina (Y) nas histonas H1, H2A, H2B, H3 e H4, substratos para as quinases e
fosfatases de histonas.
Substrato Quinase (1) Fosfatase (1)
H1T10 GSK3B –
H2AS1 MSK1 (RPS6KA5) –
H2AT119 NHK-1 –
H2AT120 BUB1 –
H2AS139
ATM
ATR
PRKDC
PPM1D
PPP2CA
PPP2CB
PPP4C
H2AY142 WSTF (BAZ1B)
EYA1
EYA2
EYA3
H2BS14 MST1 (STK4) –
H3T3 Haspin (GSG2) –
H3S6 Aurora B (AURKB) –
H3T6 PRKCB –
H3S10
Aurora B (AURKB)
IKK alfa (CHUK)
MSK1 (RPS5KA5)
MSK2 (RPS6KA4)
Pim1
MAP3K8
PAK2
PKU-beta (TLK1)
PTPN10 (MKP-1)
H3T11
ZIP (DAPK3)
PKN1 (DBK)
PPP1 gama
H3S28
Aurora B (AURKB)
MSK1 (RPS5KA5)
MSK2 (RPS6KA4)
–
H3Y41 JAK2 –
H3T45 PRKCD –
H4S1 CKII –
(1) Os sinônimos, pelos quais as quinases e as fosfatases também são conhecidas,
estão entre parênteses.
Fonte: Abcam (2011) e Histome (2013).
Ubiquitinação de histonas
A monoubiquitinação (ub) de histonas ocorre em lisina (K) (NIGHTINGALE et al.,
2006), geralmente em H2A e em H2B. A ubiquitinação em corpos gênicos já foi associada
à elongação da transcrição, enquanto em promotores provoca a repressão da arquitetura
da cromatina(ZENTER; HENIKOFF, 2013). A H2BK123ub em S. cerevisiae está associada
ao crescimento mitótico e meiótico; a H2BK123ub, à ativação da transcrição; e a
H2AK119ub, ao silenciamento gênico. As reações de ubiquitinação são promovidas pelas
ligases de ubiquitina e as de desubiquitinação, pelas desubiquitinases (Tabela 5).
Tabela 5. Modificações de ubiquitinação em resíduos de lisina (K) das histonas H2A, H2B e H4, substratos
para as ligases de ubiquitina e desubiquitinases de histonas.
Substrato Ligase (1) Desubiquitinase
H2AK119
Bmi
RING1
RING2
MYSM1
H2AK121 RING2 –
H2BK120
RNF20 (BRE1A)
RNF40 (BRE1B)
RBX1
UBCH6
–
H4K91 DTX3L (BBAP) –
(1) Os sinônimos, pelos quais as ligases também são conhecidas, estão entre parênteses.
Fonte: Abcam (2011) e Histome (2013).
SUMoilação de histonas
A mono-SUMOilação (sumo) de histonas ocorre em lisina (NIGHTINGALE et al., 2006)
nas histonas H2A, H2B e H4 e foi uma modificação descoberta recentemente em
leveduras. SUMO, do inglês small ubiquitin-related modifier, é similar à ubiquitinação e
promove silenciamento quando associado à histona H4. A proteína ligadora de metil MBD1
também é modulada por um sistema de SUMOilação (FOURNIER et al., 2012).
ADP-ribosilação de histonas
A mono- e poli-ADP ribosilação de histonas ocorre em glutamina e lisina das quatro
histonas centrais e trata-se de uma marca transitória que também transmite carga negativa
aos resíduos modificados e está associada ao afrouxamento da cromatina (NIGHTINGALE
et al., 2006; ZENTER; HENIKOFF, 2013).
A ADP-ribosilação, pela enzima PARP1 (ARTD1), promove a adição de cadeias
poli(ADP-ribose) a proteínas, como as histonas centrais (H2AK13, H2BK30, H3K27, H3K37
e H4K16), à histona H1 e a várias proteínas não histônicas, incluindo fatores de transcrição
(MESSNER et al., 2010; TOLLEFSBOL, 2004).
Citrulinação, biotinilação e glicosilação de histonas
A citrulinação (ci), também chamada de desiminação, ocorre em resíduos de arginina
de histonas e é mediada pelas enzimas desiminase de arginina de proteína (PAD).
A citrulinação participa no processo de apoptose e evita a metilação dos resíduos de
arginina por outras metiltransferases, como CARM1 (HISTOME, 2013). A PADI4 promove
a citrulinação de H2AR3, H3R2, H3R8, H3R17, H3R26 e H4R3.
A biotinilação (bio) de resíduos de lisina leva à formação de marcas abundantes em
regiões reprimidas da cromatina (heterocromatina) e ao silenciamento gênico (HISTOME,
2013). A ligase de biotina HLCS promove a biotinilação de H3K9, H3K18, H4K8 e H4K12.
A glicosilação em treonina e serina das histonas H2A, H2B e H4 está envolvida em
repressão gênica, comprovada pela diminuição da sensibilidade da cromatina à digestão
pela nuclease micrococal. Entretanto, a glicosilação em H2BS112 está associada à
H2BK120ub e à ativação da transcrição (ZENTER; HENIKOFF, 2013).
Código de histonas e estados de cromatina
Em decorrência da existência de vários tipos de marcas de histonas e de inúmeros
resíduos passíveis de modificação nas diferentes histonas, o número de combinações
possíveis de modificações de histonas é enorme. Assim, o tipo e o número de
modificações que direcionam uma resposta biológica são denominados de “código de
histonas”. A hipótese do código de histonas é de que múltiplas modificações de histonas
especificam funções subsequentes únicas (NOZAKI et al., 2011).
Entretanto, é importante mencionar que o conceito de código de histonas ainda não
está completamente estabelecido, visto que a combinação de modificações de histonas
nem sempre leva a respostas diferentes das modificações isoladamente e mais de uma
combinação de modificações pode determinar uma mesma resposta biológica (RANDO,
2012).
Considerando o código de histonas, os diferentes aspectos da expres​são gênica
podem ser associados a diferentes padrões de modificações. A Tabela 6 mostra um
sumário do padrão de expressão de um gene (ativo, inativo ou pausado) (BRETON et al.,
2010; DE FELICI, 2011; NOZAKI et al., 2011; ZHOU et al., 2011) e dos níveis de
expressão dos genes ativos (alta, intermediária ou baixa) (WANG et al., 2008), em função
das marcas de histona neles presentes.
Tabela 6. Modificações de metilação (me) e acetilação (ac) de resíduos de lisina (K) nas histonas H2B, H3 e
H4 e enriquecimento em H2A.Z, associadas à ativação (expressão gênica alta, intermediária e baixa),
repressão ou pausa da expressão gênica.
Marca de histona
Ativação
Repressão Pausa
Alta Intermediária Baixa
H2A.Z X X X 
H2BK5me1 X 
H2BK5ac X X 
H2BK12ac X X 
H2BK20ac X X 
H2BK120ac X X 
H3K4me1 X X X 
H3K4me2 X X X X
H3K4me3 X X X X
H3K3ac X X 
H3K9me1 X X X 
H3K9me2 X 
H3K9me3 X 
H3K9ac X X 
H3K14ac 
H3K18ac X X 
H3K27me1 X 
H3K27me2 X 
H3K27me3 X X
H3K27ac X X 
H3K36me3 X 
H3K36ac X X 
H3K79me1 X 
H3K79me2 X 
H3K79me3 X 
H4K5ac X X 
H4K8ac X X 
H4K16ac X 
H4K20me1 X 
H4K91ac X X 
As configurações específicas de cromatina podem ser determinadas pela sequência
de DNA, pelos padrões de metilação do DNA, pelos fatores de transcrição, além de outras
proteínas regulatórias, e pela atividade transcricional. As características de sequência,
como ilhas CpG, promotores e elementos repetitivos, tendem a assumir padrões
característicos de modificação e estados de cromatina, que facilitam o reconhecimento
pelos fatores de transcrição e pela maquinaria regulatória (ZHOU et al., 2011). Assim como
o padrão de expressão gênica, a função de diferentes regiões do genoma está associada
a padrões de modificações de histonas (estados da cromatina) (BONN et al., 2012; DE
FELICI, 2011; ZHOU et al., 2011).
Como definição para para compreender os estados de cromatina, os enhancers ou
acentuadores são elementos de DNA que recrutam fatores de transcrição, RNA polimerase
II e reguladores de cromatina de modo a influenciar, positivamente, a transcrição de
promotores gênicos localizados a jusante (ZHOU et al., 2011). Quando os enhancers são
reconhecidos na fita de DNA, formam-se dobras que aproximam genes distantes à região
de transcrição (SANYAL et al., 2012). Os insulators ou isoladores bloqueiam, fisicamente,
o enhancer de modo que o estímulo não alcance o gene próximo a ele (SANYAL et al.,
2012).
Por dependerem de processos regulatórios locais, os estados de cromatina variam no
contexto celular (ZHOU et al., 2011). Ernst et al. (2011) mapearam 9 marcas de cromatina
(CTCF, H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9ac, H3K27me3, H3K27ac, H3K36me3 e
H4K20me1) em 9 tipos celulares e verificaram 15 estados de cromatina, que incluíram:
• Promotor ativo.
• Promotor fraco.
• Promotor inativo/pausado.
• Enhancer forte.
• Enhancer fraco/pausado.
• Insulator.
• Transição transcricional.
• Elongação transcricional.
• Transcrição fraca.
• Repressão por Polycomb.
• Heterocromatina.
• Elemento repetitivo/CNV.
Pelo The ENCODE Project Consortium (2012), 7 estados de cromatina foram preditos
em 2 tipos celulares:
• Elemento rico em CTCF (cromatina aberta; alguns com papel insulator).
• Enhancer (cromatina aberta e H3K4me1).
• Região flanqueadora de promotor (região próxima ao sítio de início de
transcrição – TSS).
• Região de baixa atividade ou reprimida (H3K27me3 Polycomb).
• Região de promotor que inclui o TSS (H3K4me3; cromatina aberta).
• Região transcrita (corpos gênicos; H3K36me3).
• Enhancer fraco (similar ao enhancer, mas com sinais mais fracos).
Na revisão feita por Zhou et al. (2011), sobre a associação entre elementos
genômicos e modificações epigenéticas, foram descritas as seguintes marcas dos estados
de cromatina:
Promotor inativo – H3K27me3, H3K9me3 e metilação de DNA.
Promotor pausado – H3K4me3, H3K27me3 e H2A.Z.
Promotor ativo – H3K4me2, H3K4me3, acetilaçãode histonas e H2A.Z.
Corpos gênicos inativos – H3K9me2 e H3K9me3.
Corpos gênicos ativos – H3K36me3, H3K79me2 e abundância de nucleossomos.
Enhancers inativos – H3K9me2, H3K9me3 e metilação de DNA.
Enhancers ativos – H3K3me1, H3K4me2, H3K27ac e H2A.Z.
Vale ressaltar que uma mesma função pode ser desempenhada por diferentes marcas
de histona, dependendo do contexto de organização de cromatina na qual elas estão
inseridas. Por exemplo, já foi descrita variação nas marcas de histonas que são
dependentes do tipo de promotor TATA box ou CpG (NOZAKI et al., 2011) e dos níveis de
expressão gênica alta, média ou baixa (VAVOURI; LEHNER, 2012). Vavouri e Lehner
(2012) compararam promotores com ilhas CpG (CpG) e promotores sem ilhas CpG (não
CpG) de genes com alta, média e baixa expressão, e observaram que, apesar de ambos
os promotores apresentarem mesma densidade de éxons e de nucleossomos e mesmos
níveis de metilação do DNA a jusante, as variações nas seguintes marcas de histonas
foram observadas:
H3K36me3 (marca de elongação de transcrição em corpos gênicos) – Acúmulo
linear em direção à extremidade 3’ e associada aos níveis de expressão de genes com
promotores CpG e não-CpG, mas maior acúmulo em promotores não CpG no
nucleossomo +1 (primeiro nucleossomo após o TSS).
H4K20me1, H2BK5me2 e H3K79me1/2/3 (marcas de elongação em corpos
gênicos) – Aumentam, rapidamente, em genes de alta expressão com promotores CpG,
mas aparecem em menores níveis em genes com promotores não CpG, nos quais só
aumentam em nucleossomos mais distantes do TSS.
H3K9me1, H3K4me2, H3K4me1 e H3K27me1 (marcas de transcrição gênica) –
Aumentam com o aumento de expressão nos genes com promotores CpG; e menores
níveis de modificação no nucleossomo +1 de genes de alta expressão.
H3K36me1 (corpo gênico) – Presente somente em genes ativos com promotores
CpG; ausente em genes de alta expressão com promotores não CpG.
H2AK5ac, H3K14ac e H3K23ac – Diminuição na região próxima ao TSS somente em
genes com promotores CpG.
Combinação de eventos epigenéticos
Os eventos epigenéticos não ocorrem isoladamente, eles são interdependentes e
contribuem para o estado geral da cromatina e no controle epigenético da expressão
gênica. A metilação de H3K9 inibe a acetilação de H3 em vários resíduos de lisina e pode
promover metilação do DNA (Figura 5A), enquanto a metilação de H3K4 promove a
acetilação da H3 (TOLLEFSBOL, 2004). A metilação do DNA estimula a desacetilação e a
consequente metilação de H3K9 (Figura 5B). A metilação da histona H3K4 e a acetilação
da H3K9 levam a uma estrutura de cromatina ativa, descondensada e geralmente
associada a ilhas CpG não metiladas. Assim, em camundongos e em humanos, a
densidade de ilhas CpG está correlacionada, positivamente, com o grau de H3K4me3
(ILLINGWORTH et al., 2010), sendo acompanhada por acetilação de histona, ocupação
pela variante de histona H3.3 e hipersensibilidade à digestão com DNaseI (ZHOU et al.,
2011). Por sua vez, a metilação de H3K9 é seguida por condensação e por formação de
heterocromatina nas regiões genômicas afetadas. A fosforilação de histonas em resíduos
adjacentes à lisina metilada reduz a afinidade da lisina pelas proteínas de ligação de metil
(ZENTER; HENIKOFF, 2013).
As enzimas também atuam em conjunto: o domínio N-terminal da DNMT1 liga-se às
HDACs e suprime a transcrição gênica pela facilitação da atividade de desacetilase de
histonas (Figura 5C). Além da HDAC1, a DNMT1 também é estabilizada pela
desubiquitinase USP7 (HAUSP), mas é desestabilizada pela acetilação da acetiltransferase
Tip60, o que permite a ubiquitinação de DNMT1 de modo a marcá-la para a degradação
proteossomal (FOURNIER et al., 2012). A DNMT3A e a DNMT3B também recrutam as
HDACs para silenciar genes e são encontradas, estavelmente, associadas aos
nucleossomos com altos níveis de metilação do DNA (WU et al., 2012).
Além disso, há participação das proteínas recrutadas na manutenção das marcas de
histona, como (FOURNIER et al., 2012):
• Ligação entre DNMTs, HP1 e histonas metiladas (Figura 5D); TOLLEFSBOL,
2004).
• Ligação entre proteína ligadora de metil UHRF1, H3K9me3 e metiltransferase
G9a.
Figura 5. Silenciamento gênico mediado por metilação de DNA, modificação de histonas e
recrutamento de proteínas: A) histonas metiladas ligam-se a proteínas de ligação de
histonas (HBPs), que recrutam metiltransferases de DNA (DNMTs), as quais promovem
metilação do DNA (pirulitos alaranjados); B) DNA metilado recruta proteínas de ligação de
metil (MBPs), que se associam a complexos de desacetilases de histonas (HDACs), os
quais removem a acetilação de resíduos de lisina (K), e de metilases de histonas (HMTs),
que promovem metilação de K; C) as DNMTs associam-se às HDACs, resultando em
desacetilação de histonas e em metilação do DNA; D) a proteína de heterocromatina (HP)
liga-se à histona metilada pelas HMTs e interage com as DNMTs, que promovem metilação
do DNA.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Considerações finais
As modificações pós-traducionais das histonas também afetam a acessibilidade da
cromatina e a expressão gênica. As modificações de histonas mais comuns são a
acetilação, marca ativa de transcrição, e a metilação, que pode promover ativação ou
silenciamento gênico, dependendo do resíduo de aminoácido modificado.
Há ação conjunta de diferentes tipos de modificações epigenéticas, e determinados
padrões de combinações epigenéticas levam a funções subsequentes específicas,
denominadas de estados de cromatina.
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Capítulo 4
Modificações epigenéticas III
RNAs não codificadores (ncRNAs)
Flavia Lombardi Lopes
Roberta Cordeiro Gaspar
Daniel Robert Arnold
Introdução
Nos últimos anos, os estudos na área de regulação epigenética vêm adicionando uma
nova dimensão ao entendimento dos processos de regulação da expressão gênica.
Epigenética é a regulação herdável da expressão gênica, durante a mitose e a meiose,
sem alteração na sequência do DNA (LEVENSON; SWEATT, 2005). A expressão é
controlada através da modificação física do DNA ou RNA, seja direta ou indiretamente
(proteínas, grupos metil), por fatores que se associam ao DNA/RNA.
Regulando o DNA e/ou o RNA, sem alterar a sequência deste, células geneticamente
idênticas (como as células dentro de um mesmo organismo) são capazes de ser
fenotipicamente distintas, dependendo de sua localização (por exemplo, células da pele
são distintas de células da medula óssea dentro de um mesmo organismo, apesar de
apresentarem o mesmo código genético) (LEVENSON; SWEATT, 2005). Além disso, o
controle epigenético é reversível, podendo ser em curto prazo (expressão de um gene
durante um período específico do desenvolvimento) ou em longo prazo (imprinting
presente no genoma materno ou paterno).
A programação epigenética dos gametas e embriões iniciais é condição vital para o
desenvolvimento de um novo organismo. Essa programação envolve a integração dos três
processos epigenéticos:
• Metilação do DNA.
• Remodelamento das histonas.
• Ação de RNA não codificadores.
Esses eventos epigenéticos regulam a expressão gênica pelo controle da transcrição
e/ou tradução.
Na última década, a visão de que a regulação da transcrição era comandada,
exclusivamente, por fatores de transcrição, ganhou uma repaginada. Até então, acreditava-
se que a porção do DNA que não era responsável por codificar proteínas,
surpreendentemente cerca de 98% do genoma humano (MATTICK, 2005), nada mais era
que junk (lixo), sem qualquer função biológica.
Outra ideia que foi derrubada na última década é a de que o genoma humano teria
aproximadamente 100 mil genes, ideia essa baseada na complexidade de seu organismo.
Entretanto, o advento das técnicas de sequenciamento global de DNA e RNA mostra que,
na realidade, o ser humano tem em torno de 20 mil genes codificadores de proteínas, o
que o aproxima do número de genes observado em organismos muito mais simples como,
por exemplo, o nematoide Caenorhabditis elegans. Além disso, ao se comparar o genoma
humano com o genoma de seu “parente” mais próximo, o chimpanzé, é possível notar que,
aproximadamente 30% das proteínas ortólogas, codificadas nas duas espécies, são
idênticas (WATANABE et al., 2004). Então, como explicar tamanha diferença entre
espécies com tanta semelhança em tamanho e sequências de genomas?
Recentemente, o que a comunidade científica mundial concluiu é que a informação
necessária para agregar complexidade aos organismos está em outro lugar, além dos
genes codificadores de proteínas. E esse outro lugar é exatamente dentro de uma classe
de RNAs chamada RNAs não codificadores ou ncRNAs (do inglês non-coding RNAs).
Estudos conduzidos na última década descrevem a presença e a importância dos
ncRNAs em organismos unicelulares, plantas ou organismos mais complexos como os
mamíferos. Os ncRNAs exercem as funções de reguladores de transcrição, splicing,
transporte, controle de estabilidade e tradução de mRNA, participando assim de processos
do desenvolvimento de organismos ou de tecidos, de mecanismos celulares, de processos
fisiológicos e da etiologia de doenças. Esses ncRNAs estão divididos em várias classes, de
acordo com tamanho, polaridade, maneira como são gerados e função. Neste capítulo,
relata-se com mais detalhes, as seguintes categorias:
• Long ncRNAs.
• Small ncRNAs, incluindo-se Piwi-interacting RNAs (piRNAs).
• Small interfering RNAs (siRNAs).
• MicroRNAs (miRNAs).
Tipos de ncRNAs
Os ncRNAs são um grupo emergente de moléculas que regulam justamente a
deposição das marcas epigenômicas (MATTICK et al., 2009). Até o momento, todosos
ncRNAs estudados agem por um mecanismo comum: associação com proteínas ligantes
do RNA que, por sua vez, fazem parte de um complexo modificador da cromatina. RNAs
não codificadores parecem direcionar esses complexos, ubiquitamente expressos de uma
maneira sequência-específica, às regiões da cromatina que serão modificadas. O melhor
exemplo de modificação na cromatina direcionada por RNA são o processo de interferência
por RNA, a inativação do cromossomo X e o imprinting (MORRIS, 2009), mas existem
fortes evidências indicando que moléculas de RNA participam em todos os aspectos de
regulação da estrutura da cromatina (MATTICK et al., 2009).
RNAs não codificadores são conhecidos há muito tempo, e apenas as classes que têm
função no controle da transcrição e/ou tradução gênica é que foram descobertas mais
recentemente. Entre os ncRNAs previamente conhecidos temos (WRIGHT; BRUFORD,
2011):
RNA de transferência ou transportador (tRNA) – Com aproximadamente 80
nucleotídeos, participa da tradução do mRNA para proteínas exercendo o papel de
transporte dos aminoácidos até os ribossomos, no momento da formação e do
alongamento da cadeia de peptídeos.
RNA ribossômico (rRNA) – O mais abundante dos RNAs exerce seu papel dentro
dos ribossomos, facilitando a interação entre o tRNA e o mRNA, durante o processo de
tradução.
RNA spliceosomal ou small nuclear RNA (snRNA) – Juntamente com uma série de
ribonucleoproteínas, formam os spliceossomos, responsáveis pelo processamento de pré-
mRNA (remoção de íntrons) em mRNA maduro.
Small nucleolar RNA (snoRNA) – São responsáveis por modificações pós-
transcricionais nos rRNAs, tRNAs e snRNAs.
A seguir, serão apresentados os ncRNAs que exercem papel regulatório na expressão
de genes, por meio do controle da transcrição e/ou tradução. Esses ncRNAs são
classificados em dois grupos, baseados, principalmente, no tamanho molecular:
• RNA não codificador longo (acima de 200 nucleotídeos).
• RNA não codificado curto (contendo de 18 a 22 nucleotídeos).
RNAs não codificadores longos (lncRNA; do inglês long noncoding
RNA)
A descoberta dessas sequências ocorreu pelo emprego das técnicas mais recentes de
sequenciamento global de transcritos, pelas quais se percebeu que o genoma de
eucariotos é altamente transcrito. Conforme relato anterior, apenas 2% do genoma
resultam em proteínas. Como revisado em Clark e Mattick (2011), viu-se que essa alta
quantidade de transcritos é formada pelas fitas senso e antisenso do genoma, ao redor de
genes codificadores de proteínas ou em sequências intrônicas desses genes, bem como
transcritas nas vastas regiões entre os genes, nas chamadas regiões intergênicas.
Apenas nas regiões intergênicas o número de lncRNAs até agora identificados já
passa dos milhares (GUTTMAN et al., 2009; KHALIL et al., 2009; MARQUES; PONTING,
2009; ØROM et al., 2010), intrigando cada vez mais os pesquisadores sobre as diversas
funções regulatórias desses RNAs, bem como mostrando a importância biológica dessa
classe de RNAs (CARNINCI et al., 2005; CHENG et al., 2005; CLARK; MATTICK, 2011;
ENCODE, 2007; HE et al., 2007, 2008; KAPRANOV et al., 2002; KATAYAMA et al., 2005;
OKAZAKI et al., 2002; STOLC et al., 2004; WILHELM et al., 2008). Os lncRNAs
apresentam tamanho de 200 nucleotídeos até superior a 100 kb (FURUNO et al., 2006;
LYLE et al., 2000), sendo primariamente transcritos pela RNA polimerase, como os mRNA.
Inúmeros papéis já foram identificados para membros da família dos lncRNAs numa
variedade de processos biológicos, como diferenciação celular (LOEWER et al., 2010;
MERCER et al., 2010; RAVASI et al., 2006), controle epigenético da inativação do
cromossomo X, um processo fundamental em animais, e o controle do imprinting
genômico.
A compensação de dosagem trata do silenciamento de uma das cópias do
cromossomo X em fêmeas, para garantir que machos e fêmeas tenham a mesma
contribuição transcricional a partir desse cromossomo. Esse processo de silenciamento
cromossomal, que será visto com maiores detalhes no Capítulo 7, envolve a participação
do lncRNA chamado Xist, do inglês, X-inactivation-specific transcript. Um lncRNA de
tamanho elevado (17 kb em murinos) é expresso a partir do cromossomo que será
silenciado, recobrindo este e recrutando enzimas modificadoras de histona e enzimas que
metilam o DNA, induzindo o silenciamento da fita em cis (BROCKDORFF et al., 1991;
BROWN et al., 1991).
Conforme será abordado no Capítulo 6, o processo de imprinting trata do
silenciamento de um alelo e da consequente expressão monoalélica (de origem materna ou
paterna) de um grupo de genes. Esses genes costumam formar grupos ou clusters no
genoma de uma grande variedade de espécies, e os três processos epigenéticos
conhecidos (metilação do DNA, remodelamento de histonas e RNAs não codificadores)
participam do controle desse intrigante e fundamental silenciamento alélico.
Alguns lncRNAs são transcritos dentro de regiões de imprinting ou imprinting centers
(IC) e alguns participam do controle do imprinting de outros genes dentro do mesmo
cluster gênico. Alguns exemplos de lncRNAs imprinted são o Kcnq1ot1 dentro do loco
KCNQ1 (THAKUR et al., 2004), Air do loco IGF2R (SLEUTELS et al., 2002) e o loco
H19/IGF2 (SCHOENFELDER et al., 2007). Kcnq1ot1, ou LIT1 em humanos, é um lncRNA
de aproximadamente 90 kb responsável pelo silenciamento de uma região em torno de 1
megabase do genoma (CLARK; MATTICK, 2011; PANDEY et al., 2008; THAKUR et al.,
2004).
O silenciamento envolve a participação dos outros dois processos epigenéticos,
metilação do DNA e remodelamento de histonas e cromatina da região através do
recrutamento de metiltransferase de DNA (DNMT1) (MOHAMMAD et al., 2010) e enzimas
e proteínas responsáveis por modificações repressivas nas histonas H3K9 e H3K27 como
metiltransferase de histona G9a e membros das famílias PRC1 e PRC2 (Ezh2 e
Suz12), de maneira muito similar ao silenciamento do X pelo lncRNA Xist (CLARK;
MATTICK, 2011; PANDEY et al., 2008; TERRANOVA et al., 2008). Já o H19 é um lncRNA
com função ainda não conhecida, mas supostamente relacionado ao controle do
crescimento. Esse lncRNA apresenta expressão monoalélica materna que, após splicing e
poliadenilação, é exportado para o citoplasma, onde se encontra em altos níveis
(BARTOLOMEI et al., 1991).
Para exercer uma variedade de funções biológicas, além do recrutamento de
modificadores de cromatina, como mencionado acima, os lncRNAs podem também
modular a expressão gênica pós-transcrição, durante processos como splicing e tradução
de RNAs (GONG; MAQUAT, 2011; KUNG et al., 2013; TRIPATHI et al., 2010; YOON et al.,
2012). Além de seu efeito sobre mRNA, os lncRNAs podem também interferir na função de
microRNAs.
RNAs não codificadores curtos
RNAs não codificadores curtos – do inglês small ncRNA – são originados a partir de
precursores longos. A seguir, três classes principais de ncRNAs curtos serão discutidas.
Essas três classes participam como moldes para que as proteínas Argonaute (AGO)
regulem seus genes-alvo:
Piwi-interacting RNAs (piRNAs) – Esses ncRNAs são os maiores dentro da classe
de small ncRNAs, apresentando tamanho em torno de 25 a 30 nucleotídeos. Eles também
diferem dos outros membros dessa classe em sua biogênese, a qual não envolve a enzima
Dicer (VAGIN et al., 2006). Os piRNAs parecem estar presentes apenas em células
germinativas ou em células somáticas em contato com células germinativas (ARAVIN et al.,
2007). Sua função nas células germinativas é a de proteger contra transposons,
promovendo o silenciamento destes (CASTEL; MARTIENSSEN, 2013; LIN, 2007).
Os piRNAs também são encontrados em clusters no genoma.
ncRNA de interferência (siRNA), do inglês small interfering RNA – Esses
pequenos ncRNAs derivam de RNAs de fita dupla precursores pela ação da enzima Dicer,
associam-se a proteínas AGO e iniciam o processo de interferência por RNA nos
transcritos-alvo.A fita dupla de RNA é formada por complementaridade de sequência e
ligação nela própria pela formação de hairpins ou estruturas internas do tipo stem-loop,
nas sequências chamadas inverted-repeats ou através de transposons.
Em mamíferos, o sistema imune nas células somáticas reconhece e destrói os
precursores de fita dupla, mas em oócitos murinos, vários siRNAs já foram identificados
(CHUNG et al., 2008; CZECH et al., 2008; GHILDIYAL et al., 2008; KAWAMURA et al.,
2008; OKAMURA et al., 2008a, 2008b; TAM et al., 2008; WATANABE et al., 2008),
indicando que se trata de um processo endógeno com função biológica nesse tipo celular,
sendo os transposons os maiores alvos do controle exercido por esses siRNAs endógenos,
mas com a participação de indução de metilação de DNA e modificação de cromatina
também (BROSNAN; VOINNET, 2009; SUH; BLELLOCH, 2011).
Por sua vez, siRNAs endógenos também foram reportados em células-tronco
embrionárias, além de oócitos (BABIARZ et al., 2008; TAM et al., 2008; WATANABE et al.,
2008). Os siRNAs participam do processo de maturação nuclear e do desenvolvimento
embrionário pré-implantacional (MA et al., 2010; SUH et al., 2010). O papel desses siRNAs
endógenos só é possível graças à ausência do sistema de resposta interferon nesses tipos
celulares (oócito e células-tronco embrionárias), que em células somáticas seria iniciado
pela presença do precursor dupla-fita (dsRNA), do inglês, double-strand RNA, como
mencionado anteriormente. Um estudo recente mostrou a presença de vários siRNAs
endógenos em células germinativas masculinas, de modo que esses ncRNAs curtos
também podem controlar o processo de esparmatogênese (SONG et al., 2011).
MicroRNAs (miRNA) – Essas moléculas curtas de RNA (em torno de 22 nucleotídeos)
que agem como reguladores pós-transcricionais, ligando-se complementarmente a mRNA-
alvos, normalmente resultando em repressão da tradução ou em degradação do alvo, e
consequentemente em silenciamento do gene-alvo (BARTEL, 2009).
Atualmente, existem mais de 600 miRNAs identificados em bovinos (miRBase3), e
estima-se ser muito maior o número total presente. Os primeiros miRNAs foram
identificados, pelo grupo do Dr. Victor Ambros em Caenorhabditis elegans, como uma
classe de RNAs não codificadores curtos, envolvidos na regulação da expressão de genes
(LEE et al., 1993). Esses miRNAs tendem a reprimir a tradução de mRNA-alvos, ao invés
de efetuar a clivagem direta do transcrito.
Em animais, a ação dos miRNAs controlando a tradução do transcriptoma regula
funções de importância fundamental em diversos processos biológicos, como:
• Desenvolvimento de organismos (celular, tecidual, organogênico).
• Regulação hormonal.
• Diversos processos da função celular.
• Adaptação a stress e ao meio ambiente.
• Participa da etiologia de algumas patologias como câncer (ver Capítulo 8).
Entre as classes de ncRNAs curtos, os miRNAs são os mais estudados. Eles
originam-se de precursores dupla fita, os pri-miRNAs, do inglês primary miRNA, que são
então processados em estruturas mais curtas contendo stem-loop (pre-miRNA) pela ação
da enzima Drosha. Os pri-miRNAs são codificados no genoma por regiões intergênicas,
intrônicas ou até mesmo codificadoras de mRNA. Seu modo de ação envolve pareamento
com as regiões 3’-UTR, do inglês 3’-untranslated regions, dos alvos, podendo a sequência
do miRNA ser totalmente ou mesmo parcialmente complementar a esse alvo, e
direcionamento dos complexos silenciadores ou complexo RISC, do inglês RNA-induced
silencing complex, (BARTEL, 2009). A ação do complexo RISC pode levar ao
silenciamento por sequestro do RNA ligado ao miRNA e à inibição da tradução, ou mesmo
ao aceleramento da destruição do mRNA, conforme já mencionado.
Os miRNAs encontram-se catalogados em inúmeras bases de dados como a miRBase
(KOZOMARA; GRIFFITHS-JONES, 2011), com informação sobre sua origem genômica e
acesso a sua sequência e ao seu alvo, quando conhecido.
Mecanismos de produção de ncRNA
Geralmente, a transcrição e o processamento de ncRNA (nas formas longa e curta)
são processos muito similares aos observados para RNAs codificadores de proteínas.
A quantidade de passos necessários no processamento dos transcritos não codificadores
dita a que classe – longa, média ou curta – o ncRNA pertence. Assim como RNA
codificador de proteína, a maioria dos ncRNAs são transcritos pela RNA polimerase
(RNAP) II. Alguns ncRNAs foram descritos na literatura como transcritos da RNAP III,
comumente associada o RNA ribossomal 5S, ao tRNA e a outros RNAs curtos. Os ncRNAs
originam-se a partir dos mais variados contextos genômicos:
Regiões gênicas (enhancers, promotores, 5’-UTR, íntrons, éxons e 3’-
UTR) e intergênicas
Assim como o mRNA, a maioria dos ncRNAs contém o 7-methylguanylate (m7G) cap
na extremidade 5’ e uma cauda poliadenilada no final 3’ (BERTONE et al., 2004; CHENG
et al., 2005; KAMPA et al., 2004; RINN et al., 2003;). Além disso, os transcritos para
ncRNA podem ter variantes de splicing. Todos esses fatores são típicos de transcrição
guiada por RNAP II (TSIRIGOS; RIGOUTSOS, 2008). Em relação aos ncRNAs longos,
existe pouco processamento após transcrição para torná-los funcionais. Já os ncRNAs
curtos requerem maior processamento.
miRNA
Os microRNAs passam por uma série de processos antes de atingir a maturidade na
forma de um complexo miRNA ativo (Figura 1). Esses ncRNAs iniciam sua jornada como
transcritos longos da RNAP II, os pri-miRNA, muitas vezes contendo milhares de
nucleotídeos e formando hairpins ou stem-loops. Esses hairpins são, então, reconhecidos
pelo complexo Drosha–DGCR8, também conhecido como complexo microprocessador.
Drosha é uma endonuclease similar à RNase III, que contém um sítio de ligação ou binding
domain para RNA dupla fita ou dsRNA (dsRBD), do inglês double-stranded RNA-binding
domain, e dois sítios RNase III (COOK; CONTI, 2006; KIM et al., 2009). Já a DGCR8
(DiGeorge syndrome critical region gene 8) é uma proteína ligante de RNA de
aproximadamente 120 kDa que reconhece a junção ssRNA-dsRNA (RNA fita simples – RNA
fita dupla) do substrato (DENLI et al., 2004; GREGORY et al., 2004; HAN et al., 2004,
2006; LANDTHALER et al., 2004). A DGCR8 direciona a enzima Drosha para a clivagem
na posição de 11 nucleotídeos a partir da junção do ssRNA.
Figura 1. Biogênese de RNAs não codificadores. RNAs não codificadores (ncRNAs) são transcritos pela RNA
polimerase II (Poll II). Os ncRNAs longos (lncRNA) agem via insulação do alvo (DNA) impedindo a transcrição
(A). Os microRNAs (miRNA) formam uma série de alças hairpin durante a transcrição, que são processadas
pelo complexo Drosha-DGCR8 para dar origem aos pré-miRNAs (B). Pré-miRNAs são exportados do núcleo
pela ação da Exportina 5/Ran-GTP (C). Uma vez no citoplasma, a Dicer cliva o pré-miRNA em miRNAs
maduros de 22 nt, que são associados à proteína Argonaute 2 (Ago2) (D). Essas proteínas formam o complexo
RISC (RNA-induced silencing complex). O processamento dos small-interfering RNAs (siRNA) começa com a
formação de um longo ssRNA contendo um hairpin em sua sequência (E). Esse longo hairpin é processado
pela enzima Dicer e inserido em Ago2, de maneira similar ao miRNA (F). Uma vez em Ago2, o miRNA ou
siRNA podem reconhecer a região 3’-UTR do mRNA alvo (G) e promover degradação (H) ou inibição da
tradução do mRNA alvo (I). Precursores de Piwi-interacting RNAs (piRNAs) (J) são processados pelas
proteínas Piwi (MIWI e MILI). A atividade de nuclease de MILI produz uma ponta 5’ que é reconhecida por MIWI2.
MIWI2 então produz uma ponta 5’ que é reconhecida por MILI (K). Esse processo circular (ciclo ping-pong)
permite a produção contínua de piRNAs. MIWI2 é transportada de volta ao núcleo (L).
Ilustração: Daniel Robert Arnold.
O produto de 70 nucleotídeos, agora chamado de pré-miRNA, contém uma sequência
de fita dupla complementar com um stem-loop de um lado e com ssRNA do outro.O fato
de que Drosha e RNA pol II estão ligadas ao DNA próximo aos pré-miRNA hairpins
(MORLANDO et al., 2008) – associado com a observação de que pré-miRNAs são
gerados de sequências intrônicas pelo microprocessador antes do splicing dos éxons
(KIM; KIM, 2007) – sugere que o processamento do pri-miRNA ocorre durante a
transcrição. A partir de sua produção pelo complexo microprocessador, o pré-miRNA é
então transportado pelas enzimas Exportina-5 e Ran-GTP para o citoplasma (BOHNSACK
et al., 2004; LUND et al., 2004; YI et al., 2003, 2005). 
Dicer e o complexo de silenciamento induzido por RNA
A expressão complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) vem do inglês RNA-
induced silencing complex. Uma vez no citoplasma, Dicer, que é outra riboendonuclease,
cliva o pré-miRNA, para dar origem ao miRNA maduro, com sua fita dupla de
aproximadamente 22 nucleotídeos. Esse duplex é designado como miRNA/miRNA*, no qual
miRNA representa a fita antissenso, ou fita-guia, e miRNA* representa a fita senso ou
“passageira”. Apenas a fita-guia é incorporada ao complexo miRISC, para exercer a
função biológica, enquanto a fita passageira é eliminada e degradada (HAMMOND et al.,
2000).
Dicer é uma enzima RNase III citoplasmática, altamente conservada, de
aproximadamente 200 kDa. Ela contém um sítio ou domínio helicase, um sítio PAZ (Piwi-
Argonaute-Zwille), um sítio dsRBD (dsRNA-binding domain) e duas subunidades RNase III
(COOK; CONTI, 2006; KIM et al., 2009). Mais de uma forma de Dicer foram identificadas
em algumas espécies. No entanto, mamíferos apresentam uma única forma, a Dicer 1.
A Dicer associa-se in vivo com PACT (protein activator of the interferon-induced
protein kinase) e TRBP (transactivation-response element RNA-binding protein), para
facilitar a maturação do miRNA. Essas proteínas associadas não são necessárias para a
ação da Dicer in vitro. Entretanto, essas proteínas associadas a Dicer são importantes
para a separar as fitas duplas de miRNA e para posicionar a fita-guia no complexo RISC
(CHENDRIMADA et al., 2005; GREGORY et al., 2005; HAASE et al., 2005; SINGH et al.,
2008).
A forma madura do miRNA de 22 nucleotídeos é então colocada numa proteína Ago
(Argonaute) do complexo RISC. A fita-guia permanece em Ago como um miRNA maduro, e
a fita passageira (miRNA*) é degradada por Ago. As proteínas Ago têm importância
fundamental no silenciamento promovido por miRNAs. A Ago2 é uma de quatro proteínas
Ago (Ago1 a Ago4) em mamíferos (CARMELL et al., 2002), mas é a única com atividade
de clivagem, essencial ao desenvolvimento de um organismo (LIU et al., 2004; MEISTER
et al., 2004; MORITA et al., 2007; RAND et al., 2004).
O complexo RISC, associado à fita-guia (miRNA), passa a se chamar miRISC e é
funcionalmente ativo, podendo se ligar ao mRNA, impedindo sua tradução ou até mesmo
degradando-o.
siRNA
Precursores de siRNA endógenos são produzidos de três maneiras (CHUNG et al.,
2008; CZECH et al., 2008; GHILDIYAL et al., 2008; KAWAMURA et al., 2008; TAM et al.,
2008; WATANABE et al., 2008):
• Pares senso/antissenso derivados de transposons, como o principal mecanismo.
• Transcrição convergente de genes codificadores de proteínas ou de regiões não
anotadas do genoma.
• Fitas simples, mas autocomplementares, formando uma longa estrutura contendo
stem-loop.
Por sua vez, precursores dupla-fita (dsRNAs) tendem a apresentar
complementaridade imperfeita, formando pequenas alças nas regiões não
complementares.
A maneira como essas estruturas são exportadas para fora do núcleo é um processo
ainda desconhecido. Sabe-se que Dicer é necessária para a produção de siRNA
endógenos em mamíferos. Uma vez no citoplasma, a Dicer cliva o precursor e posiciona o
siRNA na proteína Ago2 do complexo RISC, de maneira bem similar ao observado nos
miRNAs.
piRNA
Os precursores de fita simples dos piwi-interacting RNAs (piRNAs) são transcritos de
regiões intergênicas como regiões repetitivas, transposons ou clusters de piRNAs. Ao
contrário dos miRNAs e dos siRNAs, piRNAs são produzidos sem a ação de Dicer.
Entretanto, piRNAs associam-se com proteínas da subfamília Piwi que apresentam
atividade de nuclease e estão envolvidas na biogênese de piRNAs. Esse processo envolve
mecanismos primários e secundários. Ele ocorre no citoplasma, mas não se sabe como os
precursores chegam até lá.
Até o momento, fatores de processamento primário e colocação de piRNAs nas
proteínas PIWI (MIWI e MILI) são desconhecidos; já no processamento secundário, MILI
introduz a clivagem ao precursor, definindo assim a ponta 5’, que é então reconhecida e
aceita pela proteína MIWI2 (ARAVIN et al., 2008). Por sua vez, MIWI2 cliva o precursor da
fita de sentido contrário, criando o sítio de ligação para MILI. A nuclease que cria a parte
3’ ainda é desconhecida. Esse processo circular, conhecido como ciclo pingue-pongue,
pode ocorrer continuamente, aumentando assim a população de piRNAs (BRENNECKE
et al., 2007; GUNAWARDANE et al., 2007).
Papel dos ncRNAs nos processos reprodutivos
Gameta feminino
A importância de ncRNAs curtos nas fêmeas é evidenciada por uma série de estudos
mostrando que a perda das enzimas responsáveis pela formação de ncRNAs, em murinos,
resulta em falhas reprodutivas. Perda das enzimas Dicer e Ago2 em oócitos leva a uma
parada meiótica e a defeitos na formação dos fusos e consequente falha na segregação
cromossomal (KANEDA et al., 2009; MURCHISON et al., 2007; SUH et al., 2010; SUH;
BLELLOCH, 2011; TANG et al., 2007). Acredita-se que essa perda da enzima Dicer cause
o fenótipo com resultado da perda da produção e da função dos siRNAs endógenos, uma
vez que os miRNAs, apesar de também serem produzidos pela Dicer, necessitam também
da ação da enzima DGCR8, e a perda dessa enzima em oócitos não resulta em alteração
qualquer de fenótipo em relação a animais wild-type ou controle (SUH et al., 2010).
Assim como miRNAs, a terceira classe de ncRNAs curtos, os piRNAs, também são
encontrados em oócitos, mas sua função não parece ser essencial, uma vez que uma
deleção das proteínas PIWI, às quais esses RNAs se associam para exercer sua função,
não resulta em alteração nos oócitos (CARMELL et al., 2007; COOK; BLELLOCH, 2013;
DENG; LIN, 2002; KURAMOCHI-MIYAGAWA et al., 2004).
Gameta masculino
Deleção das proteínas PIWI, mais especificamente MILI, MIWI e MIWI-2 (mammalian
Piwi homologs), acarreta parada meiótica em diferentes estádios do ciclo meiótico,
ativação de retrotransposons e até mesmo esterilidade, sugerindo uma função importante
dos piRNAs durante o processo de espermatogênese (ARAVIN et al., 2007; CARMELL
et al., 2007; CASTEL; MARTIENSSEN, 2013; COOK; BLELLOCH, 2013; DENG; LIN,
2002; KURAMOCHI-MIYAGAWA et al., 2004, 2008; LIN, 2007).
Já a perda de Dicer em células germinativas primordiais masculinas leva a inúmeros
defeitos na espermatogênese, na proliferação de células, bem como na própria morfologia
e na motilidade (COOK; BLELLOCH, 2013; HAYASHI et al., 2008; MAATOUK et al., 2008).
Já a deleção de Drosha, que participa apenas da biogênese de miRNAs em
espermatócitos, leva à perda de tipos celulares como espermátides e até mesmo
esterilidade (azoospermia) (WU et al., 2012), indicando que miRNAs apresentam função
importante no desenvolvimento do gameta masculino.
Embriões
Os ncRNAs curtos são fundamentais no desenvolvimento embrionário e fetal. Deleção
da riboendonuclease Dicer é letal em camundongos, com morte embrionária aos 7,5 dias
de gestação (BERNSTEIN et al., 2003). Estudos recentes indicam que, de fato, os miRNAs
têm funções regulatórias vitais durante o desenvolvimento embrionário. Mineno et al.
(2006) demonstraram a presença de 390 miRNAs em embriões e em fetos murinos de 9,5
a 11,5 dias da gestação, bem como expressão temporal diferenciada.
Além disso, a proteína Ago2, envolvida na formação do complexo RISC de ação dos
miRNAs, é fundamental no desenvolvimentono momento de ativação do genoma
embrionário. Nesse período, são destruídos os produtos remanescentes derivados da
transcrição de genes maternos ou oocitários. Isso sugere que o processo epigenético –
mediado pela interferência de miRNAs – deve participar de maneira importante nessa
destruição (LYKKE-ANDERSEN et al., 2008).
Durante o estádio de mórula, miRNAs parecem estar envolvidos em adesão celular,
enquanto no estágio de blastocisto, eles devem ter importância na diferenciação celular,
podendo estar associados com a manutenção da pluripotência (YANG et al., 2008). De
fato, estima-se que existam em torno de 110 mil transcritos totais de miRNAs em células-
tronco embrionárias de murinos (CALABRESE et al., 2007).
Conforme mencionado anteriormente, miRNAs podem se ligar, imperfeitamente, a
seus genes-alvo, o que dificulta a identificação destes. Entretanto, muitos genes já tiveram
seu papel identificado como sendo importantes na regulação de genes específicos da
massa celular interna (MCI), tanto em células-tronco embrionárias de camundongos quanto
em células de humanos. Por exemplo, miR-134 e miR470 controlam SOX2 e OCT4,
respectivamente, e miR-296 e miR470 regulam a expressão de NANOG (TAY et al., 2008).
Em células-tronco embrionárias de humanos, miR-145 também reprime a expressão de
OCT4, SOX2 e KLF4 (XU et al., 2009). Todos esses miRNAs regulam, negativamente,
fatores de pluripotência, indicando que podem estar envolvidos na indução da formação de
células trofoblásticas, bem como na diferenciação de células da MCI em outros tipos
celulares.
Um gene alvo do miR-290, específico de células-tronco embrionárias, já foi
identificado. Essa família de miRNAs reprime o gene RBL2, que por sua vez age
reprimindo a expressão da metiltransferase de DNA DNMT3, responsável pela metilação
de novo em células embrionárias e germinativas. Assim, a perda dessa família de miRNAs
eleva a expressão de RBL2, que por sua vez reduz DNMT3, levando à hipometilação em
células-tronco (BENETTI et al., 2008; SINKKONEN et al., 2008). Até o momento, apesar
de um pequeno grupo de miRNAs ter sido identificado em células trofoblásticas, nenhum
alvo foi identificado nesses miRNAs. A identificação de mais miRNAs, bem como alvos para
eles, contribuirá para que se entenda o papel desse processo epigenético na segregação
das células totipotentes embrionárias em massa celular interna e trofoblasto.
Recentemente, foram publicados alguns estudos sobre miRNAs em bovinos. Abd El
Naby et al. (2013) relataram diminuição dramática em seis miRNAs, altamente expressos
em oócitos, durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, esses miRNAs seguem
um padrão similar de degradação dos demais transcritos maternos, sugerindo que eles
sejam parte ativa do processo de degradação dos transcritos maternos que ocorre durante
a ativação do genoma embrionário. Em estudos envolvendo embriões produzidos por
transferência nuclear em bovinos, Castro et al. (2010) mostraram que, em embriões que
sobreviveram ao 17º dia da gestação, 14 de 56 miRNA avaliados estavam alterados
quando comparados com embriões produzidos por fertilização in vitro.
Placenta
MicroRNAs já foram descritos associados aos mais diversos eventos reprodutivos,
incluindo processos de modulação uterina como a implantação (CHAKRABARTY et al.,
2007; PAN; CHEGINI, 2008). Um estudo muito interessante, conduzido em 2007,
demonstrou um perfil específico de tecido para a expressão de miRNAs, incluindo um perfil
placentário (LIANG et al., 2007), com um número importante de genes trofoblástico-
específicos (DONKER et al., 2012; MORALES-PRIETO et al., 2012).
Outros estudos também identificaram que a placenta apresenta inúmeros miRNAs
agrupados em três clusters em humanos, nos seguintes locos (LIANG et al., 2007; MIURA
et al., 2010; MORALES-PRIETO et al., 2012; MORALES-PRIETO; MARKERT, 2011),
apresentando expressão temporal e diferenciada em pacientes com parto prematuro
(MAYOR-LYNN et al., 2011):
• Cromossomo 14 (14q32).
• Cromossomo 19 (19q13.41).
• Cluster denominado miR-371-3.
É importante ressaltar que esses clusters encontram-se em regiões imprinted do
genoma, ou seja, de controle e expressão monoalélica (BORTOLIN-CAVAILLE et al., 2009;
SEITZ et al., 2004).
Tecidos somáticos reprodutivos
Além do fenótipo causado em células germinativas, a deleção de Dicer1 em tecidos
somáticos reprodutivos também causa falhas consideráveis em suas funções.
Em camundongos, deleção dessa enzima em células da granulosa nos ovários provoca
(GONZALEZ; BEHRINGER, 2009; LEI et al., 2010):
• Aumento no número de folículos primordiais.
• Recrutamento acelerado de folículos.
• Maior número de folículos degenerados.
• Oócitos anormais.
• Infertilidade.
Por sua vez, ausência de Dicer1 em células mesenquimais do oviduto também causa
defeito no transporte de embriões (GONZALEZ; BEHRINGER, 2009), possivelmente por
falhas na formação da camada muscular lisa nessas estruturas.
Esse modelo transgênico condicional também apresenta defeitos na junção tubo-
uterina. Além disso, também foram encontradas anormalidades no útero dessas fêmeas
mutantes para Dicer, como redução no número de glândulas endometriais, importantes
para secreção de hormônios fundamentais no estabelecimento e na manutenção da
gestação, bem como para o transporte de nutrientes (GONZALEZ; BEHRINGER, 2009;
LUENSE et al., 2009).
Em machos murinos, a deleção da Dicer1 em células de Sértoli resulta em severos
defeitos na espermatogênese e eventual degeneração testicular após o nascimento,
seguida por enorme alteração na expressão gênica no tecido testicular (PAPAIOANNOU
et al., 2009, 2011), que por sua vez pode ter causado alteração na sinalização hormonal,
controlada pelas células de Sértoli, e de fundamental importância na espermatogênese.
Considerações finais
Conforme abordado neste capítulo, a descoberta de transcritos não codificadores
(curtos e longos) adicionou um novo nível de complexidade aos processos de controle da
transcrição e da tradução do RNA mensageiro. Isso também faz entender a importância
das vastas sequências genômicas não codificadoras de proteínas, previamente vistas
como não funcionais. A expressão temporal e específica de tecido posiciona os ncRNAs
como figuras importantes no entendimento dos padrões de expressão gênica, função e
fenótipo tão diferenciados entre tipos celulares de órgãos distintos, descrevendo assim
importante papel desses RNAs no controle epigenético do desenvolvimento, da
manutenção e da função dos organismos.
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Capítulo 5
Técnicas moleculares para detectar e avaliar
modificações epigenéticas
Simone Cristina Méo Niciura
Marina Ibelli Pereira Rocha
Suelen Scarpa de Mello
Introdução
O objetivo do estudo da epigenética é a identificação dos locais e da natureza das
modificações que ocorrem ao longo do genoma (FAZZARI; GREALLY, 2004). Assim,
dependendo da modificação, dos equipamentos disponíveis e do interesse do estudo,
diferentes técnicas podem ser utilizadas para detectar e avaliar modificações epigenéticas.
Entre as técnicas disponíveis, as mais utilizadas para avaliação das modificações de
histonas são: imunofluorescência indireta (IF) e imunoprecipitação de cromatina (ChIP);
para metilação de DNA: digestão com endonuclease de restrição sensível à metilação,
tratamento do DNA com bissulfito de sódio e imunoprecipitação de cromatina metilada
(MeDIP); para conformação de cromatina e do posicionamento de nucleossomos: digestão
com endonuclease micrococal, análise de hipersensibilidade à DNaseI e captura de
conformação de cromossomo (3C) e suas variações.
Técnicas moleculares para identificar modificações de
histonas
Imunofluorescência indireta (IF)
A imunofluorescência indireta (IF) baseia-se na utilização de um anticorpo primário
direcionado contra uma modificação de histona específica seguida pela incubação com um
anticorpo secundário conjugado a um fluorocromo. A imunocoloração permite identificar o
padrão global de modificações de histonas, por meio da intensidade e da distribuição da
fluorescência, em células em cultivo, embriões e gametas (LI et al., 2012; SARMENTO
et al., 2004) e, assim, acompanhar as modificações de histonas ao longo do cultivo, da
diferenciação celular e do desenvolvimento.Em células, a fluorescência pode ser
detectada tanto por microscopia óptica, como por citometria de fluxo. A técnica de IF
também já foi utilizada em cromossomos em metáfase para distinguir as modificações de
histonas ao longo dos cromossomos em células individuais (TERRENOIRE et al., 2010).
Imunoprecipitação de cromatina (ChIP)
A imunoprecipitação de cromatina (ChIP), ferramenta poderosa para o estudo das
interações proteína-DNA, proteína-proteína e proteína-RNA, é amplamente utilizada na
investigação de proteínas associadas à cromatina, como as histonas e os fatores de
transcrição (YAN et al., 2004), e é a técnica mais utilizada para estudar as modificações de
histonas (HARING et al., 2007).
A ChIP é realizada por meio da incubação da cromatina fracionada com um anticorpo
direcionado contra uma modificação de histona de interesse (UMLAUF et al., 2004), que
permite determinar se essa histona se liga a uma sequência específica do DNA in vivo
(Figura 1). Resumidamente, as etapas da ChIP consistem de extração do DNA de células
ou tecidos, fracionamento da cromatina, precipitação do DNA com anticorpo específico,
captura com beads de proteínas A/G, extração do DNA precipitado e avaliação.
Figura 1. Imunoprecipitação de cromatina (ChIP): isolamento do DNA; fracionamento do DNA genômico;
incubação com anticorpo específico para modificação de histona; recuperação e purificação do DNA
imunoprecipitado.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Duas abordagens podem ser utilizadas para preparar a cromatina para a ChIP:
digestão do DNA com a nuclease micrococal (MNase) para obter a cromatina nativa
(nChIP) ou exposição das células ao formaldeído ou à luz UV e posterior fragmentação por
sonicação, que consiste na quebra do DNA por aplicação de ultrassom, para uso de
cromatina crosslinked (xChIP) (YAN et al., 2004). A xChIP permite avaliar proteínas que se
ligam ao DNA com baixa afinidade, como a maioria das proteínas não-histônicas, enquanto
a nChIP é utilizada no estudo de proteínas que se ligam ao DNA com alta afinidade, sendo
mais adequada para a análise de modificações de histonas centrais como acetilação e
metilação (TOLLEFSBOL, 2004).
Na xChIP, o formaldeído promove a ligação cruzada entre proteína-DNA por meio da
interação entre os grupos amino e imino de lisina, arginina e histidina e as bases do DNA.
A estrutura da cromatina é preservada, e a ligação pode ser revertida em condições
brandas. Após a fixação com formaldeído, a cromatina é fragmentada e solubilizada por
sonicação e, então, precipitada com os anticorpos seletivos. Em seguida, o crosslink é
revertido, e o DNA imunoprecipitado é avaliado (YAN et al., 2004).
Na nChIP, a cromatina liberada do núcleo por digestão com MNase, que cliva
preferencialmente o DNA de ligação entre os nucleossomos, é selecionada quanto à
presença de mono e dinucleossomos, o que permite que uma modificação em determinado
gene ou loco seja mapeada com maior resolução que na xChIP.
Para os estudos de acetilação de histonas, é necessária a adição de butirato de sódio
nos tampões para inibir as enzimas desacetilases de histonas (THORNE et al., 2004).
Outra vantagem do uso da nChIP é que os epítopos reconhecidos pelos anticorpos
permanecem intactos durante a preparação da cromatina, o que assegura maiores níveis
de precipitação que a xChIP (UMLAUF et al., 2004).
Após a ChIP, o DNA precipitado e extraído pode ser avaliado por diferentes técnicas
(HARING et al., 2007; KIM; PARK, 2011; LIEB et al., 2006; TOLLEFSBOL, 2004), como:
qPCR (ChIP-qPCR) – Permite a quantificação rápida e acurada da proteína ligada a
uma região específica do DNA (UMLAUF et al., 2004). Além da reação em cadeia da
polimerase quantitativa (qPCR), é possível avaliar o DNA precipitado por PCR duplex
(coamplificação do gene-alvo e de um gene controle), que permite determinar níveis
relativos de uma modificação específica de histona ao longo dos domínios cromossômicos
(UMLAUF et al., 2004).
Hibridização em microarranjo (ChIP-on-chip ou ChIP-chip) – Primeira técnica
utilizada para mapear as interações DNA-proteína in vivo em escala genômica. Combina a
imunoprecipitação de cromatina e os microarranjos de DNA para identificar os sítios de
ligação da proteína de interesse aos fragmentos de DNA (KIM; PARK, 2011; LIEB et al.,
2006). Para tanto, o DNA imunoprecipitado e o DNA referência são “etiquetados” com
corantes fluorescentes diferentes e hibridizados em microarranjos de DNA, que contêm
milhares de sondas. Além disso, os sítios de ligação são identificados pela intensidade da
fluorescência em cada sonda do microarranjo (BUCK; LIEB, 2004; GILCHRIST et al.,
2009).
Sequenciamento – De nova geração (ChIP-seq) ou paired end tag (ChIP-PET), que
visam à avaliação global da interação proteína-DNA.
No ChIP-seq, primeiramente é feita a imunoprecipitação de cromatina que irá gerar
uma biblioteca de fragmentos que possuem a interação DNA-proteína de interesse. Em
seguida, esses fragmentos são submetidos a uma seleção por tamanho (de 150 a 300
pares de bases ou bp) e posteriormente sequenciados e alinhados no genoma (FARNHAM,
2009; KIM; PARK, 2011). Para isso, usam-se as tecnologias de sequenciamento em larga
escala por síntese (Illumina e Helicos), pirossequenciamento (454 Life Sciences) ou
sequenciamento por ligação (Applied Biosystems, Foster City, CA) para produzir centenas
de milhões de pequenas reads. Em relação ao ChIP-chip, o ChIP-seq apresenta maior
resolução e menos artefatos (MARDIS, 2007; PARK, 2009).
O ChIP-PET explora a eficiência de sequenciamento de sequências curtas para
aumentar o conteúdo de informação e a acurácia de mapeamento. Essa técnica consiste
na estratégia de extrair uma assinatura de 36 bp (18 bp da extremidade 3’ e 18 bp da
extremidade 5’) de cada fragmento de DNA obtido na ChIP, que, após serem
concatenados, são mapeados à sequência genômica (WEI et al., 2006).
Espectrometria de massas – É uma ferramenta útil para o mapeamento detalhado
de combinações de modificações de histonas, cujos resultados não sofrem influência da
afinidade de ligação dos anticorpos, como ocorre na ChIP (BONETTA, 2008). Para tanto,
histonas ou peptídeos da cauda N-terminal têm que estar intactos para serem analisados,
geralmente, em espectrômetros de massa híbridos (com dois tipos de analisadores num só
instrumento) (BONETTA, 2008), como LC-MS; LC-MS/MS (CHU et al., 2011; JUFVAS
et al., 2011).
A espectrometria de massas também é utilizada para identificar a metilação do DNA
após tratamento com bissulfito de sódio (SCHATZ et al., 2004).
Técnicas moleculares para identificar a metilação do DNA
Endonuclease de restrição sensível à metilação
As primeiras técnicas utilizadas para a detecção de 5-metil-citosina (5mC) basearam-
se na sensibilidade das enzimas de restrição à metilação localizada nos seus sítios de
clivagem (WU et al., 2012). Geralmente essas endonucleases falham em cortar o DNA se
um resíduo de citosina estiver metilado no sítio de reconhecimento da enzima. Assim, os
isoquisômeros (enzimas isoladas de diferentes microrganismos que reconhecem o mesmo
sítio de clivagem) com diferente sensibilidade à metilação, como CfoI, HpaII, MaeII, MluI,
MspI, NotI e XhoI, são frequentemente utilizados para determinar a metilação do DNA.
Para avaliar a metilação, três tipos de comparações podem ser feitas: entre amostras
tratadas com uma ou mais enzimas e uma amostra controle – sem tratamento; entre uma
amostra tratada com uma enzima sensível à metilação comparada com uma amostra
controle tratada com um isoquisômero não sensível à metilação; ou entre duas amostras
testes, como por exemplo, dois tecidos diferentes, ambos tratados com a mesma enzima
(ZILBERMAN; HENIFOFF, 2007).
O uso de endonuclease de restrição sensível à metilação fornece informações a
respeito da ocorrência relativa e da abundância de 5mC no genoma (LIU et al., 2004).
Entretanto, como a sequênciade reconhecimento para as enzimas de restrição ocorre de
maneira pouco frequente, menos de 5% das citosinas metiladas podem ser avaliadas numa
dada sequência do DNA (TOLLEFSBOL, 2004). Além disso, a técnica requer grandes
quantidades de DNA e não permite detectar hemimetilação (LIU et al., 2004).
Após a digestão com enzima de restrição sensível metilação, a avaliação do DNA
digerido pode ser feita por meio de diversas técnicas (JACINTO et al., 2008; HUA et al.,
2011; MELNIKOV et al., 2005):
PCR sensível à metilação – O DNA submetido à digestão com enzima de restrição
sensível à metilação (cliva sítio não metilado) é amplificado por PCR, utilizando-se primers
flanqueadores ao sítio de restrição, e comparado, após eletroforese, ao produto de PCR
do DNA não digerido (Figura 2). A diminuição da intensidade ou o desaparecimento da
banda no produto de PCR do DNA digerido indicam redução ou perda de metilação num
determinado fragmento do DNA (XUE et al., 2002).
Figura 2. PCR sensível à metilação: após PCR de DNA não digerido (-) ou digerido com endonuclease de
restrição sensível à metilação (+), eletroforese permite identificar fragmentos: 1) metilados (banda em - e +), 2)
desmetilados (banda em -) ou 3) hipometilados (banda normal em - e banda mais fraca em +).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Varredura genômica de marcos de restrição (RLGS) – Do inglês restriction
landmark genomic scanning, consiste em submeter à marcação o DNA digerido com uma
endonuclease de restrição sensível à metilação e depois à digestão com uma
endonuclease de restrição, seguida por eletroforese, por outra digestão com endonuclease
de restrição e por nova eletroforese (bidimensional) (KAWAI et al., 1994), Figura 3. Após
eletroforese, é observado o aparecimento ou o desaparecimento de spots e também a
intensidade dos spots, o que reflete o número de cópias e o estado de metilação de um
fragmento do DNA (HO; TANG, 2007).
 
Figura 3. Varredura genômica de marcos de restrição (RLGS): primeira digestão com
endonuclease de restrição sensível à metilação, que não cliva sítio metilado (mS), seguida
por marcação; duas digestões com endonucleases de restrição, cada uma delas seguida
por eletroforese em diferentes dimensões (1D e 2D). A intensidade do spot reflete o número
de cópias e o estado de metilação.
Fonte: modificado de Ho e Tang (2007).
Amplificação de sítios intermetilados (AIMS) – Do inglês amplification of
intermethylated sites, é usada para traçar o perfil de metilação por meio de diferentes
cortes de isoquisômeros de endonucleases de restrição sensíveis à metilação (Figura 4):
primeiro com uma enzima que deixa as extremidades cegas, e depois com uma enzima que
deixa as extremidades coesivas. A seguir, o DNA digerido é ligado a adaptadores,
purificado e amplificado por PCR com primers específicos para os adaptadores e
submetido à eletroforese (FRIGOLA et al., 2002; SADIKOV et al., 2004). O aumento da
intensidade de uma banda de AIMS reflete a hipermetilação dos sítios de reconhecimento
da enzima de restrição na sequência original, enquanto a diminuição de intensidade indica
hipometilação (SAMUELSSON et al., 2010).
Figura 4. Amplificação de sítios intermetilados (AIMS). Primeira digestão com endonuclease de restrição
sensível à metilação, que reconhece sítios específicos (S), mas não cliva sítios metilados (mS), e deixa
extremidades cegas; segunda digestão com isoquisômeros de endonuclease de restrição não sensível à
metilação que deixa extremidades coesivas para a ligação de adaptadores; amplificação por PCR e
eletroforese para identificação do nível de metilação.
Fonte: modificado de Samuelsson et al. (2010).
Hibridização de metilação diferencial (DMH) – Do inglês differential methylation
hybridization. O DNA genômico é tratado com enzima de restrição de corte frequente,
levando à obtenção de fragmentos pequenos que são destinados à PCR ou à digestão
com uma endonuclease de restrição sensível à metilação, seguida por PCR. Em seguida,
os produtos de ambas as amplificações são hibridizados em membrana ou em
microarranjos de ilhas CpG para observação do padrão de metilação (HUANG et al., 1999;
YAN et al., 2009). Uma variação da técnica de DMH, chamada de análise integrada de
metilação por isoquisômeros baseada em microarranjo (MIAMI; do inglês microarray-
based integrated analysis of methylation by isoschizomers), consiste no uso de
microarranjo com oligonucleotídeos derivados da região promotora gênica (ao invés de
ilhas CpG). Além disso, para eliminar falsos positivos decorrentes de polimorfismos em
sítios de restrição ou incompleta digestão do DNA, a técnica utiliza isoquisômeros para a
digestão do DNA, ou seja, de uma enzima sensível à metilação e de outra insensível à
metilação que reconhecem o mesmo sítio de clivagem (HATADA et al., 2006).
Amplificação de polimorfismo de comprimento de frag​mento sensível à
metilação (MSAP ou MS-AFLP) – Do inglês methylation-sensitive amplification fragment
length polymorphism, modificação da técnica de AFLP (do inglês, amplification fragment
length polymorphism), na qual a enzima de restrição é substituída por um par de
isoquisômeros de endonucleases de restrição com diferentes sensibilidades à metilação
(XIONG et al., 1999). Após amplificação e eletroforese em gel desnaturante, permite a
detecção simultânea de hipermetilação e hipometilação no genoma, além da comparação
entre múltiplas amostras (YAMAMOTO et al., 2001).
Tratamento do DNA com bissulfito de sódio
O tratamento do DNA com bissulfito de sódio (NaHSO3) permite a distinção entre a 5-
metil-citosina (5mC) e a citosina não-metilada (C), pois converte as C em uracilas (U).
Na amplificação por PCR, os resíduos de uracila são convertidos em timina (T), enquanto
os resíduos de 5mC permanecem como citosinas (C) (Figura 5) (POGRIBNY et al., 1995).
Assim, a conversão por bissulfito fornece uma visão geral das citosinas metiladas e um
perfil de metilação para uma sequência definida de DNA e pode ser utilizada até mesmo a
partir de pequenas quantidades de DNA.
Figura 5. Tratamento de DNA com bissulfito de sódio converte as citosinas não metiladas (C) em uracilas (U)
(ou timinas (T) após PCR), enquanto as citosinas metiladas (círculo alaranjado) permanecem como citosinas
(C). Em alaranjado, diferenças de bases entre fragmentos de DNA metilado e não metilado, após
sequenciamento.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
As etapas da transformação por bissulfito são: sulfonação do resíduo de citosina;
desaminação hidrolítica para produzir a uracila sulfonada; e dessulfonação sob condições
alcalinas (Figura 6) (LIU et al., 2004; PATTERSON et al., 2011). Para o sucesso da
técnica, é necessário que ocorra conversão total das citosinas não metiladas em uracilas
e, para isso, é preciso prestar atenção às temperaturas e aos tempos de incubação para
garantir a preservação da integridade do DNA (FRAGA; ESTELLER, 2002), além de
cuidado na utilização do bissulfito, que pode oxidar facilmente em contato com o ar e
produzir radicais livres que quebram a fita de DNA (HAYATSU, 2008).
Figura 6. Etapas de transformação de citosina em uracila por bissulfito.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
As estratégias adotadas para avaliar o DNA tratado por bissulfito são:
Sequenciamento do tipo Sanger ou sequenciamento bissulfito – É o
sequenciamento em que cada 5mC aparece como citosina e cada uracila, que
originalmente era uma citosina não metilada, como timina (Figura 7). Pode-se fazer o
sequenciamento direto do produto de PCR, para gerar o estado médio de metilação de
resíduos de citosina em fitas múltiplas do DNA, ou o produto de PCR pode ser clonado e
então sequenciado para analisar uma molécula individual específica (LIU et al., 2004).
Entretanto, resultados prévios obtidos em nosso laboratório mostraram a dificuldade
do sequenciamento direto, por causa da perda da complementaridade entreas fitas de
DNA, o que leva à produção de fragmentos de sequências diferentes após amplificação
por PCR e inespecificidade de leitura no sequenciamento (Figura 7). Essa perda de
complementaridade entre as fitas do DNA será tanto maior quanto maior for o número de
citosinas não metiladas na sequência.
Figura 7. Sequenciamento direto de produto por PCR de DNA tratado com bissulfito: A) perda de
complementaridade entre as fitas do DNA no fragmento em estudo (diferenças entre as bases na fita 5’-3’
destacadas em alaranjado); B) picos inespecíficos no eletroferograma após sequenciamento.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura (7A) e Marina Ibelli Pereira Rocha (7B).
PCR específica de metilação (MSP) – Do inglês methylation-specific PCR, baseia-se
no uso de primers desenhados para cobrir os potenciais sítios de metilação, como ilhas
CpG (Figura 8). Na MSP, após tratamento do DNA com bissulfito, são feitas duas reações
de amplificação separadas: uma com primers para o segmento metilado e outra com
primers para o segmento não metilado (HERMAN et al., 1996). Essa técnica possui alta
sensibilidade, é rápida e de fácil execução, mas pode gerar resultados falso-positivos
(BENHATTAR; CLÉMENT, 2004).
Figura 8. PCR específica de metilação (MSP). São feitas duas reações de PCR separadas: uma com primers
específicos para fragmento metilado (amarelo) e outra com primers para fragmento não metilado (verde).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Análise combinada de bissulfito e restrição (COBRA) – Do inglês combined
bisulfite restriction analysis, usa a amplificação do DNA tratado com bissulfito com primers
que evitam os sítios de CpG (não diferem fragmento metilado de não metilado), seguida
por digestão com enzima de restrição que revela, nos produtos de PCR, diferenças de
sequências dependentes de metilação (XIONG; LAIRD, 1997). Trata-se de um método
semiquantitativo altamente sensível, mas que pode gerar resultados falso-positivos em
caso de digestão enzimática ou modificação bissulfito incompletas (BENHATTAR;
CLÉMENT, 2004).
Avaliação da curva de dissociação (melting) em PCR em tempo-real – As
sequências de DNA tratadas com bissulfito e as proporções (%) de metilação são
determinadas com base nas modificações na temperatura de dissociação dos fragmentos
de DNA após a desnaturação térmica em PCR.
Avaliação por meio das técnicas:
• Curva de dissociação de PCR específica de metilação (McMSP), do inglês
melting curve methylation specific PCR.
• Curva de dissociação na análise combinada de bissulfito e restrição
(McCOBRA), do inglês melting curve combined bisulfite restriction analysis.
• Dissociação de alta resolução (HRM), do inglês high resolution melting.
As técnicas McMSP e McCOBRA acrescentam às técnicas MSP e COBRA,
respectivamente, a análise da curva de melting (AKEY et al., 2002). Na HRM, os primers
na PCR amplificam tanto amostras metiladas quanto não metiladas, e uma curva-padrão
com proporções conhecidas de metilação é incluída para dedução dos níveis de metilação
de cada amostra (LI et al., 2010; WOJDACZ et al., 2008).
Análise de conformação em fita simples sensível à metilação (MS-SSCA) – Do
inglês methylation-sensitive single-strand conformation analysis é uma modificação da
técnica de SSCP (do inglês, single-strand conformation polymorphism) para detectar
diferenças de metilação em pequenas regiões (200-250 bp) de interesse. Baseia-se na
amplificação do DNA tratado com bissulfito por PCR com primers que não englobam o sítio
CpG e, assim, evitam a amplificação seletiva de DNA metilado ou não metilado
(BENHATTAR; CLÉMENT, 2004; BIANCO et al., 1999).
A conversão com bissulfito altera a sequência do DNA de maneira dependente da
metilação e isso leva à alteração na conformação da cromatina em fita simples e no
padrão de migração em eletroforese (BIANCO et al., 1999).
Extensão por primer de nucleotídeo único (SNuPE) – Do inglês single nucleotide
primer extension, é um método quantitativo rápido para identificar diferenças de metilação
após tratamento do DNA com bissulfito. Envolve a amplificação por PCR da sequência-
alvo, seguida pela utilização de primers internos que se anelam a uma das fitas do alvo
gerado por PCR e terminam imediatamente a 5’ do nucleotídeo CpG a ser avaliado
(GONZALGO; JONES, 1997).
A reação é quantitativa e linear, e 2 a 3 sítios de metilação podem ser acessados
simultaneamente. O produto SNuPE pode ser detectado e mensurado por diversos
métodos (EL-MAARRI, 2004):
• Cromatografia líquida de alta performance, sem purificação.
• Incorporação de nucleotídeos radioativos.
• Separação em gel de acrilamida.
• Quantificação por autorradiografia.
• Uso de oligonucleotídeos marcados com fluorescência.
• Avaliação em PCR em tempo-real.
• Espectrometria de massas.
Microarranjo de oligonucleotídeo específico de metilação (MSO) – Do inglês
methylation-specific oligonucleotide microarray, o DNA tratado com bissulfito é amplificado
por PCR, cujo produto é hibridizado em microarranjo que discrimina a citosina metilada de
não metilada em posições específicas da sequência de nucleotídeos (Figura 9) (GITAN
et al., 2002).
Figura 9. Microarranjo de oligonucleotídeo específico de metilação (MSO). O DNA genômico
é tratado com bissulfito de sódio, amplificado por PCR, marcado com corante fluorescente
(Cy5) e hibridizado em sondas de microarranjo específicas para sítios CpG metilados
(GC_GC) ou não metilados (AC_AC).
Fonte: modificado de Ho e Tang (2007).
Representação reduzida de sequenciamento bissulfito (RRBS) – Do inglês
reduced representation bisulfite sequencing, é o tratamento do DNA com enzimas de
restrição, ligação a adaptadores, tratamento com bissulfito, amplificação por PCR,
clonagem e sequenciamento (MEISSNER et al., 2005). Essa estratégia permite quantificar
as citosinas metiladas em escala genômica e reduz custos, pois o uso de endonucleases
de restrição, que cortam perto de dinucleotídeos CpG e aumentam seletivamente a
quantidade das regiões CpG, restringe a região do genoma a ser sequenciada (ENCODE,
2012).
Imunoprecipitação de cromatina metilada (MeDIP ou mDIP) ou
imobilização de proteínas de ligação de metil (MIRA)
A MeDIP é um método que se assemelha à ChIP e é baseado na afinidade de
anticorpos específicos para citosinas metiladas (Figura 10) (WEBER et al., 2005). Nessa
abordagem, o DNA genômico é desnaturado por calor e incubado com anticorpo
monoclonal específico para 5mC (anti-5mC). O complexo precipitado de DNA metilado e
anticorpo é capturado por beads magnéticas, purificado e avaliado por qPCR, microarranjo
– MeDIP-chip – (CHENG et al., 2008) ou sequenciamento MeDIP-seq (RUIKE et al.,
2010). Essa técnica detecta metilação de DNA de maneira específica de fita e fora de
contexto de CpG (WU et al., 2012).
Figura 10. Imunoprecipitação de cromatina metilada (MeDIP): o DNA genômico é
fragmentado e desnaturado por sonicação; o DNA metilado é precipitado (IP) com um
anticorpo anti-5mC e purificado; e o DNA IP é comparado ao DNA controle (input).
Fonte: modificado de Pälmke et al. (2011).
O ensaio de recuperação de ilha CpG metilada MIRA, do inglês methylated-CpG
island recovery assay, baseia-se na alta afinidade das proteínas de ligação de metil
(MBD2) por DNA metilado, cuja interação é aumentada pela proteína MBD3L1 (RAUCH;
PFEIFER, 2005). Nessa técnica, o DNA genômico sonicado é incubado com uma matriz
contendo glutationa-S-transferase-MBD2b na presença de MBD3L1. A seguir, o DNA
especificamente ligado é eluído da matriz e amplificado por PCR para detectar a metilação
na ilha CpG (RAUCH; PFEIFER, 2005).
Detecção de 5-hidroxi-metil-citosina (5hmC), 5-formil-citosina (5fC),
5-carboxil-citosina (5caC) e metil-6-adenosina (m6A)
O tratamento do DNA com bissulfito não permite a diferenciação entre a 5mC e a
5hmC. Assim, outras estratégias foram desenvolvidas para a detecção da 5hmC:
Sequenciamentobissulfito oxidativo (oxBS-seq) – O KRuO4 promove oxidação de
5hmC em 5fC, que desamina com bissulfito. Assim, no sequenciamento a 5hmC é lida
como timina (BOOTH et al., 2012). O padrão de metilação e hidroximetilação é
determinado pela comparação das sequências obtidas sem tratamento, com tratamento
com bissulfito e com tratamento com KRuO4 e bissulfito.
Sequenciamento bissulfito assistido por Tet (TAB-seq) – Protege seletivamente a
5hmC por glicosilação pela β-glicosiltranferase, enquanto a 5mC permanece suscetível à
oxidação mediada por Tet para 5-caC. A seguir, o tratamento com bissulfito converte
citosina e 5-caC em uracila e 5-carboxil-uracila, respectivamente, que no sequenciamento
são lidas como timina, enquanto a β-glicosil-5-hmC é lida como citosina (YU et al., 2012).
Imunoprecipitação com anticorpo – O tratamento de 5hmC com bissulfito de sódio
resulta numa citosina 5-metilenosulfonada (CMS) que pode ser imunoprecipitada com o
anticorpo anti-CMS, que é mais específico que o anticorpo anti-5hmC (HUANG et al., 2012;
SONG et al., 2012).
As outras modificações de citosina do DNA e adenina do RNA têm sido avaliadas
(SONG et al., 2012) por:
• Cromatografia líquida (LC) seguida de espectrometria de massa (MS) – Separa
e identifica nucleotídeos hidrolisados em 5hmC e 5fC.
• Espectrômetro de massa de quadrupolo triplo (LC-MS/MS) – Permite identificar
5hmC, 5fC, 5caC e m6A.
Técnicas moleculares para investigar o posicionamento de
nucleossomos e a conformação de cromatina
Posicionamento e turnover de nucleossomos
O uso da nuclease micrococal (MNase) fornece um método de identificar a posição do
nucleossomo em cada gene, pois os nucleossomos protegem o DNA associado da
digestão pela MNase (ZHOU et al., 2011). A digestão parcial com MNase resulta em
fragmentos de cromatina nativa de 1 a 5 nucleossomos, o que equivale ao tamanho de 150
a 750 bp (SAJAN; HAWKINS, 2012; UMLAUF et al., 2004). Após a digestão, os
fragmentos gerados podem ser avaliados e mapeados por diversas técnicas, como
hibridização com sondas marcadas (TENG et al., 2001), qPCR – na técnica chamada de
NuSA – (INFANTE et al., 2012), e sequenciamento de nova geração (MNAse-seq) (ALLAN
et al., 2012).
O turnover de nucleossomos, que fornece informações sobre a regulação dos
processos dinâmicos da cromatina, pode ser avaliado por meio da ligação covalente de
tags para capturar histonas e identificar turnover (CATCH-IT; do inglês covalent attachment
of tagged histones to capture and identify turnover), que se baseia na marcação
metabólica de histonas e determina o perfil de DNA marcado por sequenciamento ou
hibridização em microarranjo (TEVES et al., 2012; ZHOU et al., 2011).
Conformação de cromatina
O teste de hipersensibilidade à DNaseI permite gerar mapas da acessibilidade da
cromatina ao detectar as modificações na estrutura associada com a ativação
transcricional: estrutura permissiva e DNA exposto e, consequentemente, maior
sensibilidade à digestão pela DNaseI (ZHOU et al., 2011). Os sítios de hipersensibilidade à
DNaseI geralmente estão localizados nos sítios de reconhecimento de fatores de
transcrição, que incluem promotores, enhancers, elementos de controle de locos,
silenciadores transcricionais, origens de replicação, elementos de recombinação e sítios
estruturais, geralmente localizados dentro de 1 kb na extremidade 5’ do sítio de início de
transcrição (LU; RICHARDSON, 2004).
A estratégia desse teste baseia-se no breve tratamento da cromatina com pequenas
quantidades de DNaseI de maneira a clivar os sítios expostos hipersensíveis. Para o
mapeamento dos sítios de clivagem, o DNA é isolado e analisado por Southern blotting
(LU; RICHARDSON, 2004), PCR multiplex (avaliação de até 50 locos simultaneamente,
com múltiplos primers) com amplificação dependente de ligação de sonda (MLPA, do
inglês ligation-dependent probe amplification); (OHNESORG et al., 2009), microarranjo –
DNaseI-chip – (FOLLOWS et al., 2006) ou sequenciamento DNaseI-seq (BAEK et al.,
2012).
O isolamento de elementos regulatórios assistido por formaldeído (FAIRE, do inglês
formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements) explora a solubilidade da
cromatina aberta e livre de nucleossomos na fase aquosa durante a extração com solvente
orgânico (ZHOU et al., 2011). Essa técnica consiste no crosslink da cromatina com
formaldeído, fracionamento por sonicação, extração com fenol-clorofórmio e avaliação do
DNA recuperado da fase aquosa, em comparação ao DNA não crosslinked, por
microarranjo – FAIRE-chip (GIRESI et al., 2007) ou sequenciamento – FAIRE-seq
(GAULTON et al., 2010).
A técnica de FAIRE resulta em enriquecimento de DNA coincidente com a localização
de sítios hipersensíveis à DNaseI, sítios de início de transcrição e promotores ativos
(GIRESI et al., 2007).
Uma técnica que se assemelha à técnica de FAIRE, mas inclui uma etapa de seleção
de tamanho e produz resultados diferentes, foi denominada de Sono-seq, quando avaliada
por sequenciamento. Essa metodologia baseia-se na maior eficiência de sonicação em
abrir a cromatina crosslinked de regiões de maior acessibilidade no genoma e tem como
objetivo mapear a localização da cromatina de alta acessibilidade nas regiões promotoras
(AUERBACH et al., 2009; SAJAN et al., 2012; ZHOU et al., 2011).
Captura de conformação de cromossomo
A técnica de captura de conformação de cromossomo (3C), do inglês chromosome
conformation capture, e suas variações permitem o mapeamento das interações de longa
distância da cromatina. A 3C baseia-se na maior frequência de ligações intramoleculares
entre fragmentos próximos em estrutura tridimensional (ZHOU et al., 2011). A 3C envolve
as seguintes etapas (SAJAN; HAWKINS, 2012):
• Tratamento das células com formaldeído para promover a ligação (crosslink) de
proteínas-DNA.
• Digestão com enzima de restrição de reconhecimento de 4 bp ou sonicação.
• Favorecimento de ligação entre as regiões próximas.
• Reversão do crosslink.
• Determinação da frequência de eventos de ligação entre as regiões genômicas
de interesse, que podem estar localizadas à distância de centenas a milhares
de bases, por qPCR.
Existem algumas variações da técnica de 3C (SAJAN; HAWKINS, 2012):
4C – Captura de conformação de cromossomo circular, do inglês circular
chromosome conformation capture, consiste de:
• Promoção de ligação para formação de um círculo após digestão com enzima de
restrição.
• Reversão do crosslink.
• Avaliação por PCR seguido de microarranjo ou sequenciamento.
4C – Captura de conformação de cromossomo no chip, do inglês chromosome
conformation-capture-on-chip, é:
• Digestão da cromatina crosslinked com enzima de restrição com sítio de
reconhecimento de 6 bp.
• Reversão da ligação cruzada.
• Digestão com enzima de restrição de reconhecimento de 4 bp.
• Promoção de autoligação entre as moléculas para formação de círculos.
• Avaliação.
5C – Captura de conformação de cromossomo por cópia de carbono, do inglês
chromosome conformation capture carbon copy, variação em larga escala na última etapa
(identificação dos fragmentos que interagem) do método 3C:
• Amplificação multiplex com MLPA.
• Identificação do produto de PCR em microarranjo ou sequenciamento.
6C – Captura de conformação de cromossomo combinada com ChIP e
clonagem, do inglês combined chromosome conformation capture ChIP cloning:
• Inclusão de etapa de ChIP após a ligação intramolecular do método 3C.
• Clonagem do DNA isolado por ChIP.
A técnica 5C foi usada para estudar interações entre sítios de início de transcrição e
elementos distais no genoma (SANYAL et al., 2012).
Uso de agentes desacetiladores e inibidores de metilação
Outra maneira de avaliar a estrutura da cromatina e seu papel no controle epigenético
de genes é intervir diretamente no processo de remodelação e monitorar as modificações
resultantes na atividade gênica.Como exemplo, a manipulação do balanço entre acetilação e desacetilação de
histonas por inibidores específicos das desacetilases de histonas (HDACs) é uma
ferramenta útil para o delineamento do papel funcional da hiper/hipoacetilação de histona
em várias atividades celulares (LIU; XU, 2004). Para tanto, pode ser usada a tricostatina A
(TSA), um ácido hidoxâmico natural que inibe as HDACs em baixas concentrações
(AHERNE et al., 2002; TOLLEFSBOL, 2004). A eficácia do tratamento com TSA depende
de vários fatores, como (LIU; XU, 2004):
• Tipo celular.
• Meio de cultura.
• Confluência da cultura celular.
• Tempo de incubação.
• Concentração.
Assim, a padronização rigorosa dos experimentos faz-se necessária (LIU; XU, 2004).
Entre outras substâncias químicas, capazes de promover alterações epigenéticas,
destaca-se a 5-aza-2-desoxicitidina (5-aza-Dc), que promove desmetilação do DNA. Como
um análogo de nucleosídeo, a 5-aza-Dc é incorporada no DNA em replicação e liga-se de
maneira covalente às metiltransferases de DNA (DNMTs), o que ocasiona a desmetilação
passiva durante a replicação do DNA e a divisão celular (HAGEMANN et al., 2011).
Considerações finais
São várias as técnicas moleculares que podem ser utilizadas para detectar e a avaliar
as modificações epigenéticas. Para a avaliar a metilação do DNA, o tratamento com
bissulfito de sódio é a técnica mais adotada, enquanto para as modificações de histonas,
costuma-se empregar a imunoprecipitação de cromatina. Assim, a escolha da técnica
molecular ideal deve ser baseada:
• No tipo de modificação a ser avaliada.
• Nos objetivos do estudo.
• Na quantidade de material disponível.
• No tipo de material disponível.
• Na escala (pontual ou genômica) do estudo.
• Na quantidade de recursos e de equipamentos disponíveis para os experimentos.
Referências
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Capítulo 6
Impressão genômica
Simone Cristina Méo Niciura
Felipe Perecin
Introdução
O embrião mamífero diploide (2n) é formado pela fusão dos gametas haploides (1n)
masculino (espermatozoide) e feminino (oócito) (Figura 1). Uma vez que cada um dos
genitores fornece a seus descendentes um gameta, ou seja, um conjunto haploide de
cromossomos, parece óbvio supor que a contribuição genética transmitida aos filhos por
ambos os pais deveria ser idêntica (WATSON et al., 1992). Entretanto, isso não é
observado em alguns genes.
Figura 1. Indivíduos adultos diploides (2n) produzem gametas haploides (n): oócito na
fêmea e espermatozoide no macho, que se unem, reconstituem o conteúdo cromossômico
2n e formam o zigoto, que, por mitose, desenvolve-se num novo indivíduo.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Os primeiros indícios de contribuição assimétrica dos genomas parentais para o
desenvolvimento embrionário foram obtidos durante a década de 1980. A partir de
experimentos de transferência pronuclear (Figura 2) e partenogênese, observou-se que
embriões murinos monoparentais, formados exclusivamente por genoma de origem
materna (ginogenéticos ou partenogenéticos) ou paterna (androgenéticos), eram incapazes
de sustentar o desenvolvimento e morriam logo após a implantação (MCGRATH; SOLTER,
1984; SOLTER, 1988).
Na mesma época, experimentos com camundongos portadores de translocações
cromossômicas revelaram que segmentos cromossômicos específicos, mas não o genoma
por inteiro, tinham função diferencial, dependendo da origem parental (CATTANACH; KIRK,
1985). Em conjunto, esses resultados demonstraram que os genomas paterno e materno
são funcionalmente não equivalentes e que a embriogênese completa é dependente de um
zigoto formado por ambos os genomas parentais.
Figura 2. Transferência de pronúcleos entre dois zigotos (2n) para se obter embriões
ginogenéticos (formados a partir de dois pronúcleos femininos, em rosa) e androgenéticos
(dois pronúcleos masculinos, em roxo).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Posteriormente, estudos em camundongos transgênicos demonstraram a ocorrência
de distúrbio de desenvolvimento quando alelos paternos ou maternos de um mesmo gene
foram isoladamente inativados. Quando o alelo paterno do gene do fator de crescimento
semelhante à insulina do tipo 2 (IGF2) foi inativado por mutação, foram observadas
alterações no desenvolvimento; ao contrário disso, animais portadores da inativação do
alelo materno desenvolveram-se normalmente. Disso, concluiu-se que, enquanto o gene
IGF2 de origem paterna é transcrito, o de origem materna permanece silencioso
(ALBERTS et al., 1994).
Essas evidências despertaram a curiosidade de diversos pesquisadores que buscaram
entender a maneira pela qual a expressão de alguns genes é controlada por sua origem
(materna ou paterna) e os mecanismos e as implicações desse evento, o que levou à
descoberta de vários genes com expressão dependente da origem parental. O “silêncio”
de um gene dependente de sua origem foi denominado de genomic imprinting (impressão
genômica) (KENDREW, 1994).
Definição
O genomic imprinting é o evento no qual a expressão de um gene depende de sua
origem parental, materna ou paterna (ALBERTS et al., 1994; JAENISCH, 1997; WATSON
et al., 1992). Em outras palavras, o genomic imprinting é o evento epigenético que
determina a expressão monoalélica de um gene. Enquanto a maioria dos genes
autossômicos é expressa por ambos os cromossomos parentais, a expressão gênica
imprinted é restrita a um dos alelos parentais. Assim, a atividade de um gene imprinted em
cada indivíduo depende do sexo do progenitor do qual o alelo foi herdado (WATSON et al.,
1992), de modo que alguns genes são expressos apenas pelo alelo herdado da mãe e
outros só pelo alelo herdado do pai (KENDREW, 1994).
O imprinting surgiu em mamíferos há aproximadamente 180 a 210 milhões de anos,
próximo do momento em que os humanos compartilhavam um ancestral comum com os
marsupiais e os monotrematas (HORE et al., 2007). Assim, o imprinting ocorre em genes
autossômicos de mamíferos eutérios (que possuem placenta verdadeira) e leva a desvios
da herança mendeliana (RUVINSKY, 1999). Em marsupiais (metatérios), o número de
genes imprinted descritos (seis genes até o momento) é bem menor que em mamíferos
eutérios, enquanto ainda não foram relatados imprints em monotrematas (prototérios) e
em aves (DAS et al., 2012). Fenômeno epigenéticosemelhante ao genomic imprinting já
foi descrito em plantas angiospérmicas e em insetos (LIZE et al., 2007; SPIELMAN et al.,
2001; TODER et al., 1996).
Os genes imprinted possuem algumas características em comum:
• São dispostos em grupos ou clusters (o que indica que podem sofrer interação).
• Apresentam assincronia na replicação do DNA, sequências repetitivas e poucos
e pequenos íntrons.
Poucos são os genes imprinted isolados no genoma, a maioria (80%) deles localiza-se
em clusters de até 4 megabases (Mb) de tamanho (BARLOW, 2011). Esses clusters – que
se estendem por centenas a milhares de quilobases no genoma – englobam genes
imprinted paternos ou maternos codificadores de proteínas, pelo menos um RNA não
codificador e, em alguns casos, outros genes não imprinted (ARNAUD, 2010;
STROGANTSEV; FERGUSON-SMITH, 2012).
Em bovinos, em comparação aos genes de expressão bialélica, os genes imprinted
possuem (KHATIB et al., 2007):
• Maior conteúdo G + C.
• Maior número de ilhas CpG e de repetições em sequência, com menor número
de short interspersed nuclear elements (SINEs) (KHATIB et al., 2007).
A maioria dos genes imprinted codifica proteínas, mas alguns genes produzem um
RNA não codificador, como o H19 (RUVINSKY, 1999; SASAKI et al., 1995; YOUNG;
FAIRBURN, 2000). O imprinting dos genes é específico em tecidos e estádios do
desenvolvimento e nem todos os genes imprinted numa espécie o são em outra, o que
indica aquisição evolutiva (RUVINSKY, 1999). Assim, de 63 genes imprinted de humanos e
camundongos, só 26 são conservados em ambas as espécies (ZAITOUN; KHATIB, 2008),
enquanto de 22 genes imprinted em humanos ou em camundongos, apenas 14 são
imprinted em bovinos (KHATIB et al., 2007).
Hipóteses que explicam a ocorrência de imprinting
Há várias hipóteses que tentam explicar a ocorrência de imprinting e suas
consequências. Uma teoria baseia-se na ideia do conflito genético entre os genes
maternos e os paternos durante a gestação, também conhecida como “batalha dos sexos”.
Uma vez que os fetos de mamíferos são nutridos diretamente a partir dos tecidos
maternos, seria vantajoso, para os alelos de origem paterna, promover maior crescimento
do feto, de modo a aumentar suas chances de espalhar descendentes pela população,
enquanto os alelos maternos deveriam evitar a sobrecarga da mãe e favorecer a
manutenção de fetos pequenos para assegurar o sucesso do parto e das futuras
gestações. Assim, o imprinting seria um compromisso entre mãe e feto, e entre genes
maternos e paternos (KENDREW, 1994; RUVINSKY, 1999).
Essa teoria prediz o comportamento dos genes IGF2 e do receptor do fator de
crescimento semelhante à insulina do tipo 2 (IGF2R) com muita acurácia: a maior
expressão do gene que codifica a proteína IGF-II (gene IGF2) pode aumentar o tamanho
do feto e, por isso, está sob controle paterno, enquanto o gene que codifica o receptor
(IGF2R), que se liga ao IGF-II e diminui sua disponibilidade, está sob controle materno
(KENDREW, 1994).
A teoria da “batalha dos sexos” também explica a ocorrência de doenças psiquiátricas,
pois quando há pequenos desvios em expressão materna, os bebês tendem a ser
menores, mais calmos e menos exigentes, enquanto os desvios em expressão paterna
resultam em bebês mais exigentes (BADCOCK; CRESPI, 2008). Entretanto, essa teoria
não explica a ocorrência de imprinting em diversos outros genes.
A teoria da coadaptação entre mãe e filho permitiria explicar a ocorrência de
imprinting em genes relacionados à lactação, principalmente em tecido mamário. Uma vez
que a glândula mamária é o único órgão mamífero que regula a transferência de nutrientes
entre mãe e filho após o nascimento e para o qual há controle do sistema nervoso central,
com a liberação de hormônios sob o estímulo da sucção, o imprinting desses genes
poderia regular o desenvolvimento pós-natal dos mamíferos (STRINGER et al., 2012).
A teoria do modelo de desenvolvimento sugere que o imprinting seria uma aquisição
evolutiva e ocorreria em resposta à pressão ambiental, induzindo a rápidas mudanças de
expressão ou à inativação dos alelos parentais de acordo com a necessidade (BEAUDET;
JIANG, 2002). Entretanto, essa maior capacidade de adaptação é controversa, uma vez
que, ao contrário do imprinting – que se assemelha à haploidia – a diploidia protege contra
mutações recessivas deletérias (WOLF; HAGER, 2006).
Há também a hipótese da “bomba-relógio ovariana”, na qual o imprinting evitaria a
partenogênese (ou reprodução assexuada) e assim asseguraria a variabilidade genética e
protegeria a mãe contra doenças malignas do trofoblasto (HAGEMANN et al., 1998;
VARMUZA; MANN, 1994). Apesar de não ocorrer, naturalmente, em mamíferos, a
partenogênese já foi descrita em cerca de 70 espécies de vertebrados, como cobras e
lagartos.
Além dessas, há a hipótese de que o imprinting permitiria a defesa do hospedeiro ou
a vigilância contra a perda de cromossomos, de modo a prevenir o câncer e a silenciar
elementos de DNA estranhos inseridos no genoma (JAENISCH, 1997; PASK et al., 2009).
Principais genes imprinted descritos e suas funções
Estima-se a existência de 100 a 1.000 genes imprinted no genoma (YOUNG;
FAIRBURN, 2000). Segundo o catálogo on-line de genes Imprinted (IMPRINTED..., 2013),
foram descritos 79 genes imprinted em humanos e 122 em camundongos, enquanto o
Gene Imprint Database (GENEIMPRINT, 2013) indica a existência de 88 genes imprinted
confirmados em humanos e outros 108 prováveis genes imprinted ainda a serem
confirmados. Entretanto, para os animais de produção (IMPRINTED, 2013; WEB..., 2013),
esse número é bem menor4:
Em bovinos, 22: ASCL2, GRB10, GTL2, H19, IGF2, IGF2R, ITUP1, MAGEL2,
MEG8, MEST, NAP1L5, NESP55, NNAT, PEG3, PEG10, PEG11, PHLDA2, PLAGL1,
SNRPN, TSSC4, USP29 e XIST.
Em ovinos, 16: BEGAIN, CDKN1C, DAT, DLK1, GNAS, GRB10, GTL2, H19, IGF2,
IGF2R, MEG8, MEST, PEG3, PEG11, PEG11-AS e SASH2.
Em suínos, 15: COPG2, DIRAS3, DLK1, GNAS, GTL2, H19, IGF2, IGF2-AS, IGF2R,
MEST, NNAT, PEG10, PHLDA2, PLAGL1 e SGCE.
Vale ressaltar que alguns genes imprinted são conhecidos por mais de uma
denominação, por exemplo:
• CDKN1C e p57KIP2.
• GNAS, GS-ALPHA, GNASXL e NESP.
• GTL2 e MEG3.
• IGF2R e M6PR.
• ITUP1, MIM1, MIMT1 e IMPO1.
• MEST e PEG1.
• PEG11 e RTL1.
• PEG11-AS, antiPEG11 e RTL1-AS.
• PHLDA2, TSSC3 e IPL.
Os genes imprinted representam menos de 1% dos genes em todo o genoma, mas
possuem funções determinantes em vários processos. Entre essas funções, destacam-se:
• A regulação do crescimento fetal, por IGF2, IGF2R e H19 (DEAN et al., 1998;
KENDREW, 1994; SASAKI et al., 1995; WATSON et al., 1992).
• O suprimento sanguíneo e a formação da placenta, por IGF2R, INS2 e MASH2
(LOI et al., 1998; TANAKA et al., 1999; YOUNG; FAIRBURN, 2000).
• A inativação do cromossomo X pelo XIST (YOUNG; FAIRBURN, 2000).
• O comportamento materno, pelo MEST (LEFEBVRE et al., 1998).
• A aprendizagem pelo XRL3B (DAVIES et al., 2005).
Charalambous et al. (2007) sumarizaram as funções de genes imprinted em diferentes
tecidos:
Placenta – Sobrevivência (MASH2 e PEG10), crescimento e estrutura (IPL e IGF2),
sistemas específicos de transporte (SLC22A2 e SLC22A3), suprimento de nutrientes para
o feto (SLC22A1L/IMPT1, SLC22A2, SLC22A3 e SLC38A4).
Crescimento e metabolismo pós-natal – Liberação AMPc (GNAS), comportamento
alimentar (GNASXL), sinalização de hormônio do crescimento (RASGRF1), transportador
aminofosfolipídeo (ATP10C).
Embrião e placenta – Genes em rede e coordenados temporalmente, com efeitos no
crescimento (IGF2, IGF2R, DLK1/PREF1, CDKN1C, GRB10, ZAC1, PEG1 e PEG3).
Crescimento pré-natal (interação entre feto, placenta e mãe) – Efeito em T3 e T4
(DIO3), IGF2 e PEG.
Metabolismo/deposição de gordura e massa magra – Diferenciação de pré-
adipócito em adipócito (DLK1/PREF1), magreza (IGF2 e GRB10).
Sensibilidade à insulina e produçãode insulina – Maturação de células β (IGF2),
produção de insulina (ZAC1), desenvolvimento do pâncreas (GRB10).
Apetite e hipotálamo – Homeostase de energia (IGF2 e PEG3), regulação de apetite
(ZAC1 e DLK1/PREF1).
Em camundongos, os genes de origem materna contribuem para o desenvolvimento do
embrião propriamente dito, principalmente das estruturas axiais (cérebro, tubo neural e
somitos), dos órgãos (rim e baço) e do endoderma do saco vitelino, enquanto os genes de
origem paterna participam no desenvolvimento dos tecidos extraembrionários,
especialmente do trofoblasto (CRUZ; PEDERSON, 1991; KENDREW, 1994; KONO, 1998).
Em bovinos e em ovinos, apesar de os genes de origem materna serem capazes de
estabelecer o tamanho adequado das membranas extraembrionárias (HAGEMANN et al.,
1998; MÉO-NICIURA, 2005), os embriões partenogenéticos (Figura 3) morrem na fase em
que o desenvolvimento da placenta é crítico para a implantação (HAGEMANN et al., 1998).
Assim, os embriões monoparentais (androgenéticos ou partenogenéticos) são incapazes
de levar a gestação a termo e morrem durante a fase inicial do desenvolvimento
intrauterino.
Figura 3. Embriões bovinos com 35 a 36 dias de gestação: A) embrião produzido por
fecundação in vitro; B) embrião partenogenético produzido por ativação química do oócito.
Fotos: Simone Cristina Méo Niciura
Estudos demonstraram que a manipulação do genoma de embriões partenogenéticos
– levando ao aumento da expressão do IGF2 e à expressão monoalélica do H19 –
normalizou a expressão de 32 outros genes imprinted e possibilitou o nascimento de um
camundongo partenogenético (KONO et al., 2004). Isso demonstra a intensa interação
existente entre genes imprinted.
Em continuidade a esse estudo, a deleção da região diferencialmente metilada (DMR)
do gene H19 e da região intragênica DLK1-DIO3 promoveu o nascimento de
partenogenéticos em taxas similares às obtidas por fecundação in vitro, indicando que
essas duas regiões são as únicas barreiras paternas ao desenvolvimento de indivíduo
bimaterno em camundongos (KAWAHARA et al., 2007). Entretanto, esses estudos não
foram repetidos em outras espécies animais.
Mecanismos de estabelecimento e manutenção de imprints
O estabelecimento dos imprints é resultado de modificações epigenéticas diferenciais
(metilação do DNA, modificações pós-traducionais em histonas ou ação de RNAs não
codificadores) entre alelos de um mesmo gene e que são replicadas, estavelmente,
durante as divisões celulares.
A metilação da citosina do DNA em sítios CpG é o mecanismo epigenético mais
compreendido e estudado responsável pela determinação dos imprints (ALBERTS et al.,
1994; RUVINSKY, 1999). As ilhas CpG – reguladas por metilação específica do alelo
parental – constituem as DMRs que controlam o imprinting e, por isso, são chamadas de
regiões de controle de imprinting (ICRs) (FEIL; BERGER, 2007). As ICRs contêm sítios
de ligação para fatores de transcrição, como o YY1 e o CTCF (KIM, 2008).
Assim, nos genes imprinted, para que o padrão de metilação seja transmitido aos
descendentes, é necessário que ele seja estabelecido nos gametas, durante a
gametogênese, que é a única fase em que os genomas de origem materna e paterna
estão fisicamente separados (SASAKI et al., 1995). Assim, é essencial que todos os
imprints herdados do espermatozoide e do oócito sejam “apagados” nas células
germinativas primordiais (PGCs) do embrião recém-formado, para que o indivíduo produza
gametas apenas com os padrões de imprints relativos ao seu sexo. Portanto, os imprints
desaparecem nas células germinativas primordiais (YOUNG; FAIRBURN, 2000) e voltam a
aparecer durante a gametogênese nos gametas maturos (RUVINSKY, 1999), conforme
mostra a Figura 4:
Figura 4. Os imprints (alaranjados), estabelecidos nos genomas do oócito (rosa) e do
espermatozoide (azul), são transmitidos ao zigoto e mantidos durante todo o
desenvolvimento, exceto nas células germinativas primordiais (PGCs), em que são
apagados e, posteriormente, restabelecidos nos gametas de acordo com o sexo do
indivíduo (macho ou fêmea).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Durante a fase migratória, em que as PGCs migram do epiblasto e passam pelo saco
vitelino e pelo mesoderma intraembrionário, ou durante a fase gonadal, depois de atingirem
a crista gonadal, as PGCs passam por uma onda global de desmetilação que apaga as
marcas epigenéticas nos genes imprinted. A perda de metilação nas PGCs provavelmente
ocorre por um mecanismo ativo de excisão de base, no qual a 5-metil-citosina (5mC) é
convertida em 5-hidroxi-metil-citosina (5hmC) pelas enzimas Tet (STROGANTSEV;
FERGUSON-SMITH, 2012), conforme o que foi visto no Capítulo 2.
Nos gametas em formação, o processo de metilação de novo restabelece as marcas
epigenéticas nas DMRs que identificam a origem parental do alelo. De acordo com o que
foi visto no Capítulo 2, a metilação de novo é promovida pelas metiltransferases de DNA
(DNMTs) 3A e 3B. Nas linhagens germinativas, a DNMT3A forma um complexo com a
DNMT3L, que interage com a H3K4 desmetilada ou com transcritos e com as proteínas
ZFP57/KAP1 e promove a metilação de novo (CHOTALIA et al., 2009; STROGANTSEV;
FERGUSON-SMITH, 2012).
Os imprints são apagados e restabelecidos em momentos diferentes ao longo da
formação dos gametas masculinos ou femininos a partir das PGCs. Por sua vez, a
regulação de diferentes genes imprinted na mesma linhagem germinativa (masculina ou
feminina) também é assincrônica. A desmetilação dos genes imprinted é precedida por
modificações nas marcas epigenéticas de histonas, em especial, por diminuição acentuada
dos níveis de H3K9me2 e pela elevação dos níveis de H3K27me nas PGCs migratórias
(HAJKOVA et al., 2008). Os níveis de metilação do DNA nas PGCs decrescem ainda mais
durante a fase migratória e na fase gonadal e geralmente a linhagem germinativa masculina
reprograma, epigeneticamente, os genes imprinted antes da linhagem germinativa feminina
(BIERMANN; STEGER, 2007).
Em suínos, por exemplo, a perda da metilação na DMR do gene IGF2R ocorre
aproximadamente aos 22 dias do desenvolvimento em machos e entre os dias 29 e 31 em
fêmeas, enquanto para a ICR do IGF2-H19, o decréscimo da metilação ocorre entre os
dias 22 e 42, com retomada da metilação aproximadamente aos 35 dias em machos e
depois de 42 dias em fêmeas (HYLDIG et al., 2011; PETKOV et al., 2009).
Quanto ao momento em que as marcas epigenéticas são restabelecidas nos imprints,
a variação temporal entre gêneros é bastante evidente em camundongos. De um total de
21 DMRs estabelecidas durante a gametogênese, 17 são metiladas no alelo materno após
o nascimento, no oócito em crescimento, e ocorrem em regiões promotoras, enquanto 4
são metiladas no alelo paterno ainda nas células germinativas e ocorrem em regiões
intergênicas (STROGANTSEV; FERGUSON-SMITH, 2012). Assim, nos machos, os
imprints são estabelecidos na fase pré-natal, nos espermatócitos ainda diploides, enquanto
nas fêmeas, os imprints são estabelecidos no estádio do diplóteno da meiose (MURPHY;
JIRTLE, 2003).
O mecanismo usado na identificação parental do alelo para a metilação ainda não é
completamente conhecido, mas deve envolver a participação da estrutura da cromatina, de
sítios de microRNA, de sítios hipersensíveis à DNaseI (BOYANO et al., 2008), de
espaçamento ótimo entre os dinucleotídeos CpG, de modificações de histonas (o alelo
metilado apresenta H3K9me3 e H3K20me3, enquanto o alelo ativo possui H3K3me2 e
H3K9ac, além de outras histonas acetiladas) (MONK et al., 2008; SINGH et al., 2010) e de
transcrição gênica (CHOTALIA et al., 2009). Além desses elementos em cis – que ocorrem
no próprio cromossomo – pode ocorrer a participação de fatores em trans, como as
proteínas de ligação de metil (MeCP2, MBD1 e MBD3) (MCMURRAY; SCHMIDT, 2012).
As etapas de desmetilação e de metilação de novo – descritas anteriormente – são
específicas paraa linhagem germinativa e, nesses eventos, os genes imprinted são
reprogramados de modo diferencial entre os alelos maternos e paternos. Uma segunda
onda de desmetilação global, que promove a reprogramação epigenética de todos os
demais genes (exceto os imprinted), ocorre logo após a fecundação, e o restabelecimento
do padrão de metilação acontece no estádio de blastocisto, em camundongos, ou no
estádio de 8 a 16 células, em bovinos (REIK et al., 2001; MANN; BARTOLOMEI, 2002).
Nessa segunda onda de desmetilação global do genoma – que ocorre durante o
desenvolvimento do concepto – os genes imprinted são protegidos e permanecem
metilados (JAENISCH, 1997; RUVINSKY, 1999) (ver Capítulo 7). A proteção dos genes
imprinted contra a desmetilação ativa é mediada pelos fatores PGC7/Dppa3/Stella que
são recrutados pela H3K9me2, enquanto a prevenção da ocorrência da desmetilação
passiva ocorre pela manutenção da DNMT1 e da DNMT específica do oócito (DNMT1o) no
núcleo (FAULK; DOLINOY, 2011; NAKAMURA et al., 2012; STROGANTSEV; FERGUSON-
SMITH, 2012).
Além da metilação do DNA, as modificações de histonas e a expressão de transcrito
antisense ou RNA não codificador também constituem mecanismos de controle de
imprinting (KENDREW, 1994; RUVINSKY, 1999; YOUNG; FAIRBURN, 2000; SPAHN;
BARLOW, 2003). Dos 6 genes imprinted descritos em marsupiais, só 2 são regulados por
metilação nas DMRs, enquanto os demais genes são controlados por marcas de histonas
(H3K9me, H3K27me, H3K4me e acetilação) (DAS et al., 2012).
A metilação diferencial pode induzir o silenciamento de um alelo parental por vários
mecanismos (MONK et al., 2008). O mecanismo mais simples envolve o silenciamento
direto do promotor, como observado nos domínios microimprinted (gene imprinted
localizado em íntron de gene não imprinted): a metilação do promotor num alelo bloqueia a
expressão do gene imprinted nesse alelo (Figura 5A). Exemplos: NAP1L5, INPP5F_V2 e
U2AF1-RS1 (WOOD; OAKEY, 2006).
Um segundo mecanismo envolve a ação do fator de transcrição CTCF como insulator,
no modelo bloqueador de enhancer (enhancer-blocker ou boundary): a metilação na ICR
impede a expressão do gene imprinted localizado a jusante ao mesmo tempo em que evita
a ligação do insulator CTCF, permitindo que o enhancer estimule a expressão do gene
imprinted a montante. Já a ausência de metilação na ICR resulta na expressão do gene
imprinted adjacente e permite a ligação de CTCF que impede o acesso dos enhancers ao
gene imprinted a montante (Figura 5B). Exemplos: locos IGF2/H19, DLK1/GTL2 e
RASGRF1/A19 (DELAVAL; FEIL, 2004).
O terceiro mecanismo envolve a ação de um transcrito RNA antisense ou não
codificador. O RNA antisense, produzido por um alelo, bloqueia a expressão do gene
imprinted nesse alelo (DELAVAL; FEIL, 2004; BERTEAUX et al., 2008; LATOS et al. 2009;
MONK et al., 2008).
• Por oclusão do promotor ou do transcrito.
• Por competição por elementos regulatórios, como fatores de transcrição e
enhancers.
• Por recrutamento de proteínas Polycomb.
• Por enriquecimento em marcas repressivas de histonas.
Enquanto a metilação na ICR no outro alelo bloqueia a expressão do RNA antisense e
permite que o gene imprinted seja expresso (Figura 5C). Exemplo: IGR2R, KCNQ1 e
GNAS.
Figura 5. Controle epigenético do genomic imprinting nos alelos paterno (P) e materno (M).
A) Domínio microimprinted: a metilação (alaranjada) do promotor (roxo) em M promove
silenciamento, enquanto a ausência de metilação em P resulta em expressão; B) Modelo
bloqueador de enhancer: a metilação na região de controle de imprinting (ICR) em P
promove silenciamento do gene imprinted (GI) à jusante e evita ligação do CTCF, permitindo
ao enhancer promover a expressão do gene a montante; em M, a ligação de CTCF evita a
metilação da ICR, resultando na expressão do gene a jusante, e impede o acesso dos
enhancers ao gene à montante; C) RNA antisense: produzido em P, bloqueia a expressão
gênica no próprio alelo, enquanto a metilação em M impede a produção de antisense,
levando à expressão gênica.
Fonte: modificado de Delaval e Feil (2004) e Wood e Oakey (2006).
Técnicas moleculares para identificar genes imprinted
Genes imprinted podem ser identificados (RUF et al., 2006):
• Pelo uso de animais portadores de dissomia uniparental ou de translocações
cromossômicas.
• Pela avaliação de genes candidatos conhecidamente imprinted em outras
espécies.
• Pela avaliação da expressão diferencial (por hibridização subtrativa, differential
display ou microarranjo) entre conceptos androgenéticos e partenogenéticos.
Entretanto, a avaliação da expressão diferencial entre conceptos
monoparentais pode não ser muito eficiente para a descoberta de novos genes
imprinted.
Com o uso de ferramentas de bioinformática, genes imprinted podem ser inferidos
pela identificação de ilhas de CpG, por exemplo, nos programas MethPrimer5 (LI; DAHIYA,
2002) e Emboss6 de sítios de ligação de CTCF7; e por contagem de alelos (com SNPs)
com representação desigual de transcritos em bibliotecas de cDNA depositadas em banco
de dados de EST (SEOIGHE et al., 2006).
As tecnologias de nova geração também permitem identificar genes imprinted por
meio da observação de SNPs identificados como heterozigotos pelo microarranjo de
genotipagem, mas identificados como homozigotos pelos dados de RNA-seq, o que
evidencia a expressão monoalélica ou o imprinting (HEAP et al., 2010); e, a partir dos
dados gerados para estudos de expressão gênica alelo-específica, um SNP pode ser
classificado como imprinted quando mais de 50% das reads mapearem para alelos do
mesmo parental (DEVEALE et al., 2012; GREGG et al., 2010).
Além disso, o estado de metilação das DMRs pode ser determinado por meio de
digestão do DNA com endonucleases de restrição sensíveis à metilação ou por tratamento
com bissulfito seguido de sequenciamento ou de PCR específica de metilação (TRINH
et al., 2001), técnicas detalhadas no Capítulo 5. Entretanto, a confirmação do imprinting
dá-se somente por meio da avaliação da expressão gênica alelo-específica parental por
discriminação alélica. Além da discriminação alélica por PCR em tempo real, as tecnologias
de nova geração, em função da cobertura de sequenciamento, permitem de maneira muito
precisa a identificação da expressão alelo-específica, por meio da contagem dos
transcritos heterozigotos de genes autossômicos. Assim, a expressão alelo-específica
ocorre quando um dos alelos de um indivíduo heterozigoto é mais expresso que o outro
alelo ou quando a diferença entre as reads por RNA-seq para os dois alelos é significativa
(SATYA et al., 2012).
Outra estratégia usada para identificar genes imprinted tem sido baseada em mapas
de ligação, por meio de métodos estatísticos que incorporam o genomic imprinting no
mapeamento genético de locos de caracteres quantitativos (QTL) (CUI, 2007).
Considerações finais
A expressão de alguns genes controlada por sua origem (materna ou paterna),
denominada de genomic imprinting, derrubou algumas bases genéticas estabelecidas e
contribuiu para a compreensão de diversos fenômenos anteriormente pouco
compreendidos. O imprinting participa:
• Na regulação do crescimento do feto.
• No suprimento sanguíneo e na formação da placenta.
• Na supressão de tumores.
• Na proteção do organismo contra DNA estranho.
• Na memória celular.
• Na expressão de hormônios.
• Na produtividade de animais, entre outros.
Portanto, tal mecanismo é de extrema importância para a vitalidade do organismo e
para a realização plena de suas funções, e o imprinting anômalo pode acarretar falhas no
desenvolvimento e no crescimento dos indivíduos afetados.
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Capítulo 7
Controle epigenético do desenvolvimento e do
envelhecimento em mamíferos
Simone Cristina Méo Niciura
Felipe Perecin
Naiara Zoccal Saraiva
Introdução
Neste capítulo, serão abordadas as modificações genéticas e epigenéticas que
ocorrem durante o desenvolvimento normal dos mamíferos, desde a formação dos
gametas (gametogênese e foliculogênese), passando pela fecundação, pela formação do
zigoto e pela progressão do desenvolvimento embrionário (ativação do genoma
embrionário, formação de blastocisto e inativação do cromossomo X em fêmeas) até a
diferenciação tecidual, o crescimento pós-natal e o envelhecimento.
Genética e epigenética da formação dos gametas
As células germinativas primordiais (PGCs) dão origem à linhagem germinativa tanto
nos machos como nas fêmeas. Originadas a partir do epiblasto, as PGCs não sofrem
diferenciação para linhagens somáticas pela expressão orquestrada de alguns fatores,
entre os quais NODAL, FGF8 e BLIMP1, que previnem a diferenciação dessas células
(HAYASHI et al., 2007).
Nas PGCs recém-formadas, os níveis de metilação do DNA são elevados. No entanto,
após migrarem para a crista gonadal, elas adquirem características epigenéticas
diferentes das células somáticas, que incluem:
• Maiores níveis de H3K4me2/3 e de H3K27me3.
• Redução de H3K9me2.
• Redução momentânea nos níveis de metilação do DNA seguida de metilação de
novo, que corresponde à primeira onda de reprogramação epigenética do
desenvolvimento (nesse caso, ainda durante a formação dos gametas a partir
das PGCs).
Uma segunda onda de reprogramação epigenética ocorre após a fusão dos gametas,
nos primeiros ciclos celulares do desenvolvimento embrionário, evento esse que será
abordado mais adiante, neste capítulo.
Nas PGCs que atingem a crista gonadal, o evento de desmetilação global, seguido de
metilação de novo, além de permitir o estabelecimento do padrão de imprinting específico
para os gametas de cada sexo (ver Capítulo 6), apaga possíveis epimutações acumuladas
durante a vida, reativa os genes específicos da linhagem germinativa e compatibiliza o
cenário epigenético com o restabelecimento da totipotência, que ocorrerá após a
fecundação (CANTONE; FISHER, 2013; HACKETT et al., 2013).
Nesse processo, além da desmetilação, há também perda da histona deligação H1 e
das marcas de histonas H3K27me3, H3K9me3, H3K9ac e H2A/H4 R3me2, além da
reativação do cromossomo X nas fêmeas. A diminuição de H3K9me2, desencadeada pela
redução da metiltransferase Ehmt1, pode ser necessária para que a desmetilação do DNA
ocorra, associada à diminuição de DNMT3A, de DNMT3B e de UHRF1 (proteína que
recruta DNMT1) (CANTONE; FISHER, 2013). Entretanto, alguns genes, principalmente
aqueles de elementos repetitivos, podem ser resistentes à desmetilação nas PGCs, o que
permite a ocorrência da herança epigenética transgeracional (HACKETT; SURANI, 2013).
Durante a gametogênese, podem-se destacar:
• A expressão de genes específicos das células germinativas – ASZ1 e NOBOX
(MINAMI; TSUKAMOTO, 2006) – e de proteínas Piwi, responsáveis pelo
estabelecimento da metilação de novo nos elementos de transposição
(GOLBABAPOUR et al., 2011).
• O restabelecimento dos padrões de imprinting no gameta maturo (REIK et al.,
2001; RUVINSKY, 1999) (ver Capítulo 6), que ocorre mais precocemente no
gameta masculino em comparação ao feminino (BIERMANN; STEGER, 2007).
• As substituições em série da histona de ligação H1: a ligação frouxa da histona
H1 à cromatina ocorre nas fases de meiose, enquanto a ligação forte ocorre
nas fases de mitose (GODDE; URA, 2009).
Por sua vez, as células germinativas masculina e feminina apresentam uma diferença
epigenética marcante em relação à metilação do DNA: os gametas masculinos apresentam
maiores níveis de metilação que os gametas femininos (GOLBABAPOUR et al., 2011;
SMITH et al., 2012). Além disso, as cromatinas pericêntricas dos oócitos e dos
espermatozoides possuem organização espacial única, que difere entre os gametas e em
comparação às células somáticas (MASON et al., 2012):
• Localização na periferia do nucléolo em oócitos.
• Agrupamento num cromocentro no centro do núcleo em espermatozoides.
Além das diferenças epigenéticas, o processo de produção dos gametas é diferente
entre machos (espermatogênese) e fêmeas (oogênese). As diferenças principais recaem
sobre o início e a duração da gametogênese, que no macho está restrita ao período pós-
púbere enquanto nas fêmeas inicia-se ainda na vida intrauterina e completa-se após a
fecundação. Os processos diferem, também, quanto ao suprimento de células
germinativas. Nos machos, a população de células germinativas é mantida por divisões
mitóticas, garantindo a reposição necessária dessas células para a contínua
espermatogênese. Nas fêmeas, é ainda aceito pela maioria da comunidade científica que
há um estoque finito de células germinativas ao nascimento, as quais vão sendo
continuamente consumidas durante a vida reprodutiva, sem reposição pós-natal. No
entanto, esse conceito vem sendo questionado por crescentes evidências de que há
proliferação pós-natal de células germinativas no ovário de espécies mamíferas
(JOHNSON et al., 2004, 2005; KERR et al., 2006; PACCHIAROTTI et al., 2010; TILLY
et al., 2009; TILLY; TEFFER, 2009; ZOU et al., 2009).
Espermatogênese
O processo da espermatogênese consiste na transformação das células germinativas
masculinas de espermatogônia a espermatozoides (Figura 1). As células-tronco masculinas
ou espermatogônias multiplicam-se várias vezes por divisões de mitose e dão origem a
novas espermatogônias ou a espermatócitos primários, que sofrem divisão meiótica e
resultam nas espermátides. As espermátides passam por modificações estruturais
(espermiogênese) e dão origem aos espermatozoides (ALBERTS et al., 1997; JOHNSON
et al., 1999).
Figura 1. Processo de espermatogênese para produzir o gameta masculino: as
espermatogônias diploides multiplicam-se por mitose e formam os espermatócitos
primários; um espermatócito primário sofre a primeira divisão da meiose e forma dois
espermatócitos secundários haploides. Na segunda divisão meiótica, cada espermatócito
secundário resulta em duas espermátides, que se diferenciam em espermatozoides.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Após a meiose, ocorre aumento da transcrição gênica nas espermátides.
Posteriormente, para que ocorra a condensação cromossômica no espermatozoide, há
substituição das histonas por protaminas. Esse evento é controlado por processos de
fosforilação e desfosforilação (participação da CAMK4) e pela ativação do sistema de
ubiquitinação (gene UBE2B) (SASSONE-CORSI, 2002).
Muitos genes expressos durante a espermatogênese se valem de promotores
alternativos (SASSONE-CORSI, 2002). Por exemplo, no testículo adulto, o gene DNMT1 é
regulado por splicing alternativo e dois produtos podem ser observados (BIERMANN;
STEGER, 2007):
• mRNA de 5,2 kb (isoforma somática) e suas proteínas, em espermatogônias,
espermatócitos jovens e espermátides redondas.
• mRNA de 6,2 kb não traduzido (isoforma específica de oócito), em
espermatócitos em paquíteno.
Outros eventos epigenéticos que se destacam durante a espermatogênese são
(BIERMANN; STEGER, 2007):
• Presença de histonas específicas de testículo (H1t, H1t2, HILS1, H2A.X, TH2B,
H3.3A e H3.3B).
• Participação da DNMT3A na entrada das células germinativas em meiose e da
DNMT3L na manutenção das divisões meióticas nos espermatócitos.
• Ação dos piwi-interacting RNAs (piRNAs) na regulação da tradução nas
espermátides.
A hiperacetilação de histona H4 na espermátide haploide está associada à troca de
histonas por protaminas, pois enfraquece a ligação entre as histonas e o DNA, permitindo a
interação da protamina (BIERMANN; STEGER, 2007). As protaminas são proteínas
nucleares ricas em arginina (CANTONE; FISHER, 2013) e podem sofrer várias
modificações químicas, como fosforilação, desfosforilação e formação de pontes dissulfeto
(BIERMANN; STEGER, 2007). As protaminas resultam em maior condensação da
cromatina e na parada total da expressão gênica (BIERMANN; STEGER, 2007). Nos
espermatozoides humanos, a troca de histonas por protaminas ocorre em 85% dos
nucleossomos, e as regiões de cromatina que permanecem com histonas podem
representar áreas de transcrição ativa, locos importantes para seu desenvolvimento, como
dos genes HOX e NANOG (NAKAMURA et al., 2012), ou podem servir também como
memória epigenética (BIERMANN; STEGER, 2007).
No espermatozoide, ocorre metilação de DNA no acrossomo e ausência de acetilação
de histonas, provavelmente em decorrência da condensação cromossômica por protaminas
(MAALOUF et al., 2008). A ligação mais apertada da histona H1 à cromatina, também está
associada ao maior nível de condensação cromossômica encontrado no espermatozoide
(GODDE; URA, 2009).
Oogênese
A produção de gametas femininos (Figura 2) ocorre pela divisão mitótica das PGCs,
no ovário embrionário, e pela formação das oogônias. Ainda durante o desenvolvimento
fetal, ocorre a primeira divisão da meiose (Meiose I), sendo interrompida na fase de
dictiato, e o oócito permanece no estádio de vesícula germinativa (VG) por vários meses
ou até anos. Assim, por ocasião do nascimento, já existe um número máximo de folículos
que pode chegar à ovulação. A Meiose I – que só é retomada na puberdade, após o
estímulo pré-ovulatório do hormônio luteinizante (LH) – consiste na progressão do estádio
de prófase I a metáfase II (MII), etapa de maturação oocitária nuclear, que resulta na
ovulação do gameta feminino (oócito) haploide. A segunda divisão da meiose (Meiose II)
nos oócitos – da maioria das espécies mamíferas – só ocorre após a fecundação pelo
espermatozoide (GORDON, 2003; HAFEZ, 1995).
Figura 2. Processo de oogênese para produzir o gameta feminino: a oogônia diploide
diferencia-se em oócito primário; a primeira divisão da meiose tem início, mas é
interrompida na fase de dictiato, e o oócito permanece em estádio de vesícula germinativa;
antes da ovulação, ocorre a retomada da Meiose I e a formação do oócito secundário
haploide e do primeiro corpúsculo polar (CP), na etapa de maturação nuclear; a segunda
divisão da meiose só aconteceapós a fecundação e leva à formação do oócito fecundado
ou ovo e à extrusão do segundo CP; durante a Meiose II, o primeiro CP também pode se
dividir.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Durante a maturação, os principais transcritos produzidos no oócito são reguladores
do ciclo celular, como o fator promotor de maturação (MPF) e suas subunidades ciclina B e
p34cdc2, o c-mos pró-oncogene (MOS) e a proteína quinase ativada por mitógenos
(MAPK), além dos receptores de gonadotrofinas (FSHR e LHCGR) e de conexina (CX43R)
(FERREIRA et al., 2009).
O oócito maturo (em MII) possui a habilidade de reprogramar a cromatina do
espermatozoide após a fecundação e dar suporte ao desenvolvimento até a fase da
ativação do genoma embrionário. No oócito em MII, destaca-se a expressão de genes
associados (ASSOU et al., 2009):
• À pluripotência (LIN28 e TDGF1).
• À remodelação da cromatina (TOP2A, DNMT3B, JARID2, SMARCA5, CBX1 e
CBX5).
• Aos fatores de transcrição zinc finger (ZNF84).
• Às cascatas de ubiquitinação e de proteossomo.
Após avaliação da expressão de genes envolvidos na reprogramação epigenética em
oócitos MII, em comparação a VG, foi detectada diminuição da expressão da DNMT
específica de oócito (DNMT1o) e aumento de acetiltransferases de histonas (HATs) e de
proteínas de ligação de metil (MBPs), que controlam o efeito repressivo da metilação do
DNA (OLIVERI et al., 2007).
A metilação do DNA é mantida na região centromérica do oócito em VG e aumenta à
medida que os cromossomos se condensam no estádio de MII (MAALOUF et al., 2008).
Em relação à acetilação de histonas, vários resíduos de lisinas das histonas H3 e H4 são
modificados nos oócitos em VG. Após a retomada da Meiose I, ocorre diminuição da
acetilação simultaneamente à condensação dos cromossomos em metáfase, mas novo
aumento de acetilação acontece durante os estádios de Anáfase I e Telófase I (ENDO
et al., 2005; KIM et al., 2003; TANG et al., 2007), e os níveis de acetilação só diminuem
quando a maturação está completa, no estádio de MII. Assim, a desacetilação de histonas
e a metilação do DNA são processos concomitantes à maturação dos oócitos (MAALOUF
et al., 2008). Vale ressaltar que os oócitos são globalmente hipometilados em comparação
aos espermatozoides e que esse padrão de metilação do DNA do oócito é mantido no
genoma de origem materna (SMITH et al., 2012).
Eventos numerosos e precisamente ordenados devem ocorrer no núcleo e no
citoplasma para que o oócito apresente completa competência meiótica e de
desenvolvimento, e a acetilação de histonas faz parte desses eventos (KIM et al., 2003;
WANG et al., 2006a, 2006b). Em oócitos murinos, a dinâmica de acetilação/desacetilação
é bem parecida entre as lisinas 9 e 14 da histona H3 e as lisinas 5, 12 e 16 da histona H4,
mas diferente em H4K8 (KIM et al., 2003). Em ovinos, o padrão descrito em H3K9 e em
H4K12 foi bastante similar ao descrito para camundongos (TANG et al., 2007).
Foliculogênese
O crescimento folicular ocorre de maneira ordenada. A partir do terço inicial do
desenvolvimento fetal, há formação dos folículos primordiais por meio de mitoses
sucessivas das células germinativas. A passagem do estádio de folículo primordial para
primário compreende o crescimento e a multiplicação das células da granulosa.
A retomada do desenvolvimento folicular para que ocorra a ovulação envolve:
• A síntese de RNA.
• A proliferação das células da granulosa.
• O aumento do tamanho do oócito.
• O envolvimento do folículo pelas células da teca.
Nessa fase, o hormônio folículo estimulante (FSH) atua em sinergismo com o estradiol
e, após o pico de LH, ocorre a ovulação do folículo dominante e a formação do corpo lúteo
(HAFEZ, 1995).
Por sua vez, o gene FIGLA contribui para o início da foliculogênese no ovário pós-
natal; o NOBOX participa no desenvolvimento, além do estádio de folículo primordial; e os
genes GDF9 e BMP15 estão ligados ao desenvolvimento além do estádio de folículo
primário (BONNET et al., 2008; MINAMI; TSUKAMOTO, 2006).
A expressão da aromatase – enzima da biossíntese de estrógeno codificada pelo
gene CYP19 – aumenta nos folículos grandes para promover a síntese de 17-β-estradiol,
necessário para o desenvolvimento folicular e a maturação, diminuindo após a lutenização
(MONGA et al., 2011). Essa regulação da expressão do gene CYP19 pode ser explicada
pelo estado de metilação em seu promotor proximal específico de ovário (MONGA et al.,
2011):
• Hipometilação nos folículos grandes (maior acessibilidade da cromatina e
ativação gênica).
• Hipermetilação no corpo lúteo (repressão gênica).
Genética e epigenética da fecundação e formação do zigoto
A penetração do espermatozoide no oócito induz alterações na concentração do íon
cálcio intracelular, que culmina (HAFEZ, 1995; GORDON, 2003):
• Na reação cortical: exocitose dos grânulos corticais e endurecimento da zona
pelúcida.
• No bloqueio à polispermia.
• Na retomada da meiose.
• Na singamia dos pronúcleos.
• No início das divisões mitóticas (Figura 3).
Figura 3. A fecundação do oócito pelo espermatozoide resulta na retomada da Meiose II e na extrusão do
segundo corpúsculo polar (CP), seguida pela formação dos pronúcleos masculino e feminino. Os pronúcleos
sofrem singamia no zigoto, o qual se divide por mitose e forma o embrião de duas células.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura
Na fecundação, o espermatozoide liga-se ao receptor ZP3 da zona pelúcida e sofre
reação acrossomal. Ao mesmo tempo, a interação com os receptores ZP1 e ZP2 facilita a
fusão entre o espermatozoide e o oócito. A reação acrossomal consiste na liberação do
conteúdo do acrossoma, composto por diversas enzimas. Entre essas, a hialuronidase
dissolve as células do cumulus que circundam o oócito e a pró-acrosina convertida em
acrosina digere a zona pelúcida e facilita a penetração do espermatozoide (GORDON,
2003; HAFEZ, 1995; JOHNSON et al., 1999).
Ao mesmo tempo em que o núcleo do oócito retoma à segunda divisão da meiose e
transforma-se em pronúcleo feminino, a cabeça do espermatozoide sofre descondensação
e forma o pronúcleo masculino (Figura 3). Por sua vez, as protaminas são substituídas
pelas histonas herdadas do oócito (CANTONE; FISHER, 2013). Os pronúcleos masculino e
feminino migram para o centro do citoplasma, as membranas nucleares fundem-se e
ocorre a singamia, que restabelece a constituição diploide do embrião. Em seguida,
iniciam-se as divisões mitóticas e o número de células no embrião aumenta em progressão
geométrica do estádio de duas-células até mórula e blastocisto (GORDON, 2003; HAFEZ,
1995).
Após a fertilização e a formação dos pronúcleos, uma segunda onda de
reprogramação epigenética ocorre no zigoto recém-formado. Os genomas parentais são
altamente assimétricos em modificações epigenéticas do DNA e da cromatina associada,
no início do desenvolvimento. Em relação à metilação do DNA, após a fecundação, ambos
os genomas parentais são desmetilados (DING et al., 2008; LIU et al., 2004):
• O pronúcleo masculino é rapidamente desmetilado, antes da primeira mitose, por
um mecanismo ativo.
• O genoma feminino sofre desmetilação passiva nas divisões celulares
subsequentes (Figura 4).
Figura 4. Desmetilação global do genoma (segunda onda de desmetilação) entre a fecundação e o estádio de
oito-células em bovinos: a desmetilação do genoma paterno (linha roxa), de maneira ativa, antecede a
desmetilação do genoma materno (linha cor-de-rosa), passiva. A metilação de novo (linha preta) ocorre entre
os estádios de oito-células e blastocisto.
Fonte: modificado de Mann e Bartolomei (2002).
No pronúcleo paterno, a desmetilação ativa é promovida pela oxidação da 5-metil-
citosina (5mC) em 5-hidroxi-metil-citosina (5hmC) mediada pela Tet3, seguida por
mecanismo de reparo por excisão de bases (CANTONE; FISHER, 2013; GU et al., 2011).
Em zigotos de murinos, de bovinose de leporinos, há aumento nos níveis de 5hmC e
concomitante redução nos níveis de 5mC no pronúcleo masculino durante o primeiro ciclo
celular após a fecundação (CANTONE; FISHER, 2013; GU et al., 2011; IQBAL et al.,
2011). Essa onda de desmetilação ativa no pronúcleo masculino pode ser importante para
iniciar o controle transcricional ou para reduzir os efeitos epigenéticos acumulados pelas
células germinativas masculinas (LEPIKHOV et al., 2008). Após a fecundação, a
desmetilação do genoma paterno é simultânea ao aumento da acetilação em H4
(MAALOUF et al., 2008), e a hiperacetilação pode favorecer a desmetilação (LEPIKHOV
et al., 2008).
Por sua vez, o genoma materno é amplamente refratário à desmetilação ativa através
da 5-hidroximetilação. De fato, enquanto os níveis de 5hmC no pronúcleo masculino
elevam-se grandemente, o pronúcleo feminino apresenta tênue aumento nos níveis de
5hmC restritos a regiões heterocromáticas próximas ao sítio de formação do nucléolo. No
genoma materno, a proteção contra a hidroximetilação e consequente desmetilação é dada
pelo fator PGC7/Dppa/Stella (WOSSIDLO et al., 2011). O mecanismo pelo qual a PGC7
mantém a metilação do DNA e protege contra a conversão da 5mC em 5mhC dá-se por
meio da sua ligação a H3K9me2 e bloqueio à ação da Tet (NAKAMURA et al., 2012).
Embora não ocorra desmetilação ativa do genoma materno na fase pronuclear, há
desmetilação passiva desse genoma ao longo das primeiras divisões mitóticas no início do
desenvolvimento. Isso ocorre em decorrência da ausência de DNMT1 e da consequente
diluição da 5mC durante as divisões celulares, ou seja, há duplicação do DNA sem
concomitante duplicação do padrão de metilação (CANTONE; FISHER, 2013).
A segunda onda de reprogramação, a qual ocorre logo após a fusão dos gametas e a
formação do zigoto, envolve desmetilação ativa do genoma paterno e desmetilação passiva
do genoma materno, mas, em ambos os genomas, os locos imprinted são preservados
durante essa onda, de modo que as marcas epigenéticas que determinam os imprints – e
que foram herdadas dos gametas – mantêm-se preservadas. Nas regiões de imprinting,
há um mecanismo protetor da metilação similar àquele que evita a desmetilação ativa no
pronúcleo feminino: PGC7/Dppa3/Stella liga-se a H3K9me2 e evita a hidroximetilação
(KANG et al., 2013; NAKAMURA et al., 2012). Além disso, as proteínas ZFP57 e TRIM28
– que recrutam SETDB1 que promove trimetilação de H3K9 – e a DNMT1 protegem os
genes imprinted da desmetilação passiva durante as clivagens (DENOMME; MANN, 2013).
Além da metilação de DNA, após a fecundação, a assimetria parental é reforçada pela
heterocromatina (ausência de HP1β no genoma paterno) e pelas marcas de metilação de
histonas. Na fusão dos gametas, o genoma materno apresenta H3K4me3, H3K9me1/2/3,
H3K27me2, H3K36me3, H3K64me3 e H4K20me3 (MASON et al., 2012; PUSCHENDORF
et al., 2008), enquanto o genoma paterno possui (MASON et al., 2012): H3K9me1;
H3K27me2/3; H4K20me1.
Durante a descondensação do pronúcleo masculino, após a fecundação, ocorre a
troca das protaminas por histonas acetiladas, as quais, em seguida, tornam-se metiladas
em H3K4 (LEPIKHOV et al., 2008).
Quanto à acetilação de resíduos de lisina, após a fecundação, há intensa acetilação
da histona H4 no pronúcleo masculino e aumento gradativo da acetilação no feminino, pois
nas primeiras horas, após a fecundação, a cromatina paterna parece competir com a
materna, pelo estoque de H4 acetilada, tornando-se mais transcricionalmente ativa
(ADENOT et al., 1997; MAALOUF et al., 2008).
Genética e epigenética do desenvolvimento embrionário
inicial
Transição materno-zigótica e ativação do genoma embrionário
O citoplasma do oócito é o responsável pelo suprimento de mRNAs e de proteínas
necessários para manter o embrião até a ativação principal do genoma, fase chamada de
transição materno-zigótica, na qual o embrião passa a depender da transcrição de seus
próprios mRNAs para continuar a se desenvolver (FAVETTA et al., 2004; KNIJN et al.,
2002; MEIRELLES et al., 2004).
A ativação do genoma embrionário depende da presença de componentes da
maquinaria de transcrição basal, assim como da reorganização nuclear (MASON et al.,
2012). O momento da ativação do genoma embrionário é variável entre as espécies e
ocorre (MEIRELLES et al., 2004):
• No segundo ciclo celular (estádio de duas-células) em camundongos.
• No terceiro ciclo (quatro-células) em suínos.
• Do terceiro ao quarto ciclo (quatro a oito-células), em humanos.
• No quarto ciclo (oito-células) em bovinos, em gatos e em cães.
• No quinto ciclo (dezesseis-células), em coelhos, em ovinos e em equinos.
Apesar de a ativação principal do genoma embrionário bovino ocorrer no estádio de
oito-células, há centenas de genes que são transcritos antes dessa fase, evento conhecido
como ativação secundária do genoma, do inglês minor genome activation (KUES et al.,
2008), e o genoma paterno pode estar envolvido no início da expressão gênica precoce,
ainda na fase de zigoto, em bovinos (BIERMANN; STEGER, 2007).
A assimetria epigenética parental, observada após a fecundação, cessa
simultaneamente com a polarização dos blastômeros e marca o fim da transição materno-
zigótica (PUSCHENDORF et al., 2008). O aumento da acetilação de H4 é gradual até o
estádio de oito-células em bovinos e, ao mesmo tempo, ocorre a desmetilação do DNA de
ambos os genomas parentais (MAALOUF et al., 2008). Assim, no estádio de oito-células
em bovinos, ocorre o pico de acetilação em H4 e de redução da metilação do DNA
(Figura 4), características epigenéticas de genes ativos, coincidente com a ativação do
genoma embrionário (MAALOUF et al., 2008).
Entre a fecundação e o estádio de oito a dezesseis-células, em bovinos, e de
blastocisto, em camundongos, ocorre a desmetilação quase total do genoma (Figura 4)
(REIK et al., 2001). Essa remodelação epigenética global permite apagar erros
acumulados durante a gametogênese e assegura que todo o potencial do genoma seja
exposto.
Entretanto, além dos genes imprinted, algumas sequências genômicas essenciais para
o desenvolvimento são protegidas da desmetilação, como as regiões repetitivas e a
heterocromatina centromérica, que previnem a ativação de retrotransposons e mantêm a
estabilidade cromossômica (BERGMAN; CEDAR, 2013; CANTONE; FISHER, 2013;
NAKAMURA et al., 2012). Essa proteção pode ser mediada (BERGMAN; CEDAR, 2013;
CANTONE; FISHER, 2013; NAKAMURA et al., 2012):
• Pela marcação por H3K9me2.
• Pela metilação de DNA.
• Pelo recrutamento de metiltransferases de histonas e de fatores de ligação
PGC7, ZFP57 e TRIM28.
O processo de restabelecimento de metilação, chamado de metilação de novo, que
ocorre até o estádio de blastocisto em bovinos (Figura 4), é marcado pelo aumento de
DNMT3A, de DNMT3B e de DNMT1, e os padrões de metilação alcançados são mantidos
durante as divisões celulares subsequentes. Na metilação de novo, as ilhas CpG de
promotores gênicos são protegidas da metilação pela ligação de fatores de transcrição,
como Sp1, e pelo empacotamento em nucleossomos marcados com H3K4me3, que inibe a
ligação das DNMT3A e DNMT3B (BERGMAN; CEDAR, 2013).
Formação do blastocisto
Os oócitos fecundados e em processo de clivagem são transportados pela tuba
uterina até o útero, onde atingem o estádio de blastocisto, e a totipotência das células é
perdida à medida que as clivagens progridem. As principais proteínas que participam da
polarização e da compactação dos embriões são os componentes das junções adesivas e
oclusivas, os complexos de divisão e as proteínas quinases atípicas (DURANTHON et al.,
2008). Assim, no estádio de mórula, há aumento da expressão de genes do citoesqueleto,
da adesão celular e de proteínas de junção celular (CUI et al., 2007). No estádio de
blastocisto, há aumento da expressão de genes envolvidos em canais de íons, tráfego de
membranas, proteínas carreadorasou de transferência e metabolismo de lipídeos,
provavelmente envolvidos na formação da blastocele (CUI et al., 2007). O blastocisto é o
primeiro estádio do desenvolvimento em que há evidente diferenciação morfológica entre
os tipos celulares (HAFEZ, 1995; GORDON, 2003):
• A camada externa de células constitui o trofoblasto (TE) e a interna, o
embrioblasto ou massa celular interna (MCI) (Figura 5).
• O TE dá origem às membranas fetais e ao saco vitelino, enquanto a MCI forma o
embrião propriamente dito.
Figura 5. Blastocisto bovino submetido à coloração diferencial para identificar as células da
massa celular interna (MCI) e do trofoblasto (TE).
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Antes do estádio de blastocisto, o primeiro evento que permite diferenciar as células
que irão contribuir para o TE das que darão origem à MCI provavelmente ocorre no estádio
de mórula. Em camundongos, essa diferenciação em mórula está associada aos altos
níveis de H3R26me2, promovidos pela CARM1, encontrados nos blastômeros individuais
do embrião de quatro-células que irão se tornar as células pluripotentes da MCI
(CANTONE; FISHER, 2013; MASON et al., 2012; TORRES-PADILLA et al., 2007);
enquanto os baixos níveis de H3R26me2 estão correlacionados à contribuição celular para
o trofoblasto (TORRES-PADILLA et al., 2007). Assim, o destino das linhagens celulares é
influenciado pelas modificações de histonas (CANTONE; FISHER, 2013).
Os genes de pluripotência, como POU5F1, NANOG, SOX2 e CDX2 são essenciais
para a segregação e a manutenção de tecidos embrionários e extraembrionários (ZHAO
et al., 2013). Assim, a diferenciação entre o TE e a MCI é marcada por expressão
diferencial desses fatores de transcrição: CDX2 fica restrito ao TE, enquanto POU5F1 (ou
OCT3/4) e NANOG restringem-se à MCI (DURANTHON et al., 2008).
Nos embriões de camundongo, os locos POU5F1 e NANOG são completamente
desmetilados na MCI (ZHAO et al., 2013) e apresentam aumento de H3K4me3 e de
acetilação de H4 (O’NEILL et al., 2006). Ocorre, também, distribuição assimétrica da
H3K27me3 em promotores de genes regulados ao longo do desenvolvimento, como OCT4
e CDX2 (DAHL et al., 2010); e acúmulo de H3K27me3 na MCI em comparação ao TE
(ERHARDT et al., 2003).
No estádio de blastocisto, o padrão global de acetilação de histona H4 também é
diferente entre os dois tipos celulares (MAALOUF et al., 2008):
• Intensa acetilação e menor metilação no TE, sugerindo maior atividade
transcricional.
• Fraca acetilação e maior metilação na MCI.
Compensação de dosagem: inativação do cromossomo X (ICX)
A inativação de um dos cromossomos X (ICX) nas fêmeas ocorre no estádio final de
blastocisto e é um mecanismo de compensação de dosagem que equilibra o número de
genes entre machos e fêmeas (XUE et al., 2002). Após a implantação, a inativação do X
ocorre em cada célula, simultaneamente, à diferenciação (BERGMAN; CEDAR, 2013). Em
bovinos, a ICX começa no estádio de blastocisto precoce (DE LA FUENTE et al., 1999) e
conclui-se entre o 7° e o 14° dias, no início do estádio de alongamento (BERMEJO-
ALVAREZ et al., 2011).
Enquanto a ICX é aleatória nos tecidos embrionários e extraembrionários em
humanos, ela ocorre de maneira imprinted nos tecidos extraembrionários de camundongos,
nos quais somente o cromossomo X, de origem paterna, é inativado (VERONA et al.,
2003). Por sua vez, nos marsupiais, o X de origem paterna é inativado em praticamente
todos os tecidos (HORE et al., 2007).
A ICX é um processo altamente complexo (Figura 6), fortemente controlado e
regulado durante o desenvolvimento (THORVALDESEN et al., 2006). No cromossomo X, o
centro de inativação do X contém os genes XIST e TSIX, que atuam na cascata de
silenciamento. No cromossomo X ativo, o TSIX (transcrito antisense) expresso impede a
transcrição do XIST e também recruta DNMT3A para silenciar o XIST (LEE;
BARTOLOMEI, 2013), enquanto no cromossomo X inativo, o XIST é expresso na forma de
RNA não codificador que se dispersa e cobre o cromossomo inteiro (THORVALDESEN
et al., 2006; VERONA et al., 2003). A metilação do DNA na região CpG do TSIX é um
evento epigenético que impede sua transcrição e desencadeia a expressão do XIST
(LEPIKHOV et al., 2008; VERONA et al., 2003), sendo o XIST também regulado,
positivamente, por outro RNA não codificaddor, o Jpx (LEE; BARTOLOMEI, 2013).
Figura 6. Inativação do cromossomo X em fêmeas. No cromossomo X inativo (Xi), a
metilação (alaranjado) impede a expressão do gene tsix, levando à expressão do gene xist;
no cromossomo X ativo (Xa), a ligação do CTCF impede a metilação, e o Tsix é expresso e
bloqueia a expressão do Xist. No Xi, o RNA não codificador Xist (preto) acumula-se ao longo
do cromossomo e recruta marcas repressivas de histonas (círculos azuis), resultando no
silenciamento da cromatina.
Fonte: modificado de Verona et al. (2003).
Após o acúmulo de XIST no cromossomo X inativo, há incorporação da variante de
histona macroH2A e das marcas de histonas H3K27me3, H3K9me2/3, H4K20me1 e
H2A119ub, que resultam na formação de heterocromatina e no silenciamento transcricional
(FEDORIW et al., 2012; THORVALDESEN et al., 2006; VERONA et al., 2003). O XIST
também recruta os complexos Polycomb PRC1 e PRC2 e suas respectivas marcas
repressivas de histonas, enquanto o TSIX compete com o XIST pela ligação em PRC2
(CASA; GABELLINI, 2012). A H3K27me3 é uma modificação envolvida na regulação das
etapas iniciais da inativação do cromossomo X, enquanto os eventos tardios incluem
(KONDO et al., 2008; WHITELAW; GARRICK, 2005):
• Redução de metilação em H3K4.
• Desacetilação global.
• Acúmulo de histona macro H2A.
• Metilação de DNA.
Em comparação ao cromossomo X inativo, o ativo possui maior acetilação das
histonas H3 e H4 (KIM et al., 2003) e é mais metilado em corpos gênicos, visando à
repressão de promotores intragênicos crípticos (HACKETT et al., 2013).
Diferenciação tecidual e crescimento pós-natal
Durante o desenvolvimento, há o comprometimento de linhagem, ou seja, as células
passam do estado de totipotência, em que podem originar todo e qualquer tipo celular,
para a pluripotência e para a diferenciação terminal (PRESSER et al., 2007). À medida que
as células passam do estado totipotente para especializado, grande parte de seu genoma
tem que ser reprimido de maneira estável (ZHOU et al., 2011). Assim, a metilação do DNA
sofre grandes modificações com a diferenciação, principalmente em regiões regulatórias
fora dos promotores principais (MEISSNER et al., 2008), e o balanço entre 5hmC e 5mC
no genoma está ligado ao processo de diferenciação (NAKAMURA et al., 2012).
Um dos primeiros eventos é o silenciamento dos genes de pluripotência OCT3/4 e
NANOG, que ocorre por interação com fatores de repressão e recrutamento da metilase
de histona G9a e que, com as desacetilases de histonas (HDACs) e a desmetilase de
H3K4, remove modificações ativas e promove metilação de H3K9. A H3K9 metilada liga-se
à HP1 e leva à formação da heterocromatina; além disso, a G9a pode recrutar moléculas
de DNMT3 e promover a metilação de novo (BERGMAN; CEDAR, 2013). As marcas que
promovem a repressão não são as mesmas para todos os genes: nas células
diferenciadas, o silenciamento do gene OCT4 ocorre por metilação do DNA; em SOX, por
H3K27me3 e H3K9me3; e em NANOG, por metilação do DNA e H3K27me3 (HAWKINS
et al., 2010).
Alto nível global de acetilação de histonas é importante para manter as células em
estado indiferenciado ou pluripotente. Durante a embriogênese, há aumento das marcas
repressivas H3K9me2/3. Entretanto, um grupo especial de genes do desenvolvimento tem
que ser reprimido para manter a pluripotência, e essa repressão é regulada por complexos
Polycomb (PcG) que se associam a H3K27me3 e H3K4me3 (GOLBABAPOUR et al.,
2011; LENNARTSSON; EKWALL, 2009). Durante a diferenciação, a estrutura quaternária
da cromatina também é modificada,pois a aproximação dos genes à lâmina nuclear
promove o silenciamento de OCT4 e de NANOG (FISHER; FISHER, 2011).
As células da MCI do blastocisto são pluripotentes e não totipotentes, pois não são
capazes de dar origem às membranas extraembrionárias (FISHER; FISHER, 2011), e a
partir delas é que são estabelecidas as células-tronco embrionárias (ESCs) (HACKETT;
SURANI, 2013). A diferenciação tecidual pode ser estudada in vitro por meio da
diferenciação direcionada das ESCs pluripotentes em células progenitoras específicas de
tecido (LI et al., 2012), e os eventos epigenéticos envolvidos no processo podem ser
acompanhados.
Em ESCs, o TSIX é expresso em altos níveis nos dois cromossomos X, ao passo que
a expressão de XIST é baixa. Quando a diferenciação celular é iniciada, um cromossomo X
é “escolhido” para inativação. Rapidamente, a expressão do TSIX é limitada ao futuro X
ativo, enquanto a expressão de XIST daquele cromossomo diminui rapidamente.
Simultaneamente, a expressão de XIST no futuro cromossomo inativo aumenta, enquanto a
expressão de TSIX diminui (WATSON et al., 2009).
A diferenciação das ESCs depende da variante de histona H2A.Z que se posiciona em
região flanqueadora ao sítio de início da transcrição (TSS), em éxons e em promotores (LI
et al., 2012). A diferenciação de ESCs em células progenitoras hepáticas/endoderma
resulta em maior ligação global de nucleossomos ao genoma e no enriquecimento em DNA
metilado nas regiões de ocupação de nucleossomos, além da depleção de nucleossomos
do TSS à distância de 1 kb em genes que são ativados durante a diferenciação (LI et al.,
2012).
Os adipócitos são derivados de células-tronco mesenquimais (MSCs) multipotentes,
cuja diferenciação ocorre em duas etapas:
• Determinação (comprometimento em linhagem adipocítica – conversão em pré-
adipócito).
• Diferenciação terminal (conversão de pré-adipócitos em adipócitos com gordura).
O gene PPARγ1 é expresso em baixos níveis nos pré-adipócitos, mas sua expressão
aumenta durante a adipogênese, concomitantemente ao aumento nos níveis da marca ativa
H3K4me3 no seu promotor (GE, 2012).
Em estudo com ESCs, com células progenitoras neurais e com fibroblastos
embrionários murinos, foi observado que H3K4me3 (catalisada por Tritorax; marca de
ativação) e H3K27me3 (por PcG; marca de silenciamento) em promotores discriminam
genes expressos, pausados (possuem as duas marcas, ou seja, são bivalentes) e
reprimidos, e refletem o estado celular e o potencial de linhagem (PRESSER et al., 2007).
As ESCs possuem maior número de promotores bivalentes que as células diferenciadas
(HAWKINS et al., 2010), o que assegura a resposta mais rápida frente a estímulos
(FISHER; FISHER, 2011).
A metilação do DNA é importante para manter o estado gênico reprimido em várias
gerações celulares, até mesmo durante toda a vida do indivíduo, e algumas ilhas CpG
sofrem metilação de novo específica de tecido durante o desenvolvimento (BERGMAN;
CEDAR, 2013). Assim, após a implantação, não há mudanças globais na metilação do
DNA, mas eventos epigenéticos que ocorrem em sequências-alvo específicas.
Envelhecimento e longevidade
O envelhecimento, processo lento e gradual de deterioração das capacidades
funcionais que predispõe a doenças e resulta na morte, consiste de complexas mudanças
anatômicas, fisiológicas, bioquímicas, genéticas e epigenéticas nos organismos durante a
vida (CALVANESE et al., 2009; D’AQUILA et al., 2013). Assim, a variação existente na
longevidade em humanos, determinada principalmente por fatores ambientais (DEELEN
et al., 2013) e evidente em gêmeos monozigóticos (FRAGA, 2009), pode ser controlada
por alterações específicas nos estados de cromatina (GREER et al., 2010).
Em cultivo, as células possuem limitada vida proliferativa e deixam de progredir no
ciclo celular, na chamada senescência replicativa, que reflete in vitro e em nível celular o
processo de envelhecimento (DIMAURO; DAVID, 2009). Em humanos, os seguintes genes
ou cascatas foram associados à longevidade (DEELEN et al., 2013):
• Sinalização entre hormônio do crescimento/insulina/IGF-1.
• Regulação imune e metabolismo de lipoproteína – Gene APOE (apolipoproteína
E).
• Apoptose e estresse oxidativo – Gene FOXO3A (fator de transcrição).
• Genes MINPP1, OTOL1 e CAMKIV.
Alguns dos eventos epigenéticos que ocorrem durante o envelhecimento (BAUR et al.,
2004; CALVANESE et al., 2009; D’AQUILA et al., 2013; DIMAURO; DAVID, 2009;
GENTILINI et al., 2013) estão relacionados à:
Metilação do DNA – Perda de metilação global; hipermetilação em sítios específicos
de ilhas CpG em alguns locos (genes de receptor de estrógeno, RNA ribossomal,
supressor de tumor, desenvolvimento de estruturas anatômicas e regulação de
transcrição); hipometilação de elementos repetitivos do DNA e do cromossomo X inativo e
em locos de genes de processos biológicos (resposta inflamatória aguda, regulação
positiva de tradução/sinalização e resposta de defesa a bactérias).
Atividade de metiltransferases de DNA (DNMTs) – Aumento de DNMT3B,
diminuição de DNMT3A e DNMT1.
Acetilação de histonas – Diminuição de H3K9ac.
Metilação e fosforilação de histonas – Aumento de H3K9me, H4K20me3 e
H3K10ph; diminuição de H3K9me3 e H3K27me3.
Atividade de enzimas modificadoras de histonas – Diminuição de metiltransferases
de histonas, como EZH2 do complexo Polycomb; alteração da atividade das HDACs:
• Diminuição de HDAC-1.
• Diminuição das acetiltransferases p300 e CBP.
Formação de heterocromatina associada à senescência (SAHF) – Em locos
genômicos codificantes de proteínas proliferativas, estabelecimento de marcas de
hipoacetilação de histonas, metilação de H3K9, proteína HP1, aumento de macroH2A e
diminuição de histona H1.
Disfunção dos telômeros – Os telômeros, elementos repetitivos nas pontas dos
cromossomos, protegem as extremidades do DNA da recombinação e da degradação, e
seu comprimento reduz a cada ciclo de replicação desse DNA. Assim, o encurtamento dos
telômeros está associado ao envelhecimento, pois leva à depleção de células-tronco e à
perda de regeneração tecidual. O silenciamento reversível de genes próximos aos
telômeros é chamado de efeito da posição do telômero (TPE), cuja perda também
participa do envelhecimento. Durante o envelhecimento, muitas dessas alterações
observadas são as mesmas que acontecem no câncer e, por isso, o envelhecimento pode
aumentar a predisposição a essa doença (CALVANESE et al., 2009).
Por sua vez, há alguns eventos epigenéticos que retardam o envelhecimento e
aumentam a longevidade. Em C. elegans, a deficiência de componentes do complexo
Tritorax ASH-2 – que promove H3K4me3 – e da metiltransferase de H3K4 – SET-2 –
aumenta a longevidade na presença de células masculinas intactas e na produção contínua
de ovos maduros (GREER et al., 2010).
As desacetilases da família das Sirtuínas (SIRT) têm sido consideradas um elo entre a
cromatina e o envelhecimento (GREER et al., 2010). A SIRT1, relacionada ao mecanismo
de restrição calórica, aumenta a vida útil, pois resulta em inibição da senescência e em
apoptose ou ativação de cascatas de resposta a estresse (CALVANESE; FRAGA, 2011).
Em humanos, a SIRT6 promove desacetilação de H3K9 nos locos teloméricos e evita
a disfunção dos telômeros. As desmetilases KDM2a e KDM2b, que têm a H3K36 como
alvo, também já foram associadas à prevenção da senescência (DIMAURO; DAVID, 2009).
Assim, pelo menos em humanos, a longevidade envolve melhor preservação do estado de
metilação do DNA, crescimento/metabolismo celular mais lento e melhor controle da
transmissão de sinal por mecanismos epigenéticos (GENTILINI et al., 2013).
Considerações finais
Em todas suas etapas, o desenvolvimento dos mamíferos (formação dos gametas,
fecundação, desenvolvimento embrionário, crescimento pós-natal e envelhecimento)
envolve controle orquestrado de efeitos genéticos e epigenéticos. As modificaçõesepigenéticas mais marcantes ocorrem durante o início do desenvolvimento:
Primeira modificação – Onda global de desmetilação que ocorre nas células
germinativas primordiais e apaga as metilações de todos os genes, incluindo os genes
imprinted.
Segunda modificação – Onda de desmetilação global que apaga os padrões
epigenéticos de todos os genes, exceto os imprinted, e garante o estabelecimento da
totipotência.
Por isso, é importante estudar os mecanismos epigenéticos e suas implicações, para
facilitar a compreensão de diversos mecanismos fisiológicos que ocorrem durante o
desenvolvimento e o crescimento dos indivíduos.
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Capítulo 8
Desordens de causa epigenética em humanos
Alexandre de Lima Oliveira
Simone Cristina Méo Niciura
Introdução
Há algumas décadas, acreditava-se que muitas das doenças não infecciosas que
surgiam na população eram provocadas por fatores genéticos; atualmente, a epigenética
traz explicações para algumas dessas questões. Neste capítulo, será mostrado o
envolvimento de eventos epigenéticos mensuráveis – como a metilação do DNA, as
modificações de histonas e os RNAs não codificadores – na etiologia de doenças em
humanos.
Como perspectivas futuras, o conhecimento dos eventos epigenéticos envolvidos nas
desordens patológicas pode:
• Estratificar os subtipos das doenças.
• Indicar a severidade, a resposta ao tratamento e o prognóstico clínico, além de
melhorar os tratamentos existentes.
• Criar novas opções de tratamento e prevenção.
• Desacelerar o progresso ou até mesmo promover a cura de doenças.
As alterações epigenéticas – associadas às desordens patológicas – podem ser
classificadas em dois tipos:
• Mudanças na regulação epigenética de genes, incluindo de genes imprinted.
• Alterações no DNA de genes que participam da maquinaria molecular de
estabelecimento e propagação das modificações epigenéticas durante o
desenvolvimento (TOST, 2010).
Com base nisso, a seguir, serão detalhadas as desordens de causa epigenética em
humanos.
Desordens neurodegenerativas e neurológicas
Síndrome de Rett (RTT)
A Síndrome de Rett (RTT) é uma desordem neurodegenerativa e uma das causas
mais comuns de retardo mental em mulheres. O crescimento da criança é normal, até
aproximadamente os 18 meses e, a partir dessa idade, começa a ocorrer regressão dos
movimentos psicomotores até perda das habilidades manuais e estagnação do
desenvolvimento.
Um gene ligado ao cromossomo X, que codifica a proteína 2 de ligação a metil-CpG, o
MECP2, do inglês, methyl-CpG binding protein 2 (ver Capítulo 2), proteína responsável
pela “leitura” da metilação do DNA (KELLY et al., 2010), foi identificado como o agente
causador da RTT. Mutações no gene MECP2 são encontradas em aproximadamente 95%
a 97% dos indivíduos com a forma clássica da doença e grandes deleções no MECP2
contribuem para a variante congênita severa da RTT (KOBAYASHI et al., 2012).
O MECP2 possui função central no desenvolvimento pós-natal do cérebro humano e,
por estar localizado no cromossomo X, é sujeito ao padrão de herança ligado ao sexo.
Como a inativação do cromossomo X é um processo aleatório, os fenótipos resultantes
das mutações no gene MECP2 em mulheres podem ser não só baseados no tipo de
mutação, mas também nos níveis de inativação do cromossomo que contém o alelo normal
em relação ao que contém o alelo mutante. Com apenas um cromossomo X, os machos
são mais severamente afetados pelas mutações no gene MECP2, e o baixo número de
homens com mutações nesse gene pode ser resultado de seu efeito letal durante o
desenvolvimento intrauterino (GONZALES; LASALLE, 2010).
Esquizofrenia
A esquizofrenia é um transtorno caracterizado por apatia, comportamento catatônico,
ilusões, alucinações e enfraquecimento cognitivo, e a maioria dos pacientes manifesta os
primeiros sinais clínicos na fase adulta jovem (PERRIN et al., 2010).
Sipos et al. (2004), em estudos conduzidos na Suécia, demonstraram o maior risco de
geração de descendentes com esquizofrenia com o aumento da idade paterna,
provavelmente por causa da ocorrência de mutações genéticas na linhagem germinativa
masculina. A idade avançada do avô materno (mas não do avô paterno), também foi
associada ao maior risco de descendentes com esquizofrenia, o que sugere a contribuição
da segregação do cromossomo X para a patologia (FRANS et al., 2011).
As variações no número de cópias (CNVs) do DNA, causadas por mutações de novo
recentes e sob forte pressão de seleção, também foram implicadas como fator de risco no
desenvolvimento de esquizofrenia (REES et al., 2011). Além disso, deleções no gene
NRXN1 – que codifica as neurexinas 1α e 1β – também estão envolvidas nessa doença,
assim como no autismo, na dependência de nicotina e no alcoolismo (VOINESKOS et al.,
2011). Essas proteínas têm a função de moléculas de adesão neural pré-sinápticas,
mediando as funções GABAérgicas (produção do neurotransmissor ácido gama
aminobutírico – GABA) e glutamaérgicas (produção do neurotransmissor glutamato)
(VOINESKOS et al., 2011).
Além das mudanças genéticas, a regulação epigenética aberrante está envolvida na
associação entre a idade paterna avançada e a esquizofrenia. Sabe-se que caracteres
epigenéticos são herdados,estavelmente, durante as divisões celulares. No entanto, com o
passar do tempo, erros epigenéticos podem se acumular nas células. Assim, o aumento da
frequência de alterações epigenéticas com a idade pode ser mais comum do que a
ocorrência de mutações do DNA (PERRIN et al., 2007).
A regulação epigenética em espermatogônias, em divisão contínua de mitose, pode
ser afetada em consequência da idade ou pela exposição cumulativa a agentes
modificadores endógenos ou exógenos. Como visto no Capítulo 7, durante o
envelhecimento, há progressiva perda da metiltransferase de DNA de manutenção
(DNMT1) e aumento da metiltransferase de novo DNMT3B (D’AQUILA et al., 2013). Assim,
níveis alterados das DNMTs em homens mais velhos podem contribuir para a perturbação
epigenética e afetar a remoção, o estabelecimento e a manutenção do imprinting paterno
durante a espermatogênese e após a fertilização. Além disso, a exposição ambiental em
todo o curso da vida de humanos do sexo masculino também pode causar defeitos na
regulação epigenética.
Várias exposições ambientais, como a arsênico e níquel, assim como a outras toxinas,
estão associadas a mudanças epigenéticas e podem afetar a espermatogênese. Portanto,
aberrações epigenéticas durante a espermatogênese, com o aumento da idade paterna,
podem ampliar o risco da geração de descendentes com esquizofrenia (PERRIN et al.,
2007).
Assim como para a Síndrome de Rett, mutações no gene MECP2, que participa na
metilação do DNA e na desacetilação de histonas, também foram associadas à
esquizofrenia e ao autismo (GONZALES; LASALLE, 2010; RYAN, 2009).
Transtorno bipolar
O transtorno bipolar é uma doença mental crônica, caracterizada por oscilações de
humor e que apresenta duas fases principais, com padrão de comportamento opostos:
• Fase de mania, caracterizada por euforia.
• Fase de profunda depressão.
Enquanto essas fases são separadas por períodos normais de humor, em alguns
pacientes a depressão e a mania podem se alternar rapidamente (VIETA et al., 2011).
O transportador de serotonina ou 5-hidroxitriptamina, o 5-HTT, do inglês, 5-
hydroxytryptamine transporter, é um neuromodulador do sistema nervoso central. O 5-HTT
humano é codificado pelo gene SLC6A4, localizado na banda 11.1-12 do braço longo do
cromossomo 17 (17q11.1-12). Esse transportador é responsável por regular a magnitude e
a duração da neurotransmissão serotoninérgica (WATANABE et al., 2011). Portanto,
acredita-se que as funções alteradas no 5-HTT, em algumas regiões cerebrais,
desempenham papel central na patofisiologia do transtorno bipolar, principalmente nos
episódios depressivos (CANNON et al., 2007).
Sugawara et al. (2011) procuraram estudar os eventos epigenéticos envolvidos nas
diferenças entre gêmeos monozigóticos discordantes em relação ao transtorno bipolar.
Na comparação entre um irmão sadio e um irmão com a enfermidade, foram demonstradas
diferenças na metilação do DNA nas ilhas CpGs no promotor do gene SLC6A4, com
hipermetilação associada à diminuição da expressão gênica no indivíduo com transtorno
bipolar (SUGAWARA et al., 2011).
Além disso, tem sido proposto que em neurônios GABAérgicos do telencéfalo e das
camadas corticais I, II e IV de pacientes com transtorno bipolar, há alta expressão de
DNMT1. Isso resulta em inibição transcricional de genes como o reelin, uma proteína da
matriz extracelular que regula eventos glutamaérgicos, e a descarboxilase de ácido
glutâmico 67 (GAD67, do inglês glutamic acid decarboxilase 67), uma das duas
descarboxilases que sintetiza o GABA. Os promotores do reelin e do GAD67 são
constituídos de grandes ilhas CpG e apresentam padrão específico de metilação. Assim, o
aumento na expressão da DNMT1 resulta em aumento de metilação do DNA nos
promotores e na diminuição da expressão desses genes, com consequente redução na
transmissão GABAérgica e hipoplasticidade neuronal. Além disso, o defeito na plasticidade
é provavelmente responsável pelas anormalidades de falta de sincronização da população
neural, que resulta em disfunções de aprendizado e em desordens de pensamento nos
pacientes psicóticos (COSTA et al., 2007; VELDIC et al., 2007).
Mal de Alzheimer
O mal de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa, caracterizada pela redução no
aprendizado e na atividade, e por alteração do comportamento. Embora o principal agente
causador dessa demência seja o processo neurodegenerativo, existe complexa interação
entre fatores biológicos, sociais e psicológicos (STELLA et al., 2011). No mal de Alzheimer,
são possíveis fatores de risco (PHILIPSON et al., 2010):
• Idade.
• Histórico familiar da doença.
• Sexo feminino.
• Traumas na cabeça.
• Hipertensão arterial.
• Doenças cardiovasculares.
• Dietas com altos níveis de colesterol.
As características neuropatológicas do mal de Alzheimer são presença de placas
senis extracelulares e de emaranhados neurofibrilares intracelulares, acompanhados de
perda neural. As placas senis consistem, principalmente, de fibrilas do peptídeo β-amiloide,
que circundam os neuritos distróficos (axônios e dendritos degenerados) e as células da
glia. O peptídeo β-amiloide é derivado da clivagem da proteína precursora amiloide APP,
do inglês amyloid precursor protein, pelo complexo constituído pela enzima 1 de clivagem
da APP no sítio β BACE-1, do inglês β-site APP-cleaving enzyme-1 e pela g-secretase.
A disfunção no metabolismo da APP gera acúmulo de peptídeos β-amiloides, que se
agregam e formam a placa senil, a qual é crucial para a neurodegeneração.
Os emaranhados neurofibrilares contêm as formas hiperfosforiladas e agregadas da
proteína tau, a qual promove a organização e a estabilidade dos microtúbulos nas células
neurais (SCHAEFFER et al., 2011). A fosforilação/desfosforilação da proteína tau é
regulada de forma complexa, e a hiperfosforilação patológica pode resultar de falhas na
atividade das quinases ou fosfatases (LANDRIEU et al., 2011). Uma das principais
fosfatases da tau é a proteína fosfatase 2A, cuja redução na atividade leva à
hiperfosforilação.
O mal de Alzheimer é uma doença geneticamente heterogênea. Mutações em três
genes: APP; presenilina 1 (PS1) e presenilina 2 (PS2), são responsáveis por causar a
forma rara familiar dessa doença, que se inicia em idade precoce (antes dos 65 anos de
idade) e que corresponde a menos de 2% de todos os casos da patologia. Além das
mutações, o início precoce da doença pode ser provocado pela duplicação do gene APP, o
qual resulta no aumento de dosagem (HAMILTON et al., 2011; PHILIPSON et al., 2010).
Para a forma mais comum dessa doença – que se inicia mais tardiamente na velhice –
até o momento, o fator de risco identificado foi o alelo ε4 do gene da apolipoproteína E
(APOE) (HAMILTON et al., 2011). A APOE liga-se à β-amiloide, o que altera sua
deposição ou remoção no cérebro, e torna-se um componente das placas senis
(PHILIPSON et al., 2010).
Para muitos casos de mal de Alzheimer, a causa genética não foi estabelecida, o que
determinou que efeitos epigenéticos e ambientais fossem investigados. Comparados às
causas genéticas, provavelmente os fatores epigenéticos são mais apropriados para
explicar as anormalidades no mal de Alzheimer do tipo tardio, pois o padrão epigenético
aberrante pode se acumular com o passar dos anos (WANG et al., 2008).
Pacientes com mal de Alzheimer mostram altos níveis de homocisteína e baixos níveis
de vitamina B12 e folato no sangue, sugerindo falha na regulação da S-adenosil-L-
metionina (SAM), que é o doador universal de metil para o processo de metilação do DNA
(ZAWIA et al., 2009). A metionina fornecida pela dieta pode ser convertida em
homocisteína pela transformação em SAM, desmetilação em S-adenosil-L-homocisteína
(SAH) e hidrólise em homocisteína. No mal de Alzheimer, os níveis de SAM reduzem em
concomitância com a diminuição na metilação do DNA e o aumento nos níveis de β-
amilase. Em baixas concentraçõesde SAM e de déficit de metionina, a homocisteína
segue a cascata metabólica de transmetilação e forma a metionina pela ação da metionina
sintase (MTR, do inglês, 5 methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase), uma
enzima dependente de B12. Uma mutação no gene MTR já foi associada à patogênese do
mal de Alzheimer (DORSZEWSKA et al., 2007). Da mesma maneira, uma mutação no
gene que codifica a 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), outra enzima
envolvida na remetilação da homocisteína em metionina, resulta no aumento da
concentração de homocisteína e foi associada a essa doença (DORSZEWSKA et al.,
2007).
Em casos de mal de Alzheimer de início tardio, análises da metilação do DNA
revelaram grande variabilidade epigenética em genes que participam do processamento do
peptídeo β-amiloide (PSEN1 e APOE) e da homeostase de metilação (DNMT1 e MTHFR).
Assim, a deriva epigenética, que ocorre com o passar dos anos e com a exposição a
diferentes fatores ambientais, pode constituir um mecanismo de predisposição dos
indivíduos a essa enfermidade de início tardio (WANG et al., 2008).
Desordens de imprinting
As desordens relacionadas ao imprinting ocorrem por alteração de dosagem, em
decorrência de dissomias uniparentais (UPD), duplicações cromossômicas ou deleções, ou
por epimutações (padrão aberrante de metilação do DNA na região de controle de
imprinting – ICR) de genes imprinted (ISHIDA; MOORE, 2013).
Síndromes de Prader-Willi (PWS) e de Angelman (AS)
A mesma região do cromossomo humano 15q11-13 é responsável pela manifestação
de duas síndromes diferentes, dependendo da origem parental do cromossomo que abriga
as alterações nos genes imprinted. A síndrome de Prader-Willi (PWS) ocorre em
decorrência da dissomia uniparental (UPD) materna, e a síndrome de Angelman (AS), por
UPD paterna.
A PWS, caracterizada por enfermidades físicas e mentais e que acomete 1 indivíduo
em cada 10 a 15 mil nascimentos, é uma anormalidade genética provocada pela perda
paterna de genes imprinted localizados no cromossomo 15q11-13. As características da
PWS incluem:
• Hipotonia.
• Dificuldades em se alimentar, por causa da fraca capacidade de sucção.
• Hipogonadismo e hipogenitalismo em ambos os sexos.
• Hiperfagia.
• Obesidade infantil.
• Baixa estatura causada pela deficiência de hormônios de crescimento.
• Pés e mãos pequenos.
• Desabilidade intelectual.
• Problemas comportamentais.
A AS, que acomete 1 em cada 10 a 40 mil indivíduos, é caracterizada por (WILLIAMS
et al., 2010):
• Severo atraso no desenvolvimento.
• Incapacidade de comunicação.
• Falta de coordenação ao andar (ataxia).
• Balanço constante dos braços.
• Comportamento feliz, que inclui sorrisos ou risadas.
• Microcefalia.
• Convulsões.
O mapeamento do cromossomo 15q11-13 humano revelou duas ICRs separadas por
35 kb de distância (Figura 1). A ICR na síndrome de Prader-Willi (PWS-ICR) controla
inúmeros genes de expressão paterna, localizados na porção mais centromérica do 15q11-
13, como MKRN3, MAGEL2, NDN, SNURF-SNRPN e C/D box snoRNAs, do inglês, small
nucleolar RNA; enquanto a AS-ICR regula dois genes mais distantes e de expressão
materna: UBE3A e ATPC10 (BUITING, 2010). A expressão monoalélica paterna dos genes
MKRN3, NDN e SNURF/SNRPN ocorre em decorrência da metilação do DNA em seus
promotores no cromossomo materno (Figura 1).
Figura 1. Locos dos genes imprinted de expressão paterna (Pat) e materna (Mat) no cromossomo 15 humano.
Representação das ilhas CpG metiladas (pirulitos alaranjados), do RNA antisense, que impede a expressão do
gene UBE3A paterno, e das regiões de controle de imprinting associadas às síndromes de Prader-Willi (PWS-
ICR) e de Angelman (AS-ICR).
Fonte: modificado de Hahn et al. (2010) e Puiu e Cucu (2011).
Aproximadamente 70% dos casos da PWS são causados por alteração genética
(deleção da região 15q11-13 paterna); cerca de 25% dos casos resultam de UPD materna,
e 1% a 3% dos casos devem-se a epimutações (BOWDIN et al., 2007; BUTLER, 2011;
ISHIDA; MOORE, 2013). Recentemente, foram identificados indivíduos com PWS
decorrente de mutações no alelo paterno do gene MAGEL2 (SCHAAF et al., 2013).
A AS é causada pela deficiência na expressão da cópia materna do gene UBE3A em
decorrência de uma das quatro possíveis etiologias (BOWDIN et al., 2007; GENTILE et al.,
2010; HORSTHEMKE; WAGSTAFF, 2008; ISHIDA; MOORE, 2013):
• 70% dos casos por deleção da região 15q11-13 materna.
• De 9% a 10% por mutação no gene UBE3A materno.
• De 2% a 4% por epimutações ou microdeleções que afetam a expressão da
cópia materna do gene UBE3A.
• De 2% a 5% por UPD paterna do cromossomo 15.
No cromossomo paterno normal, a PWS-ICR apresenta marcas epigenéticas ativas,
como metilação de H3K4 e ausência de metilação de DNA, e a AS-ICR permanece
metilada em estado heterocromático. Isso induz a transcrição dos genes de expressão
paterna da região 15q11-13 e a uma variante de splicing do SNURF/SNRPN, que cobre o
gene UBE3A em orientação antisense e o mantém silenciado. Por sua vez, no
cromossomo materno normal, a PWS-ICR apresenta modificações heterocromáticas,
como H3K9me3, H4K20me3 e metilação do DNA, enquanto a AS-ICR é ativa e não
metilada. Assim, no cromossomo materno, os genes MKRN3, NDN e SNURF/SNRPN são
silenciados pela metilação do DNA no promotor, e o gene UBE3A é transcrito e produz um
mRNA ativo (BUITING, 2010; HAHN et al., 2010).
Nos casos de epimutações, na AS há perda da AS-ICR materna e, com isso, a
heterocromatina repressiva não pode ser estabelecida no PWS-ICR, o que causa ativação
aberrante da PWS-ICR no cromossomo materno e expressão bialélica dos genes
controlados por essa ICR, além da produção do RNA antisense que silencia o gene UBE3A
nos dois cromossomos. Na PWS, com perda da PWS-ICR no cromossomo paterno, os
genes controlados por essa ICR não são expressos enquanto o gene UBE3A é expresso
bialelicamente, ou seja, tanto pelo cromossomo paterno quanto pelo materno (BUITING,
2010; HAHN et al., 2010).
Síndromes de Beckwith-Wiedemann e Silver-Russell
As síndromes de Beckwith-Wiedemann (BWS) e de Silver-Russell (SRS) são
fenotipicamente e genotipicamente opostas (ISHIDA; MOORE, 2013). Assim, a UPD do
cromossomo 11p15.5, quando de origem paterna, provoca a BWS e, quando de origem
materna, a SRS. A BWS, 1 caso em 13,7 mil nascimentos, é caracterizada por:
• Acentuado crescimento congênito.
• Macroglossia (alargamento da língua).
• Gigantismo.
• Defeitos na parede abdominal.
• Tumores embrionários, principalmente tumor de Wilms (tumor nos rins).
Na SRS, que ocorre 1 caso em 3 mil a 100 mil nascimentos, as características mais
comuns incluem:
• Restrição do crescimento pré e pós-natal.
• Relativa macrocefalia.
• Assimetria no crescimento.
• Clinodactilia (quinto dedo da mão recurvado em direção ao quarto).
• Características faciais típicas.
A região cromossômica humana 11p15.5 possui mais de 10 genes imprinted
organizados em 2 domínios, cada um controlado por uma ICR. Os genes IGF2 (expressão
paterna) e H19 (expressão materna) estão no domínio telomérico sob o controle da ICR1,
e os genes CDNK1C, KCNQ1 (ou KvLQT1) (expressão materna) e KCNQ1OT1 (ou LIT1,
expressão paterna) estão localizados na região centromérica, sob o controle da ICR2
(Figura 2).
Figura 2. Regulação de duas regiões de controle de imprinting (ICR1 e ICR2), modificadas por metilação ou
ligação do fator CTCF no cromossomo humano 11. Síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS) –
hipermetilação na ICR1 no cromossomo materno (M) com silenciamento de H19 e expressão de IGF2; BWS –
hipometilação na ICR2 em M com expressão do RNA não codificador LIT1 e silenciamento de CDKN1C e
KvLQT1. Síndrome de Silver-Russell (SRS): hipometilação na ICR1 no cromossomo paterno (P) com
expressão de H19 e silenciamento de IGF2.
Fonte: modificado de Eggermann et al. (2008) e Weksberg et al.(2010).
O ICR2 centromérico é metilado somente no alelo materno. Sob o controle da ICR2
está o gene CDKN1C, que codifica um inibidor de quinase dependente de ciclina (p57kip2)
e pertence à família do inibidor Cdk p21cip2, que participa no controle do ciclo celular. Há
também o gene de um RNA não codificador, o LIT1, localizado no íntron 9 do gene KCNQ1
e expresso pelo alelo paterno (EGGERMANN et al., 2010). Esse RNA não codificador está
diretamente envolvido no silenciamento em cis de genes paternos no domínio, por meio de
interação direta entre o RNA não codificador, a cromatina, a metiltransferase de histona
G9a e o complexo Polycomb PRC2 (ALGAR et al., 2011), Figura 2.
Na BWS, 15% dos casos são da forma herdável, decorrentes de mutações no gene
CDKN1C e de variações no número de cópias (CNVs), por causa de duplicações ou
deleções na região cromossômica 11p15.5 (BASKIN et al., 2014). Os 85% dos casos
restantes constituem a forma esporádica da desordem (sem histórico familiar) e ocorrem
por perda de regulação de genes imprinted localizados no cromossomo 11p15.5 (ISHIDA;
MOORE, 2013):
• 50% por hipometilação da ICR2 no alelo materno e 5% por hipermetilação da
ICR1 no alelo materno.
• 10% por mutação no gene CDKN1C.
• 20% por UPD materna em ambos os clusters (IGF2/H19 e KCNQ1).
• <1% por inversões ou translocações cromossômicas.
A BWS é esporádica, mas 15% dos casos são familiares, dos quais 40% estão
associados à mutação no gene CDKN1C (ISHIDA; MOORE, 2013). Aproximadamente, de
35% a 65% dos casos de SRS ocorrem por hipometilação da ICR1 paterna no
cromossomo 11p15.5 e 10% por UPD materna do cromossomo 7 (ISHIDA; MOORE,
2013).
Assim, os indivíduos com BWS apresentam defeitos epigené​ticos heterogêneos que
podem afetar um ou ambos os domínios do 11p15.5. O ganho de metilação do DNA e a
inibição da ligação do CTCF na ICR1 materna resultam em expressão bialélica do gene
IGF2 e silenciamento do gene H19 (Figura 2) (DE CRESCENZO et al., 2011). A perda de
metilação no alelo materno na ICR2 resulta em expressão bialélica do RNA não codificador
LIT1 e em perda de expressão dos genes CDKN1C e KvLQT1 (Figura 2) (LIM et al.,
2009).
Na SRS, a perda de metilação na ICR1 do cromossomo paterno permite a ligação do
CTCF e resulta em expressão bialélica do gene H19 e em ausência de expressão do gene
IGF2 (ISHIDA; MOORE, 2013; MOORE, 2011).
Assim, em ambas as síndromes, BWS e SRS, foram observadas modificações
epigenéticas de histona, de ligação do CTCF nas ICRs e de metilação do DNA,
correlacionadas com a estrutura da cromatina altamente organizada nesses locos. Em
células de indivíduos normais, foram encontradas:
• Marcas repressivas de histona, H3K9me3 e H4K20me3, associadas com a ICR1
metilada no cromossomo paterno.
• Marcas bivalentes (marcas simultâneas de ativação e de repressão na
cromatina), H3K4me2/H3K27me3, junto com H3K9ac e CTCF associadas com
o cromossomo materno não metilado.
Em linhagens de células derivadas de pacientes, a distribuição assimétrica
materno/paterna dessas marcas epigenéticas foi perdida, com H3K9me3 e H4K20me3
bialélica na síndrome de Beckwith-Wiedemann e com H3K4me2, H3K27me3, H3K9ac e
CTCF bialélica na síndrome de Silver-Russell (NATIVIO et al., 2011).
Além do envolvimento do cromossomo 11, a etiologia da SRS é de natureza
heterogênea e pode ocorrer por alterações no cromossomo 7, com a participação de duas
regiões (ISHIDA; MOORE, 2013):
• 7q32, que contém o gene MEST.
• 7q12.2-3, que contém o GRB10.
Câncer
O câncer é uma doença caracterizada por progressiva aberração genética e
epigenética, promovendo a instabilidade genômica. Na maioria dos tipos de câncer, têm
sido identificadas as seguintes alterações epigenéticas (KELLY et al., 2010; ROUKOS,
2011):
• Metilação do DNA: hipometilação global do genoma e hipermetilação de algumas
ilhas CpG.
• Modificações de histonas: perda de H4K16ac e de H4K20me3 em sequências de
DNA repetitivo.
• Posicionamento do nucleossomo.
• Ação de RNAs não codificadores, como os miRNAs: diminuição de miR-101,
miR-143, miR-29 e aumento de miR-21 e miR-155, que resultam na perda da
regulação da expressão gênica.
A metilação do DNA é um importante regulador na transcrição gênica e, nos últimos
anos, sua função na carcinogênese tem sido tópico de considerável interesse (ALBANY
et al., 2011). Especificamente, a metilação do DNA em ilhas CpG, na região promotora,
pode regular a expressão gênica de vários proto-oncogenes e de genes supressores de
tumor (BONETTA, 2008). O silenciamento transcricional via hipermetilação tem sido
identificado em genes supressores de tumor e a hipometilação global altera o estado
regulatório de proto-oncogenes. Assim, tanto a hipometilação quanto a hipermetilação
estão envolvidas na oncogênese (LIU et al., 2004), bem como na perda de imprinting em
certos alelos (WRZESZCZYNSKI et al., 2011).
Mutações no gene supressor de tumor BRCA1 – que codifica uma proteína envolvida
no sistema de reparo do DNA no tecido mamário – herdadas pela linhagem germinativa,
conferem grande risco no desenvolvimento do câncer de mama. Na ausência de mutações
no gene BRCA1, que ocorre em 10% dos casos da forma esporádica de câncer de mama,
outros mecanismos epigenéticos, como a hipermetilação nas ilhas CpG na região
promotora, podem levar à inativação gênica (STEFANSSON et al., 2011).
As acetiltransferases de histonas (HATs) e as desacetilases de histonas (HDACs)
exercem atividade em várias classes de genes associados à proliferação e à diferenciação
celular. Por isso, a disfunção dessas enzimas pode ser responsável por várias doenças,
incluindo o câncer (FLOREAN et al., 2011). As falhas na regulação das HATs, causadas por
mutação, translocação ou superexpressão têm sido correlacionadas a tumores
hematológicos e a tumores sólidos (VERNARECCI et al., 2011).
Aproximadamente 39% dos casos de linfoma grande e difuso de células B (DLBCL) e
41% dos casos de linfoma folicular apresentam deleções genômicas ou mutações que
removem ou inativam domínios codificadores de HATs dos genes CREBBP (CBP) e EP300
(p300). Esses genes, que codificam acetiltransferases da família KAT3, funcionam como
coativadores transcricionais de grande número de fatores de transcrição envolvidos em
múltiplas vias de sinalização e cascatas do desenvolvimento. Eles promovem aumento da
transcrição por acetilação da cromatina; por acetilação de ativadores transcricionais, como
dos supressores de tumor p53 e GATA-1; e por inativação mediada por acetilação de
repressores transcricionais, como o oncogene BCL6 associado ao DLBCL (PASQUALUCCI
et al., 2011).
Algumas evidências sugerem que as HDACs regulam a expressão e a atividade de
inúmeras proteínas envolvidas tanto na iniciação quanto na progressão do câncer. Também
tem sido sugerido que a repressão gênica mediada pelas HDACs pode causar crescimento
celular descontrolado em decorrência da repressão da transcrição de inibidores de
quinases dependentes de ciclinas, as CDKIs, do inglês, cyclin-dependent kinase inhibitors,
o que permite a proliferação continuada (NOH et al., 2011).
Entre todas as possíveis modificações epigenéticas, a metilação de lisina tem surgido
como uma mudança epigenética central na organização da cromatina em eucariotos, bem
como na etiologia do câncer. A metiltransferase de histona (HMT) SUV39H1 aumenta o
potencial de repressão transcricional da EVI1, uma oncoproteína expressa de maneira
aberrante na leucemia mieloide aguda (CATTANEO; NUCIFORA, 2008).
O gene MLL, do inglês, mixed lineage leucemia, codifica uma HMT de domínio SET
que promove metilação em H3K4 (MICALE et al., 2011). Translocações e duplicações no
MLL foram associadas à leucemia mieloide aguda e à leucemia linfoblástica aguda. O gene
MLL parece ser o regulador principal do grupo de genes homeobox (HOX), um grupo de
fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimentoembrionário e na diferenciação de
células hematopoiéticas. Assim, a perturbação no padrão de expressão dos genes HOX
tem sido observada em leucemias, envolvendo as proteínas MLL (MIREMADI et al., 2007).
Além disso, a proteína MLL é recrutada a promotores de genes reguladores do ciclo
celular pelo produto proteico do gene supressor de tumor MEN1, o que sugere o papel da
MLL na supressão de tumor e no controle do ciclo celular (BERNT; ARMSTRONG, 2011).
Os microRNAs (miRNAs) têm sido implicados na etiologia de vários tipos de câncer
(YU et al., 2011), por ação direta ou indireta em genes supressores de tumor e de
oncogenes. MiRNAs expressos diferencialmente entre tumores e tecidos normais
adjacentes têm sido identificados em vários tipos de tumores incluindo linfoma, câncer de
mama, câncer de pulmão, câncer na tireoide, glioblastoma, carcinoma hepatocelular,
carcinoma colorretal, tumores pancreáticos e adenomas pituitários (SETOYAMA et al.,
2011). O principal mecanismo de alteração do conteúdo genômico de miRNAs em células
cancerosas parece ser por expressão gênica aberrante destes. Assim, sugere-se que
mutações em genes de miRNA ou polimorfismos em sequências de interação dos miRNAs
com os mRNAs-alvos possam representar mecanismos de predisposição ao câncer
(SETOYAMA et al., 2011).
Como os miRNAs são reguladores negativos da expressão gênica, as mudanças nos
níveis de expressão desses miRNAs podem ser tumorigênicas tanto pelo aumento da
expressão de miRNAs que atuam em genes supressores de tumor quanto pela redução da
expressão daqueles que atuam em oncogenes.
Em câncer, os três miRNAs mais comumente superexpressos (oncogênicos) são: miR-
21, miR-155 e Cluster miR-17-92. Os três miRNAs com maior redução de expressão
(supressores de tumor) são (SORIANO et al., 2013): let-7, miR-34 e Cluster miR-143-145.
Outros exemplos de miRNAs, associados à tumorigênese, incluem o miR-373, um
oncogene que coopera com o transcrito do oncogene RAS na transformação oncogênica
pela supressão da sinalização através da via p53; o miR-15a e o miR-16, que regulam,
negativamente, a expressão do fator antiapoptótico BCL-2, então sua expressão reduzida,
como observada em 68% dos casos de leucemias linfocíticas crônicas, resulta em maiores
níveis da proteína BCL2 e da atividade antiapoptótica (LIU et al., 2011).
Outras patologias provocadas ou afetadas pela epigenética
Outro caso de patologia provocada por imprinting é a doença de Huntington, que é
letal no adulto e cuja idade de aparecimento dos sintomas varia, mas é mais precoce em
filhos de pai afetado por essa doença. Em indivíduos acometidos por essa enfermidade, há
aumento de H3K9me3 e possível elevação de H3K27me3 (KELLY et al., 2010).
Nas fêmeas com síndrome de Turner (X0), o fenótipo cognitivo e o fenótipo social
dependem de qual X está presente (de origem paterna ou materna) (JIRTLE; WEIDMAN,
2007). A esclerose múltipla, doença desmielinizante, é mais frequente em filhas de mães
afetadas do que em filhos de pais afetados (FERNÁNDEZ-MORERA et al., 2010).
Erros globais de imprinting, com consequente expressão de um só genoma parental,
levam a teratomas ovarianos e a molas hidatiformes, além da possível participação na
etiologia da eclâmpsia (RYAN, 2009).
O diabetes Mellitus, dependente de insulina (diabetes juvenil), é menos transmitido aos
descendentes de mulheres afetadas do que aos de homens afetados pela doença
(SOLTER, 1988). A alteração epigenética de reguladores transcricionais, como Hnf4a e
Pdx1, também está envolvida no maior risco de desenvolvimento do diabetes tipo 2 em
idade mais tardia (SANDOVICI et al., 2013). No diabetes, ocorre hipermetilação do
promotor PPARGC1A e hiperacetilação nos promotores de genes da inflamação (KELLY
et al., 2010).
Na patologia progeria (síndrome-de-huntchinson-gilford), caracterizada por
envelhecimento prematuro (dentro de 1 ano após o nascimento), um SNP no gene da
lâmina A (LMNA) resulta em lobulação do envelope nuclear, espessamento da lâmina
nuclear, agrupamento de poros nucleares e perda de heterocromatina periférica; além da
perda de H3K9m1, H3K9me3 e HP1, da redução de H3K27me3 no cromossomo X inativo,
associado à diminuição de EZH2, e do aumento de H4K20me3 (D’AQUILA et al., 2013;
DIMAURO; DAVID, 2009). Padrões anormais de metilação do DNA em 78 sítios, como do
lincRNA LOC149837, também já foram observados em pacientes sem a mutação gênica
(HEYN et al., 2013).
Há evidências de falhas na regulação epigenética associadas a doenças autoimunes,
como a artrite reumatoide (RA) e o lúpus eritematoso sistêmico (SLE), com alteração nos
padrões de metilação do DNA (FERNÁNDEZ-MORERA et al., 2010; RYAN, 2009). Na RA,
agentes ambientais determinam a ativação da doença em indivíduos geneticamente
predispostos, na qual há participação do fator nuclear kB (NFkB) que é recrutado a
promotores gênicos de citocinas e quimiocinas com conformação aberta de cromatina
(acetilação de H4 e fosfoacetilação de H3 que ocorre em resposta a sinais pró-
inflamatórios). O SLE é uma doença inflamatória autoimune, caracterizada pela produção
de autoanticorpos contra antígenos nucleares, e muitos dos genes ligados a essa doença
estão na região do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) (FERNÁNDEZ-
MORERA et al., 2010).
Terapias epigenéticas
Ao contrário das mutações de DNA, as modificações epigenéticas são reversíveis e
podem ser modificadas de maneira favorável, por meio de tratamentos que visem à
correção de erros epigenéticos. Na terapia epigenética, as principais categorias de
quimioterápicos são (HO et al., 2013; KELLY et al., 2010; LAIRD, 2005; SORIANO et al.,
2013; VERVERIS et al., 2013):
Inibidores de metilação do DNA
Análogos de nucleosídeos – 5-azacitidina (Vidaza) e 5-aza-2’-deoxicitidina (AZA;
Decitabina, Dacogen), aprovadas pelo US Food and Drug Administration (FDA) no
tratamento de síndromes mielodisplásticas, zebularina, SGI-110 e CP-4200.
Inibidores sintéticos – Hidralasina, RG108, procaína, procainamida, IM25 e
dissulfiram.
Compostos naturais – Curcumina, ginesteína, EGCG, resveratrol, equol e
partenolida.
Inibidores de desacetilases de histonas (HDACs)
Ácidos hidroxâmicos – Tricostatina A (TSA), SAHA (Vorinostat), aprovada pelo FDA
no tratamento de linfoma cutâneo de células-T (CLCT), ITF2357 (Givinostat), PCI-24781
(Abexinostat), PXD101 (Belinostat), LBH589 (Panobinostat), 4SC-201 (Resminostat) e
JNJ-26481585 (Quisinostat).
Peptídeos cíclicos – Depsipeptídeo (Romidepsin), aprovado no tratamento de CLCT.
Benzamidas – MS-275 (Entinostat) e MGCD0103 (Mocetinostat).
Ácidos graxos – Ácido valproico (VPA) e butirato.
Inibidores de metiltransferases de histonas
SL11144 e 3-deazaneplanocin-A (DZNep), inibidor de EZH2.
miRNAs
Inibição da superexpressão ou restabelecimento da perda de expressão de
miRNAs – Bloqueio individual com oligonucleotídeo antisense (chamado de anti-miRNA,
antagomir ou antimir).
Para algumas das desordens patológicas abordadas neste capítulo, serão detalhadas
aqui terapias epigenéticas disponíveis ou em estudo. O VPA é uma droga neurativa usada
como anticonvulsivante e estabilizador de humor no tratamento de transtorno bipolar, mas
não resulta em melhora da cognição em pacientes com esquizofrenia (HASAN et al., 2013).
Para tratamento do mal de Alzheimer, ainda não há agentes modificadores
epigenéticos aprovados para uso. Entretanto, pesquisas em modelos animais têm
comprovado efeito terapêutico de inibidores de doadores de metil e de HDACs sobre a
recuperação da memória e do declínio cognitivo (ADWAN e ZAWIA, 2013). Os tratamentos
são (ADWAN; ZAWIA, 2013; URDINGUIO et al., 2009):
• SAHA, fenilbutirato, TSA e crebinostat (inibidores de HDACs).
• Ácido valproico, butirato de sódio e vorinostat (inibidores de HDACs de classe I).
• Resveratrol (ativador de SIRT1, uma HDAC de classe III), presente na uva e no
vinho.
• Nicotinamida(inibidor não seletivo de SIRT).
• AK1 (inibidor de SIRT2).
• C646 (inibidor da HAT p300).
• AZA (inibidor de metilação do DNA).
• SAM e betaína (doadores de metil).
Uma opção adotada no tratamento do linfoma de células B foi a injeção intravenosa de
um antimiR para o miR-155 (SORIANO et al., 2013). Em pacientes idosos recém-
diagnosticados com leucemia mieloide aguda, o uso da terapia epigenética (AZA ou
decitabina) produziu taxas de sobrevivência similares às obtidas com a quimioterapia
intensiva (QUINTÁS-CARDAMA et al., 2012).
Na doença de Huntington, tem sido buscado o tratamento com inibidores de HDACs:
butirato de sódio, SAHA, TSA e fenilbutirato (URDINGUIO et al., 2009). Nas doenças
autoimunes, foi mostrada a eficiência do uso de SAHA, TSA e inibidores de DNMT no
tratamento de desordem semelhante a lupus em camundongos (JAVIERRE et al., 2008).
Considerações finais
A alteração epigenética de genes, incluindo de genes imprinted, ou as mutações
genéticas em genes envolvidos nas cascatas de modificações epigenéticas podem levar ao
desenvolvimento de diversas patologias em homens, além de predispor para a formação
de tumores. Assim, a compreensão da participação do controle epigenético na etiologia
dessas desordens patológicas e nas possibilidades de correção pode trazer grandes
benefícios à saúde humana.
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Capítulo 9
Implicações da epigenética na biotecnologia e
na produção animal
Naiara Zoccal Saraiva
Simone Cristina Méo Niciura
Introdução
Conforme já mencionado anteriormente, o desenvolvimento embrionário e o
crescimento pós-natal envolvem diversas modificações epigenéticas, que incluem a
metilação do DNA e as modificações pós-traducionais das histonas. Neste capítulo, serão
abordadas as implicações dessas modificações epigenéticas em biotecnologias da
reprodução e em produção animal.
Implicações da epigenética na biotecnologia animal
Tecnologias de reprodução assistida (ARTs)
As tecnologias de reprodução assistida (ARTs) incluem as etapas de obtenção de
gametas, maturação in vitro (MIV) de oócitos, fecundação in vitro (FIV) ou injeção
intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) e cultivo in vitro (CIV) de embriões (Figura
1). Assim, elas envolvem o isolamento, a manipulação e o cultivo laboratorial de gametas e
de embriões nas fases iniciais do desenvolvimento, momentos em que as marcas de
imprinting são estabelecidas e que as modificações epigenéticas são potencialmente
vulneráveis a influências externas (SATO et al., 2007), o que favorece a ocorrência de
falhas.
Figura 1. Etapas da produção in vitro de embriões (PIVE): obtenção de gametas (oócitos e espermatozoides),
maturação de oócitos, fecundação e cultivo in vitro.
Ilustração: Simone Cristina Méo Niciura.
Alterações relacionadas ao imprinting podem provocar o desenvolvimento de alguns
distúrbios, como a síndrome de Beckwith-Wiedemann e a síndrome de Angelman
(WEKSBERG et al., 2005), abordadas no Capítulo 8, onde é descrito o aumento no
número de casos dessas patologias em crianças concebidas por ARTs (MAHER, 2005).
Nos últimos anos, o número de indivíduos nascidos por meio de ARTs tem aumentado
substancialmente. Em 2005, esse número já correspondia de 1% a 2% do total de
nascimentos em alguns países desenvolvidos (MAHER, 2005). Contudo, as consequências
da manipulação de gametas e de embriões ainda não estão muito bem estabelecidas. Há
evidências de que crianças concebidas pelas ARTs apresentam maiores riscos de
desenvolver retardo no crescimento intrauterino, baixo peso ao nascer e alterações nos
padrões epigenéticos. Entretanto, os resultados são controversos em relação aos efeitos
sobre o imprinting em humanos.
Alguns autores observaram que as ARTs aumentam a incidência de patologias
relacionadas às falhas de imprinting (COX et al., 2002), enquanto outros demonstraram
riscos inferiores a 1% (BOWDIN et al., 2007). Num estudo feito nos períodos 1986–1994
(FIV) e 1995–2002 (várias ARTs), foi observado aumento de 2,3 e 1,75 vezes,
respectivamente, no número de patologias congênitas graves, relacionadas ou não ao
imprinting (MERLOB et al., 2005). Vale ressaltar que essas biotécnicas têm sido
aprimoradas ao longo do tempo, o que pode contribuir para corrigir falhas e reduzir riscos
associados com o passar dos anos.
Obtenção de gametas femininos
A superovulação (SOV) ou estimulação ovariana de fêmeas é um procedimento
adotado na maioria das ARTs, para se obter maior número de oócitos por ciclo
reprodutivo. Contudo, o uso de altas doses hormonais nesse procedimento pode afetar,
nos gametas, a aquisição de imprinting, que ocorre no final da oogênese (LUCIFERO et
al., 2004). Assim, embriões derivados de fêmeas superovuladas exibem maior ocorrência
de anormalidades nos padrões globais de metilação (SHI; HAAF, 2002). Sato et al. (2007)
verificaram que oócitos provenientes de mulheres submetidas à SOV e que se
encontravam nas fases de vesícula germinativa (VG) e metáfase I (MI) apresentaram
ganho de metilação no gene H19 e perda de metilação no gene PEG1 em comparação a
oócitos não superovulados. Já foi demonstrado que a SOV afeta a regulação dos genes
imprinted SNRPN, KCNQLOT1, PEG3 e H19 e que os efeitos hormonais foram exercidos
de maneira dose-dependente (MARKET-VELKER et al., 2010).
Também foi proposto que a SOV apresenta efeito duplo durante a oogênese, em
primeiro momento agindo durante a aquisição de imprinting pelo oócito, e posteriormente,
por meio de produtos gênicos que afetam a manutenção do imprinting no embrião. Assim,
resultados em camundongos e em humanos mostram que a SOV interfere na regulação do
imprinting tanto materno quanto paterno, alterando os padrões normalmente encontrados
em oócitos, em embriões nas fases iniciais do desenvolvimento e até mesmo em placentas
(FORTIER et al., 2008).
Em animais domésticos, embora ainda não se tenha um estudo completo sobre
alterações epigenéticas decorrentes da SOV, sabe-se que os protocolos de
superestimulação ovariana provocam alterações na expressão de vários genes (GAD et
al., 2011). Além disso, oócitos coletados para produção de embriões podem ser oriundos
de folículos imaturos ou atrésicos e que, normalmente, não ovulariam e poderiam
apresentar defeitosde imprinting (YOUNG; FAIRBURN, 2000).
O uso de agentes inibidores de desacetilases de histonas (HDACs) mostrou-se
benéfico durante o crescimento e a maturação do oócito. O tratamento com tricostatina A
(TSA), inibidor reversível das HDACs, atrasou a progressão meiótica e proporcionou
aumento de 40% nas taxas de maturação de oócitos em crescimento em suínos (PETR et
al., 2009). Além disso, reduziu a fragmentação em oócitos envelhecidos (JESETA et al.,
2008), tendo como consequência o maior desenvolvimento embrionário.
Gametas masculinos e fecundação
Normalmente, as alterações dos padrões epigenéticos ligadas às ARTs também
podem resultar do uso de células espermáticas com reprogramação incompleta. Existe a
preocupação de que a ICSI e a injeção intracitoplasmática de espermátides redondas
(Rosi) possam aumentar a incidência de alterações de imprinting, pois essas técnicas
cancelam a seleção natural que é feita contra espermatozoides aberrantes (BIERMANN;
STEGER, 2007) e usam células espermáticas nas quais a remoção e o restabelecimento
de imprinting ainda não foram finalizados para todos os genes.
O genoma paterno em zigotos derivados de espermatozoides imaturos apresenta-se
hipermetilado em relação ao padrão normal, e os genomas de zigotos derivados de Rosi
são remetilados após a desmetilação inicial, antes da conclusão da primeira divisão de
mitose (KISHIGAMI et al., 2006).
Durante a espermatogênese em humanos, os processos de remoção e de
restabelecimento das marcas de metilação dos genes imprinted SNRPN (MANNING et al.,
2001) e H19 (KERJEAN et al., 2000) são finalizados antes das células germinativas
entrarem em meiose. Assim, questiona-se se os pacientes considerados inférteis mostram
atraso ou remodelamento incorreto de suas marcas de imprinting. A existência de sítios
CpG hipometilados esporádicos tem sido descrita em espermatozoides de homens com
oligospermia (MARQUES et al., 2004).
Produção in vitro de embriões (Pive) em animais
Nas últimas décadas, as biotecnologias aplicadas à reprodução animal vêm causando
grandes impactos, contribuindo significativamente para a pesquisa e para a produção
animal, auxiliando na compreensão de funções biológicas e aumentando os índices de
produtividade das diferentes espécies animais.
A produção in vitro de embriões (Pive) é considerada como a terceira geração de
biotecnologias da reprodução animal, sendo as técnicas de inseminação artificial (IA) e de
transferência de embriões (TE) consideradas como a primeira e a segunda geração,
respectivamente (THIBIER et al., 1992).
Apesar de já estabelecida desde a década de 1980 (BRACKETT et al., 1982), a Pive
ainda apresenta índices bem inferiores àqueles obtidos in vivo, pois, em média, apenas
30% a 40% dos zigotos são capazes de prosseguir até o estádio de blastocisto. Alguns
estudos sugerem que o padrão epigenético seja modificado durante o cultivo in vitro
(WILSON; JONES, 1983). Os componentes do meio de cultivo podem interagir com os
genes imprinted e provocar a remoção de metilações. Além disso, há influência da duração
do cultivo in vitro, que resulta no aumento nos níveis de acetilação das histonas H3 e H4
em cultivos por longos períodos, quando comparados a curtos períodos (ENRIGHT et al.,
2003).
Embriões bovinos produzidos in vitro apresentam padrão de transcrição gênica
diferente dos produzidos in vivo (LAZZARI et al., 2002; RIZOS et al., 2002; WRENZYCKI
et al., 2002, 2004), como observado na expressão de genes relacionados:
• Ao cromossomo X: G6PD e PGK.
• À apoptose e ao estresse térmico e oxidativo: HSP 70.1, BAX, SOD e SOX.
• Ao transporte de glicose: GLUT-3 e GLUT-4.
• À comunicação celular: CX43 e CX31.
• À diferenciação: LIF e LR-β.
Em camundongos, foi observada expressão anômala do gene H19, após intensa
manipulação dos embriões (SASAKI et al., 1995). Em bovinos e em ovinos produzidos in
vitro, a síndrome-do-bezerro-gigante (LOS), do inglês, large offspring syndrome, também
pode ser causada por diversos genes imprinted, com expressão alterada (YOUNG;
FAIRBURN, 2000).
Conforme já abordado no Capítulo 7, a inativação do cromossomo X (ICX) é essencial
para a embriogênese normal. Há evidências de que a Pive e os procedimentos de
transferência nuclear (WRENZYCKI et al., 2002) podem causar mudanças no processo
ICX, alterando a compensação de dosagem de alguns genes ligados ao X em embriões
obtidos com essas tecnologias. Wrenzycki et al. (2002) verificaram o dobro da expressão
do gene G6PD (enzima que atua como fator limitante na via pentose fosfato) em mórulas e
em blastocistos de fêmeas oriundas de Pive, enquanto, em embriões obtidos in vivo,
observou-se padrão similar de expressão entre machos e fêmeas. Assim, a incompleta ICX
pode levar ao aumento dos níveis de glicose intracelular, com acúmulo de metabólitos,
prejudicando o desenvolvimento de embriões do sexo feminino (PEIPPO et al., 2001) e
ocasionar diferenças quanto ao desenvolvimento relacionadas ao sexo em alguns sistemas
de cultivo in vitro (AVERY et al., 1991, 1992), o que pode explicar o número superior de
bezerros machos nascidos por Pive (KOCHHAR et al., 2001).
Considerando as diversas alterações epigenéticas provocadas pelo uso de
biotecnologias, atualmente, busca-se entender e aprimorar a estrutura da cromatina de
embriões no período pré-implantacional, por meio de agentes modificadores epigenéticos,
como os inibidores das HDACs e de metilação do DNA. Entre os inibidores de HDACs,
destacam-se o ácido valproico, a TSA e o butirato de sódio, que inibem de maneira
reversível a maioria das HDACs das classes I e II (ZUPKOVITZ et al., 2006). Estudos
indicam que a TSA se encaixa no sítio catalítico da enzima HDAC (MARKS et al., 2001) e
promove a hiperacetilação do DNA, que se torna excessivamente ativo na produção de
proteínas. Entre os inibidores de metilação do DNA, destaca-se o agente 5-aza-2’-
deoxicitidina (5-aza-Dc).
A TSA adicionada na etapa de fecundação in vitro promoveu aumento dos níveis de
acetilação de histonas no núcleo espermático e maior número de células na massa celular
interna do embrião (IKEDA et al., 2009). O uso da TSA durante a etapa de cultivo in vitro
da PIVE, para auxiliar a transposição à repressão da cromatina no momento da ativação
do genoma embrionário, promoveu aumento dos níveis de acetilação de histonas, mas não
influenciou a produção de blastocistos, embora os embriões de baixa qualidade tenham
sido beneficiados com o uso desse agente (OLIVEIRA et al., 2010).
Transferência nuclear de células somáticas (TNCS)
O crescente interesse pela técnica de transferência nuclear de células somáticas
(TNCS) ou por clonagem pode ser explicado por sua gama de aplicações, não só no
melhoramento genético animal (GALLI et al., 1999), mas também na propagação de
indivíduos geneticamente modificados (CIBELLI et al., 1998), na preservação de espécies
ameaçadas de extinção (WELLS et al., 1998) e na biomedicina, pela possibilidade de se
produzir órgãos e tecidos (clonagem terapêutica) (KIND; COLMAN, 1999), além de várias
outras aplicações no campo da pesquisa básica. Essa técnica é influenciada por vários
fatores, como (LIU et al., 2000):
• Fonte da célula doadora de núcleo e estádio de diferenciação celular.
• Número de repiques das células durante o cultivo celular.
• Sincronização do ciclo celular entre célula doadora e oócito receptor.
• Idade oocitária.
• Métodos de ativação celular.
• Métodos de enucleação oocitária.
• Métodos de cultivo.
Assim, modificações do protocolo de TNCS apresentam vários efeitos nos padrões de
expressão de genes relacionados, principalmente, à adaptação ao estresse, à função
trofoblástica, à metilação de DNA e à inativação do cromossomo X (WRENZYCKI et al.,
2001, 2002; WRENZYCKI; NIEMANN, 2003). Dois componentes celulares são essenciais
para produzir um clone (Figura 2):
• O núcleo doador (carioplasto).
• O oócito enucleadoreceptor (citoplasto), cuja constituição citoplasmática deve
ser suficientemente competente para permitir a reprogramação do núcleo
transferido e dar suporte ao desenvolvimento embrionário, fetal e do indivíduo.
Figura 2. Transferência nuclear de célula somática (TNCS): A) enucleação do oócito receptor: remoção do
primeiro corpúsculo polar e da placa metafásica, evidenciados sob luz ultravioleta (imagem ampliada); B)
transferência do núcleo doador ao oócito receptor enucleado.
Fotos: Simone Cristina Méo Niciura
Como consequência da resistência à reprogramação epigenética do núcleo doador,
alguns genes podem manter sua atividade de transcrição enquanto outros apresentam
padrão de expressão anormal. Problemas ligados à expressão errônea – em momentos e
em padrões não correspondentes àqueles verificados durante o desenvolvimento
embrionário normal – têm sido relatados em diversos genes e em diferentes espécies na
TNCS.
Embora existam vários relatos de avanços na clonagem, nos últimos anos, verifica-se
ainda baixa eficiência desse procedimento. A baixa viabilidade dos embriões clonados é
principalmente expressa pela redução na taxa de implantação, pelo aumento da
mortalidade fetal e perinatal, e pelas diversas anomalias observadas nos animais recém-
nascidos. Diversos estudos buscam investigar as razões pelas quais a clonagem apresenta
resultados insatisfatórios, e muitos têm destacado o papel dos eventos epigenéticos nas
falhas de desenvolvimento dos animais clonados. As alterações observadas nos clones não
são transmitidas para a prole, corroborando com a origem epigenética das falhas
observadas (ZHANG et al., 2004).
O padrão de metilação dos genes é essencial para o sucesso dos programas de
clonagem a partir de células somáticas. Os núcleos derivados de células somáticas
possuem padrão específico de metilação, diferente daquele do embrião precoce. Assim,
para que a clonagem tenha sucesso, o padrão somático de metilação deve ser apagado e
transformado em embrionário (reprogramação nuclear), sem que os genes imprinted sejam
alterados. Uma vez que isso nem sempre ocorre, defeitos no crescimento da placenta e
falhas no suprimento sanguíneo são observados em clones, tanto em decorrência das
alterações da metilação do DNA (BOURC’HIS et al., 2001; DEAN et al., 2001) como da
expressão anormal de genes imprinted (NIEMANN et al., 2002; RIDEOUT III et al., 2001).
Foi observada redução de expressão de IGF2 e de IGF2R em fetos e em placentas
de clones bovinos (PERECIN et al., 2009) e de H19 e de IGF2 em placenta de clones
bovinos a termo (YAMAZAKI, 2006). A redução da expressão do H19 foi ainda mais
marcante na placenta de fêmeas, o que sugere que o processo de reprogramação de
alguns genes na TNCS possa ser influenciado pelo sexo do concepto (YAMAZAKI, 2006).
De acordo com o que foi visto no Capítulo 7, após a fecundação, há desmetilação
global do genoma, exceto dos genes imprinted, seguida de metilação de novo durante o
desenvolvimento embrionário inicial. Em embriões clonados (Figura 3), foi relatada redução
no grau de desmetilação durante o desenvolvimento inicial, e a nova onda de metilação
ocorreu mais precocemente, se comparada a embriões normais (BOURC’HIS et al., 2001;
DEAN et al., 2001). Assim, ao comparar essa figura com a Figura 4 do Capítulo 7, vê-se
que, enquanto nos embriões bovinos normais a desmetilação do genoma materno e
paterno é total, e a metilação de novo ocorre nos estádios de oito-a-dezesseis-células, nos
embriões clonados, a desmetilação não é completa e a metilação de novo ocorre no
estádio de quatro-células (DEAN et al., 2003).
Figura 3. Desmetilação ativa e metilação de novo precoce do genoma do núcleo doador em embriões bovinos
clonados por transferência nuclear de células somática.
Fonte: modificado de Mann e Bartolomei (2002).
Outros padrões epigenéticos errôneos têm sido observados em embriões clonados,
como:
• Hipermetilação do DNA do trofoblasto no estádio de blastocisto (YANG et al.,
2007).
• Aumento dos níveis de metilação da histona H3K9.
• Alterações no padrão de acetilação de histonas (SANTOS et al., 2003).
A inativação do cromossomo X também pode ser afetada durante o processo de
reprogramação nuclear. Embora a inativação do X em embriões clonados seja
aparentemente aleatória na massa celular interna (MCI), tem-se observado na placenta
expressão aberrante de genes ligados ao X (YANG et al., 2007). Em estádios mais tardios
do desenvolvimento, observou-se, na placenta de clones mortos, a expressão bialélica de
genes ligados ao X, sinalizando a ausência da inativação de um dos cromossomos X
(SMITH et al., 2005).
Considerando que muitas vezes a remodelação nuclear em clones não é completa,
estratégias que facilitem a abertura da cromatina podem ser interessantes para melhorar a
eficiência da reprogramação. Em bovinos, tanto o tratamento das células doadoras de
núcleo (ENRIGHT et al., 2003), quanto dos embriões reconstituídos (DING et al., 2008;
IAGER et al., 2008) com a TSA, foi benéfico para o desenvolvimento de clones. Sabe-se
que a eficiência da clonagem é inversamente proporcional ao grau de diferenciação da
célula doadora de núcleo, ou seja, quanto mais indiferenciado for o núcleo transferido,
maior a propensão ao remodelamento e à consequente reprogramação (BLELLOCH et al.,
2006). Kishigami et al. (2006) verificaram que embora a TSA tenha aumentado,
consideravelmente, a produção de blastocistos reconstituídos com células do cumulus, não
houve diferenças significativas quando os embriões foram reconstituídos com células-
tronco embrionárias, mostrando que a inibição das HDACs não beneficia as células
doadoras indiferenciadas. Esses resultados corroboram com a hipótese de falhas
epigenéticas na técnica de TN, quando são usadas células somáticas.
Além de bovinos, o uso de inibidores de HDACs beneficiou a reprogramação
epigenética do núcleo transferido em diferentes espécies, incluindo camundongos
(KISHIGAMI et al., 2006), coelhos (SHI et al., 2008) e suínos (LI et al., 2008). Em suínos,
além do aumento nos níveis de acetilação da H3K14 em embriões reconstituídos por TN
(MARTINEZ-DIAZ et al., 2010), observou-se aumento do número de células embrionárias
quando a TSA foi usada após o processo de ativação artificial.
Outros inibidores de HDACs também foram usados em clones, como o ácido valproico
(MIOSHI et al., 2010); o scriptaid (6-(1,3-dioxo-1H, 3H-benzol [de] isoquinolin-2-il)-ácido
hidroxiamido hexanoico) (ZHAO et al., 2010) e o butirato de sódio (DAS et al., 2010) e
promoveram aumento na acetilação global das histonas, o que pode facilitar a transcrição
gênica (COSTA-BORGES et al., 2011) de células embrionárias quando a TSA foi utilizada
após o processo de ativação artificial.
A prevenção de outros erros epigenéticos, como a hipermetilação do DNA,
proporcionou incrementos nas taxas de eficiência da clonagem em animais. O pré-
tratamento de células doadoras de núcleo com 5-aza-Dc, que por sua vez inibe a metilação
do DNA, melhorou as taxas de desenvolvimento de embriões reconstituídos por TN (SHI et
al., 2003). Por sua vez, em suínos, Huan et al. (2013) só observaram efeito benéfico do
tratamento com 5-aza-Dc em embriões clones, mas não em células doadoras de núcleo,
provavelmente porque nas células doadoras não existem as proteínas PGC7/Dppa3/Stella,
que protegem os genes imprinted (ver Capítulo 7), podendo levar a erros de imprinting.
Em bovinos, Ding et al. (2008) demonstraram que a combinação da TSA com a 5-aza-
Dc resultou em maior produção de blastocistos e número de células embrionárias,
sugerindo que a associação de agentes promotores de hiperacetilação de histonas e de
agentes desmetilantes é benéfica para reprogramar embriões clones.
Cultivo de células-tronco embrionárias
As células-tronco embrionárias (ESCs), do inglês, embryonic stem cells, são células
pluripotentes oriundas da MCI ou de blastômerosde mórulas pré-compactação
(EISTETTER, 1989; STRELCHENKO; STICE, 1994). As ESCs constituem importante
ferramenta na biologia básica, servindo como modelo experimental dos processos de
desenvolvimento embrionário inicial e diferenciação celular (NICHOLS et al., 1990). Além
disso, as ESCs apresentam inúmeras possibilidades de aplicação, como terapia celular,
manipulação de características genéticas (desejáveis ou não), além de constituírem
importante modelo para estudo de efeitos de substâncias mutagênicas, embriotóxicas ou
teratogênicas no desenvolvimento embrionário inicial.
Modelos animais têm demonstrado que as ESCs podem se diferenciar em células e
em tecidos aplicáveis ao tratamento de uma variedade de doenças, como mal de
Parkinson, esclerose múltipla, doenças cardíacas e câncer (SUNDE; EFTEDAL, 2001).
Além disso, há demonstrações de que ESCs de camundongos podem diferenciar-se em:
• Células produtoras de insulina (ROCHE et al., 2003).
• Células epiteliais da córnea (YU et al., 2001).
• Cardiomiócitos (SACHINIDIS et al., 2002).
• Células endoteliais (BALCONI et al., 2000).
• Oócitos (HUBNER, 2003).
De acordo com características descritas para camundongos, ESCs são células
pequenas, com as seguintes características:
• Núcleo grande e citoplasma pequeno.
• Tendência a formar colônias.
• Capacidade de diferenciação celular in vitro (formação de corpos embriônicos) e
in vivo (teratocarcinomas).
• Capacidade de produzir um ser vivo por quimerismo (CHERNY et al., 1994) ou
por clonagem (CIBELLI et al., 1998; SAITO et al., 1992).
Diferentemente dos padrões específicos de expressão obser​vados em células
diferenciadas, as ESCs são definidas pelo potencial que apresentam em ativar todos os
programas de expressão gênica encontrados em linhagens de células embrionárias ou
adultas (CHAMBERS; SMITH, 2004). Vários estudos têm procurado entender os
mecanismos moleculares que fornecem às ESCs essas propriedades, sendo que dois
fatores de transcrição mostraram-se essenciais na manutenção do estado indiferenciado
das ESC:
• OCT 3/4 (NIWA et al., 2000).
• NANOG (CHAMBERS et al., 2003; MITSUI et al., 2003).
Para se desenvolver terapias celulares eficazes, primeiramente devem-se estabelecer
protocolos de diferenciação in vitro e purificação dessas células. Contudo, a natureza
heterogênea da diferenciação celular durante o cultivo in vitro tem dificultado o uso das
células derivadas de ESCs em estudos de transplantes (ODORICO et al., 2001), pois
durante a diferenciação das ESCs, ocorrem alterações morfológicas e de expressão
gênica ao longo do tempo e de maneira tecido-específicas.
Estudos recentes mostram que mecanismos epigenéticos são de importância vital
para a natureza pluripotente das ESCs, pois participam, ativamente, na regulação da
diferenciação celular (ATKINSON; ARMSTRONG, 2008). A natureza epigenética das ESCs
tem demonstrado ser única e suas características estão fortemente ligadas à
permissividade global da expressão gênica e à pluripotência.
De acordo com o que já foi abordado no Capítulo 7, o genoma passa por importantes
alterações epigenéticas durante o desenvolvimento embrionário inicial. Essas alterações
também ocorrem durante a diferenciação das ESCs, havendo a transição de um ambiente
rico em eucromatina nas ESCs para um ambiente contendo estruturas mais compactas,
heterocromáticas, após a diferenciação (FRANCASTEL et al., 2000).
Ao longo do desenvolvimento, os níveis de transcrição de diversos genes são bastante
alterados de forma temporal, e as modificações pós-traducionais nas histonas participam
na regulação da expressão gênica local e global (HUEBERT; BERNSTEIN, 2005). Em
camundongos, demonstrou-se que marcadores heterocromáticos mudam de uma
localização dispersa nas ESCs pluripotentes, para outra mais concentrada em distintos
focos nas células diferenciadas. Em se tratando de ESCs pluripotentes, a arquitetura
nuclear apresenta-se globalmente descondensada, ocorrendo nova condensação por
ocasião da diferenciação, com aumento dos níveis globais de H3K9me3, uma marca
repressiva, e diminuição dos níveis de acetilação das histonas H3 e H4, que são
modificações ligadas à permissividade de expressão gênica (MESHORER et al., 2006).
Observou-se que regiões de genes relacionados à pluripotência, como OCT4,
NANOG, UTF1, FOXD3, CRIPTO e REX1, apresentam maior acessibilidade nas células
indiferenciadas, enquanto encontram-se mais condensadas após a diferenciação (PERRY
et al., 2004). Por sua vez, quando genes tecido-específicos, como PAX3, PAX6, IRX3,
NKX2.9 e MASH1, foram avaliados, estes mostraram-se transcricionalmente inativos nas
células ESCs pluripotentes e ativos após o processo de diferenciação.
Conforme mencionado anteriormente, as modificações pós-traducionais nas histonas
estão fortemente ligadas ao processo de diferenciação. Enzimas HDACs classe II, por
exemplo, são altamente expressas no músculo esquelético e cardíaco (FISCHLE et al.,
2001). Além disso, a desacetilação de histonas está envolvida na repressão de genes
neuronais em células que seguem especificações diferentes dos neurônios (CHONG et al.,
1995). Assim, a TSA, inibidora das enzimas desacetilases, é usada em estudos sobre
modificações epigenéticas em ESCs e leva a modificações no perfil de expressão gênica
das ESCs semelhantes àquelas ocorridas durante a diferenciação inicial (MCCOOL et al.,
2007).
As pesquisas de Bernstein et al. (2006) também mostraram correlação entre o
ambiente da cromatina e a sequência de DNA subjacente, sugerindo um mecanismo pelo
qual a sequência de DNA possa determinar os padrões de modificações de histonas. Em
ESCs, há notável correlação entre a presença de H3K4me, ilhas CpG e sítios de início de
transcrição.
A CARM1, uma metiltransferase de arginina, associada aos pro​motores dos genes
OCT4 e SOX2, mantém as características de autorrenovação e pluripotência celular das
ESCs (WU et al., 2009). Assim, percebe-se que a manipulação da informação epigenética
pode influenciar na determinação do destino ou do comprometimento celular. Evidências
sugerem que redes epigenéticas e de transcrição estão interligadas nas ESCs. A estrutura
da cromatina do loco NANOG – que também inclui outros genes associados à
pluripotência, como APOBEC, GDF3 e DPPA3 – tem sido mostrada como dependente do
OCT4 (LEVASSEUR et al., 2008). Além disso, estudos apontam para vários fatores que
interagem com OCT4, muitos dos quais proteínas associadas à cromatina (PARDO et al.,
2010; BERG et al., 2010), como subunidades de NURD, SWI/SNF e complexos de
desmetilase 1 lisina-específica (LSD1), INO80, FACT, histonas centrais e helicases.
Produção de células-tronco pluripotentes induzidas
Conforme discutido anteriormente, as ESCs podem ser empregadas no tratamento de
algumas doenças em humanos. Entretanto, sua obtenção implica em questões éticas, pois
requer o uso de embriões, bem como em problemas de rejeição tecidual após o
transplante. Recentemente, tem-se trabalhado com uma alternativa promissora, que é a
geração de células pluripotentes a partir de células somáticas do próprio paciente, como
queratinócitos, células mesenquimais da gordura, mucosa oral, polpa dentária, sangue
periférico, cordão umbilical e fibroblastos da pele (WATANABE et al., 2013). A
reprogramação de células adultas a um estado pluripotente permite a geração de células-
tronco específicas do paciente, apresentando enorme potencial para o tratamento de
doenças degenerativas (YAMANAKA, 2007).
Células somáticas podem ser reprogramadas pela transferência do conteúdo de seu
núcleo para oócitos enucleados, na TNCS (WILMUT et al., 1997) ou pela fusão com
células-tronco embrionárias (TADA et al., 2001), indicando que oócitos e ESCs contêm
fatores que podem conferir pluripotência às células somáticas.
As células somáticas são induzidas a modificar seu programa de expressão gênica
pela ação de alguns fatores