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1 Microbiologia 2010/2011 É uma ciência relativamente recente, que estuda os seres vivos de dimensões microscópicas. Foi reconhecida em meados do séc. XIX com as importantes experiências de Louis Pasteur e Robert Koch. Deve-se a Anton van Leeuwenhoek, um holandês mercador de tecidos, as 1ªs observações feitas em diversos líquidos e produtos biológicos que continham seres minúsculos a que se chamou animacules. Dois estudiosos alemães – o botânico Mathias Schleiden e o médico e zoologista Theodor Schwamm – formularam a Teoria Celular. Segundo a qual todos os seres vivos são constituídos por células, sendo estas unidades morfológicas e funcionais, fundamentais à vida. Através de cortes finos de cortiça, Hooke disse que as células são as unidades básicas de organização de todos os seres vivos. IMPORTÂNCIA DA MICROBIOLOGIA: Saúde: Produtores de medicamentos (antibióticos, insulina, vacinas); Produtores de vitaminas e alimentos; Agentes causadores de doenças (tuberculose, cólera, salmonelose, dermatomicoses, gripe, sarampo, paludismo, ficotoxinas). Agricultura: Agentes causadores de doenças em plantas; Controlo biológico de pragas (utilização de fungos para destruição de pulgões); Micorrizas. Figura 1: esquema de um dos microscópios; a – lente; b – parafuso de fixação; c e d parafusos de focagem. Figura 2: Bactérias da boca humana desenhadas por Leeuwenhoek. O ponteado representa o movimento observado 2 Indústria Produtores de substâncias (álcool, ácido cítrico, acético, enzimas); Transformação de produtos (pão, iogurte, queijo, vinho, cerveja, produtos de salsicharia); Fontes de alimentos (leveduras, fungos). Ambiente Produtores primários de matéria orgânica; Agentes de degradação de desperdícios orgânicos (derrames de hidrocarbonetos no mar e em solos); Participação nos ciclos biogeoquímicos; Degradadores de herbicidas e insecticidas. A utilização dos microrganismos oferece as seguintes vantagens: Fácil crescimento: (frascos, tubos de ensaio); Facilidade de conservação e manutenção em espaços reduzidos, a baixos custos; Facilidade de manipulação em termos nutricionais; Possibilidade de reprodução das exigências de crescimento em laboratório; Crescem e reproduzem-se a taxas elevadas (há bactérias que realizam 100 gerações em 24 horas); Processos bioquímicos idênticos aos de todas as outras formas de vida; Utilizam como fonte de energia a energia radiante ou derivada de substâncias sintetizadas por outros organismos; Constituem o único sistema biológico na tecnologia do DNA recombinante: o genoma microbiano pode ser alterado com o objectivo de obter um produto que não se encontrava codificado no genoma do microrganismo. ORIGEM DOS MICRORGANISMOS A existência dos microrganismos levantava a questão da sua origem. Surgiram duas escolas de pensamento para explicar a origem dos microrganismos.: Abiogénse - Os que admitiam que os microrganismos eram o resultado da decomposição de tecidos animais e vegetais (fermentação ou putrefacção); ou seja, os microrganismos eram o resultado de mudanças desses tecidos. A vida surge a partir de matéria morta em decomposição; um conceito de geração espontânea. Biogénese - Os que defendiam que os animálculos de Leeuwenhoek tinham origem nos seus progenitores, como em formas de vida superiores; à ideia da geração de descendência denominou-se biogénese. A Microbiologia só se desenvolveu quando a teoria da geração espontânea foi desacreditada. 3 Biogénse vs Abiogénese Na Grécia Antiga, pensava-se que rãs e vermes surgiam espontaneamente da lama dos lagos e rios. Outros acreditavam que larvas e moscas surgiam espontaneamente na carne em decomposição. Existiram receitas para produzir ratos; colocar trapos em recipientes e colocá- los em locais afastados durante várias semanas. o Francesco Redi (1626-1697), levou a cabo experiências que procuraram demonstrar a origem da presença de vermes na carne que utilizava nas suas demonstrações, e também da sua ausência. Se a carne fosse exposta ao ar e ao calor, os vermes surgiriam na matéria orgânica em decomposição. Se, porém, colocasse gaze sobre a carne, tais vermes não se formavam sobre a carne, mas sobre a rede, pois era aí que as moscas depositavam os seus ovos, atraídas pelo odor da carne. o John Needham (1713-1781) conduziu experiências que fizeram acreditar na geração espontânea após a destruição de microrganismos inicialmente presentes na carne previamente fervida, aqueles voltavam a aparecer quando a carne era novamente colocada em frascos abertos. o Lazzaro Spallanzani (1729-1799) conseguiu demonstrar que uma infusão de carne parecia inalterável se, previamente fervida em recipiente fechado, fosse nele conservada encerrada. o Franz Schulze (1815-1873) introduz ar em frascos contendo caldo fervido de carne, depois de previamente o fazer passar através de soluções ácidas. o Theodor Schwamm (1810-1882) realiza idêntica experiência, utilizando porém ar que previamente fez passar por tubos aquecidos as rubro para recipientes contendo caldo estéril. Em nenhum destes dois casos se desenvolveram microrganismos. Os apoiantes da geração espontânea argumentaram que o ácido e o calor alteraram o ar, que dessa forma não podia suportar o crescimento microbiano.Em 1854, Schroder e von Dusch fizeram passar o ar através de um tubo com algodão. O ar não foi «alterado» e os microrganismos não se desenvolveram. Para os defensores da abiogénese, a utilização do calor para esterilizar o ar ou espécimes levava à destruição da «força vital» necessária ao aparecimento espontâneo dos microrganismos. Louis Pasteur usou um balão munido com um tubo curvo, longo e estreito. Cozeu o caldo de carne, nos balões, durante uma hora. Os microrganismos depositavam-se na curva do tubo; não se desenvolveram no caldo. John Tyndall através de uma caixa fechada onde fazia entrar o ar através de tubos com curvaturas, provou que a poeira transporta microrganismos. Na ausência de poeira o caldo permanecia estéril. As experiências desenvolvidas por estes dois cientistas conduziram à aceitação da teoria da biogénese. 4 IMUNIZAÇÃO Pasteur (1880) isolou a bactéria responsável pela cólera aviária. Descobriu a imunização: processo que estimula o organismo a defender-se contra as infecções. Culturas velhas tornam-se avirulentas. Culturas avirulentas estimulam o organismo a defender-se contra as infecções. Organismos infectados com culturas avirulentas tornam-se imunes à doença. Pasteur e os seus colaboradores prepararam a vacina contra a raiva. TEORIA MICROBIANA DA FERMENTAÇÃO Pasteur provou que os produtos da fermentação do sumo da uva resultavam da actividade de microrganismos. Os defensores da teoria da abiogénese pensavam que a fermentação produzia os microrganismos. Pasteur verificou que lotes de vinhos bons e maus diferiam no tipo de microrganismos presentes. Destruiu os microrganismos dos mostos, por aquecimento a 50-60ºC (pasteurização). Para obter bons vinhos, adicionou vinho de boa qualidade a mostos submetidos a aquecimento TEORIA MICROBIANA DA DOENÇA Girolamo Fracastoro (1546) - Doenças podiam ser devidas a organismos invisíveis, transmitidos de uma pessoa a outr. Anton von Plenciz (1762) - Microrganismos diferentes eram responsáveis por doenças diferentes. Robert Koch e colaboradores: Descreveram bactérias causadoras do carbúnculo, cólera, tuberculose, febre tifóide, difteria, tétano, pneumonia, entre outras. Desenvolveram técnicas quepermitiram o crescimento e isolamento de microrganismos. Utilizaram corantes para observação e bactérias ao microscópio óptico. Desenvolveram meios de cultura de acordo com as exigências nutricionais dos microrganismos. Utilizaram agar para solidificar meios de cultura. Aprenderam a cultivar microrganismos específicos em cultura pura. Richard J. Petri, inventou a caixa de Petri. Com base nos seus trabalhos, Koch definiu um conjunto de princípios – POSTULADOS DE KOCH: Um microrganismo específico deve estar sempre associado a cada caso de doença; O microrganismo suspeito deve ser isolado e deve ser capaz de crescer em cultura pura, em laboratório; A inoculação daquela cultura deve ser capaz de produzir a mesma doença num animal susceptível; O mesmo organismo deve ser isolado a partir do animal doente. 5 ORGANIZAÇÃO ESTRUTURAL DE MICRORGANISMOS Células Procarióticas Forma Agrupamento As bactérias apresentam uma grande diversidade morfológica: Forma Agrupamento: ESFÉRICA COCOS Pares: diplococos Cadeias: estreptococos Cachos: estafilococos Cubos: sarcinas Tétradas CILÍNDRICA BACILOS Pares: diplobacilos Cadeias: estreptobacilos Paliçadas Filamentos Micélio HELICOIDAL RÍGIDA Vírgula: vibriões Espiral ondulada: espirilos HELICOIDAL FLEXÍVEL Espiral enrolada: espiroquetas IRREGULARES Parede Celular Funções: o Suporte; mantém a forma característica da célula. o Protecção contra a lise da célula por osmose. o Protecção contra a acção de substâncias tóxicas. o Contribuição para a patogenicidade de determinadas bactérias. 6 Composição Química: o Arquebactérias: proteínas, glicoproteínas, polissacáridos, pseudomureina (polímero que não se encontrou em nenhum outro ser vivo) o Eubactérias: peptidoglicano (ou mureína). Polímero constituído por moléculas de: Ácido diaminopimélico (DPA) Ácido murâmico Ácido teicóico (só existe nas células Gram +) Aminoácidos Hidratos de carbono Lípidos A parede celular, estruturada sob o controlo genético, também é responsável pela morfologia bacteriana e pelo duplo comportamento das bactérias em relação à coloração de Gram. A coloração de Gram tem um grande significado taxonómico, pois permite dividir as bactérias em 2 grupos: Gram-positivo Gram negativo Tomam a cor arroxeada, conferida pelo corante primáro (violeta- cristal). Não tem lípidos na PC. Resistem à descoloração com acetona. Tomam a cor de vermelho (fucsina básica). Têm lípidos na PC. Perdem durante a descoloração com acetona, o corante primário e tomam posteriormente a cor vermelha do segundo corante (fucsina). Distinção das bactérias através da PC: Características Gram + Gram - Ácido-resistente Peptidoglicano Camada espessa Camada fina Quantidade pequena Ácido teicóico Presente Ausente Ausente Lípidos Muito pouco Lipopolissacáridos Ceras e glicolípidos Mb externa Ausente Presente Ausente Espaço Ausente Presente Ausente periplásmico Forma da célula Rígida Rígida ou flexível Rígida ou flexível Sensibilidade Mais sensível Moderada Menos sensível aos antibióticos Controlo de microrganismos por danos na parede celular: Uso de penicilina: A presença deste antibiótico durante a divisão celular impede a formação completa da parede celular, o que leva à morte dos microrganismos. A lisozima, encontrada nas lágrimas, digere o peptidoglicano; o que constitui uma defesa do organismo contra as infecções dos olhos. Corante primário: Mordente: Descoloração: Corante de contraste: 7 Membrana externa Constitui a parte mais externa da parede celular e está ligada ao peptidoglicano por uma camada quase contínua de pequenas moléculas de lipoproteínas. As bactérias Gram - possuem nesta membrana lipopolissacáridos (LPS), também denominados endotoxinas. Este componente faz com que as bactérias Gram - , sejam frequentemente tóxicas, ex. Salmonella e E. coli. Espaço Perisplásmico • Bactérias Gram + Intervalo entre a parede celular e a membrana citoplasmática. • Bactérias Gram - Intervalo entre a membrana externa e a membrana citoplasmática. • Encontra-se preenchido pelo periplasma: uma rede frouxa de peptidoglicano, enzimas digestivas, proteínas de transporte e metabólitos. • Estes espaços são raramente encontrados em bactérias Gram +. Membrana Citolpasmática A MC, estrutura que rodeia o citolplasma é constituída por uma bicamada fosfolípídica, onde se inserem as proteínas periféricas e as integrais. Composição química: Fosfolípidos (20-30%); Proteínas (50-70%); Não contém esteróis. Funções: Funciona como estrutura de permeabilidade selectiva, sendo geralmente permeável a moléculas lipofílicas e impermeável a moléculas hidrofílicas; Desempenha funções biossintéticas (peptidoglicano) e bioenergéticas (metabolismo oxidativo); As proteínas presentes na membrana transportam moléculas para o citoplasma; Produção de energia. As membranas das arqueobactérias possuem ligações tipo éter que são mais fortes que as do tipo éster das eubactérias. Citolplasma É constituído por água (80%), ácido nucleico, enzimas e outras proteínas, HC, lípidos e iões inorgânicos. Muitas reacções, quer anabólicas quer catabólicas ocorrem no citoplasma. No citoplasma encontra-se os ribossomas, um nucleóide e vacúolos. Ribossomas Composição: Ácido ribonucleico e proteínas. Tamanho: Avaliado por taxas de sedimentação expressas em unidades de Svedberg (S), que variam geralmente com o tamanho molecular. Os ribossomas bacterianos têm uma taxa de 70S e as suas sub-unidades 30S e 50S. Antibióticos como a eritromicina e a estreptomicina, ligam-se especificamente aos ribossomas 70S e interrompem a síntese proteica. Estes antibióticos não afectam os ribossomas 80S das células eucarióticas. Função: Partículas onde se realiza a síntese das proteínas. 8 Nucleóide Nos procariotas, a informação genética não está contida num organelo especializado, não existindo, portanto, um verdadeiro núcleo como nas células eucariotas. A maior parte da informação genética dos procariotas ocorre num cromossoma que contém uma única macromolécula circular de DNA. Associado ao DNA existe também algum RNA e proteína. Algumas bactérias contêm moléculas pequenas circulares de DNA: os plasmídeos. Os plasmídeos podem replicar-se independentemente do cromossoma ou integrarem-se nele. A informação genética no plasmídeo complementa a informação no cromossoma. • Mesossomas - Invaginações da membrana citoplasmática, na forma de vesículas, túbulos ou lamelas que ocorrem principalmente em bactérias Gram+. Pensa-se actualmente que não se trata de verdadeiras estruturas mas sim artefactos criados durante a preparação de espécimens para observação ao microscópio electrónico. • Cromatóforos - Existem em bactérias fotossintéticas e nas cianobactérias e contêm pigmentos. Inclusões o Grânulos - Não se encontram delimitados por membranas, no entanto assubstâncias encontram-se tão densamente compactadas que não se dissolvem facilmente no citoplasma. Ex. cianoficina, polifosfato (volutina), ou glicogénio e amido. o Vesículas ou vacúolos - Estas estruturas encontram delimitadas por membranas. Bactérias aquáticas fotossintéticas e cianobactérias usam os vacúolos para controlar a profundidade de flutuação de acordo com a intensidade da luz, concentração em oxigénio e nutrientes. o Outras bactérias (magnetotácticas) apresentam cristais de óxidos ou de sulfuretos de ferro (magnetossomas), que lhes conferem capacidade de se alinharem segundo o norte-sul magnético. Estruturas externas: Flagelos. Fímbrias. Cápsulas. FLAGELOS Composição química dos filamentos: flagelina Função: mobilidade Estrutura: o Corpo basal: formado por uma haste central inserida na bactéria e uma série de anéis. o Anéis: rodeiam a haste central e imprimem movimento giratório ao filamento. o Nas bactérias Gram - : Um par de anéis fixos à membrana citoplasmática e outro à parede celular. 9 o Nas bactérias Gram + : Um par fixo à membrana citoplasmática. o Gancho: estrutura encurvada que imprime o movimento giratório ao longo do eixo do filamento. o Filamento: apêndice que se liga ao gancho e realiza a impulsão. Crescimento a partir da extremidade. Disposição: Polar - flagelos nas extremidades Monotrico - um só flagelo Anfítrico - um flagelo polar em cada extremidade Lofotríco - um tufo de flagelos polares Perítrico - flagelos distribuídos por toda a superfície da bactéria. Filamentos axiais ou endoflagelo: flagelo periplásmico. Existe por exemplo nas espiroquetas (Treponema pallidum) Raramente ocorrem nos cocos FÍMBRIAS e PILI Fímbrias: filamentos mais finos, curtos e numerosos que os flagelos. Cobrem a superfície essencialmente de bactérias Gram - . Função: aderência entre células e a superfícies. Pili: estruturalmente semelhantes às fímbrias, menos numerosos, mais compridos. Função: troca de material genético durante a conjugação e adsorção de vírus. Glicocálice Camada que envolve a parede celular de algumas bactérias. Esta camada pode apresentar-se sob uma forma organizada (cápsula) ou sem forma definida (camada viscosa). Constituída essencialmente por polissacáridos. Funções: Aderência, protecção, reserva de alimentos e concentração de excreções. DIFERENCIAÇÃO CELULAR EM BACTÉRIAS Endósporos Formas de resistência que correspondem a estados de repouso. Apresentam quantidades muito reduzidas de água e grandes quantidades de ácido dipicolínico (não existe nas células vegetativas) e iões de cálcio, o que confere ao endósporo grande resistência aos agentes físicos e químicos. Produz-se um endósporo por bactéria. 10 Comuns em espécies dos géneros Bacillus e Clostridium. Permanecem viáveis por períodos de tempo muito longos. Heterocisto Célula especializada que se encontra nas cianobactérias fixadoras de azoto. As paredes do heterocisto são grossas, sem clorofila, o que lhe dá um aspeto descorado. É o local onde se fixa o azoto ou nitrogénio, por meio da enzima nitrogenase. Os heterocistos estão ligados por plasmodesmos que rodeiam as células e de que dependem para a nutrição. Bacteróides Género de bacilos Gram-negativos, anaeróbios, que inclui várias espécies patogénicas para o homem, responsáveis por diversas infecções (supurações gangrenosas, infecções respiratórias, urinárias, septicemia). Células Eucarióticas 11 12 NUTRIÇÃO E CRESCIMENTO Os microrganismos podem ser encontrados em praticamente todos os ambientes existentes na Terra, incluindo aqueles em que nenhuma outra forma de vida pode sobreviver. São muito versáteis e diversificados quanto às suas necessidades nutritivas. As taxas de crescimento dos microrganismos são influenciadas por uma variedade de factores físico e químicos. Factores Físicos o pH O pH afecta de forma muito marcada o crescimento microbiano. Cada espécie de intervalo de pH, assim como um valor de pH óptimo, à qual a taxa especifica de crescimento é máxima. Os acidófilos apresentam um crescimento óptimo para valores de pH entre 0/1 – 5,5. Os neutrófilos apresentam um crescimento óptimo para valores de pH entre 5,5 – 8,0. Os alcalófilos apresentam um crescimento óptimo para valores de pH entre 8,5 – 11,5. Os alcalófilos extremos apresentam um crescimento óptimo para valores de pH >/= 10. o Temperatura A TºC constitui um dos mais importantes, se não o mais importante factor ambiental que afecta o crescimento dos microrganismos. Apesar de a TºC afectar todos os organismos, os microrganismos unicelulares são particularmente sensíveis a este factor ambiental. Quando a TºC aumenta, as reacções enzimáticas passam a efectuar-se a velocidades maiores, o metabolismo celular torna-se, por isso, mais activo e o crescimento mais rápido. No entanto, acima de certos valores de TºC ocorre a desnaturação. o Oxigénio Os microrganismos diferem bastante quando às suas necessidades, ou tolerâncias, ao O2, podendo dividir-se em vários grupos com base nos seus comportamentos em relação ao O2. o Pressão hidrostática Bactérias que suportam elevados valores de pressão hidrostática, denominam-se barófilas. Nestes microrganismos a manutenção da estrutura tridimensional das enzimas só é conseguida quando a pressão é elevada. Caso contrário as enzimas perdem a sua forma e desnaturam. 13 o Radiações Raios gama e luz ultravioleta, podem produzir mutações e mesmo destruir organismos. Alguns microrganismos possuem pigmentos que os protegem das radiações e impedem a danificação do DNA. Outros têm enzimas capazes de reparar certos danos causados no DNA. Factores Nutricionais O crescimento é um processo dinâmico que requer energia e nutrientes para a síntese de componentes e manutenção celular. Alguns nutrientes são necessários aos microrganismos, tais como: • CARBONO • AZOTO • ENXOFRE • FÓSFORO • VITAMINAS • SAIS MINERAIS O Carbono constitui um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano, podendo ser utilizada sob a forma inorgânica (autotrofismo) ou orgânica (heterotrofismo). Autotróficos: utilizam o CO2 como a principal ou única fonte de carbono. Heterotróficos: utilizam compostos orgânicos absorvendo-os do ambiente ou através da ingestão de outros microrganismos. Ambos podem obter energia a partir da glicose via: o FERMENTAÇÃO o CICLO DE KREBS Azoto Essencial para todos os seres vivos. Constituinte de aminoácidos e proteínas. As bactérias podem utilizar o N através de: Fixação do azoto atmosférico Compostos inorgânicos: nitratos, nitritos e sais de amónio. Compostos orgânicos: aminoácidos, peptídeos. Alguns microrganismos são capazes de sintetizar os 20 aminoácidos encontrados nas proteínas, enquanto que outros necessitam que alguns aminoácidos lhes sejam fornecidos 14 através do meio de cultura. Os microrganismos fastidiosos necessitam que todos os aminoácidos essenciais estejam presentes no meio de cultura. Enxofre e Fósforo O enxofre pode ser obtido pelos microrganismos através dos sais inorgânicos e aminoácidos. O fósforo é obtido principalmente de iões inorgânicos (PO4 3-). Os microrganismos necessitam de pequenas quantidades de Cobre, Ferro, Zinco, Cobalto, Sódio, geralmente sob a forma iónica. O Potássio, o Zinco, o Magnésioe o Manganésio são necessários para activar determinadas enzimas. O Cálcio é utilizado pelas bactérias Gram + na síntese da parede celular e por microrganismos produtores de esporos para a formação dos mesmos. Vitaminas Muitos microrganismos produzem as suas próprias vitaminas. Outros pelo facto de não possuírem enzimas para a síntese das vitaminas têm necessidade que estas lhes sejam fornecidas pelos meios de cultura. O ácido fólico, vitamina B12 e vitamina K são as requeridas por alguns microrganismos. Alguns microrganismos do intestino humano sintetizam a vitamina K e algumas vitaminas do complexo B. Os microrganismos que possuem um grande número de enzimas têm capacidade de sintetizar a maior parte das substâncias que necessitam. Adaptações à carência de nutrientes Síntese de maiores quantidades de enzima de forma a obter e metabolizar maiores quantidades de nutrientes. Síntese de enzimas que permitam usar outros nutrientes que existam no meio em maiores quantidades. Decréscimo das taxas de metabolismo e crescimento. 15 CRESCIMENTO E REPRODUÇÃO Formas de Reprodução o EUCARIOTAS Assexuada: Indivíduos originados a partir de um único progenitor. Mais eficaz na propagação das espécies do que a reprodução sexuada. Antecedida de mitose. Cada célula filha tem exactamente o mesmo número de cromossomas e a mesma constituição genética que a célula-mãe. Sexuada: Fusão de duas células (gâmetas) e formação de uma célula fertilizada (ovo). o PROCARIOTAS A maioria multiplica-se assexuadamente por divisão binária transversa: Duplicação do volume celular Replicação do nucleoide Distensão da membrana citoplasmática Individualização do material nuclear Invaginação da célula e distribuição do material genético pelas duas metades da célula Formação de um septo e reorganização do material celular de cada célula Separação das células: o Completa o Incompleta: cadeias, tétradas, sarcinas, cachos. Outras formas de divisão Gemulação: reprodução assexuada na qual a nova célula se desenvolve a partir da superfície da célula - mãe, formando um gomo ou gema, que se separa posteriomente. Fragmentação: divisão de filamentos em pequenos bastonetes ou cocos. Esporulação (exógena): formação de esporos em cadeia a partir da extremidade das hifas. O crescimento microbiano é definido pelo aumento do nº de indivíduos de uma população e não pelo aumento do tamanho de uma célula individual. No entanto, o crescimento celular implica a divisão celular (por fissão binária ou por gemulação) que, por sua vez, requer um aumento do tamanho celular e a sua partição pelas duas células resultantes da divisão da célula parental. 16 O intervalo de tempo necessário para a formação de duas células, e por consequência, para a duplicação da população é designado por tempo de geração. Depende: espécie condições físicas de incubação disponibilidade de nutrientes o Escherichia coli 12,5 minutos o Mycobacterium tuberculosis 13 -15 horas T = taxa de crescimento: número de gerações por unidade de tempo T = n / t Crescimento exponencial: o aumento da população faz-se em progressão geométrica. Determinação do tempo de geração N0 = Número de bactérias no momento zero; população inicial Nt = Número de bactérias no tempo t t = período de tempo n = número de gerações no tempo t Nt = N0 x 2 n log Nt = log N0 + n log 2 n = log Nt - log N0 / log 2 log 2 = 0,301 n = 3,3 (log Nt - log N0) Reprodução por fissão binária: 1 2 4 8 16 32 ...... 1 21 22 23 24 25 ............. 2n n = número de gerações 2n = número total de indivíduos numa cultura Sistemas de Cultura de Microrganismos Existem 3 sistemas de cultura de microrganismos: Em sistema fechado (descontínuo): Consiste num recipiente fechado onde o meio de cultura e os microrganismos são incubados com agitação constante e a uma TºC definida. g = t / n 17 O crescimento é limitado pelo esgotamento do nutriente limitante ou pela acumulação de um metabolito inibidor do crescimento. Uma curva de crescimento padrão apresenta as seguintes fases: • Fase inicial (fase Lag) - Não há um aumento significativo do nº de microrganismos. Bactérias metabolicamente activas; aumentando de tamanho, sintetizando enzimas, incorporando moléculas do meio. A duração desta fase depende: Características da espécie e condições do meio onde o microrganismo se encontrava e se encontra. Microrganismos de culturas velhas levam mais tempo a ajustarem-se ao novo meio • Fase exponencial (fase Log) - período de crescimento activo em que o nº de microrganismos aumenta rapidamente a uma taxa constante, denominada crescimento exponencial. O tempo de geração para a maioria das bactérias encontra- se compreendido entre 20 minutos a 20 horas. • Fase estacionária - A divisão celular diminui ao ponto que as novas células são produzidas à mesma taxa que as células velhas morrem. O nº de células vivas mantém- se constante. Esgotamento progressivo de nutrientes; Aumento da concentração de metabólitos; Quantidade de oxigénio pode tornar-se inadequado para os aeróbios; Alterações de pH. • Fase de declínio - O número de células viáveis decresce a uma taxa logarítmica. Semi-Fechado (semi-contínuo) O processo é iniciado com um volume reduzido de cultura procedendo-se, posteriormente, à adição lenta de meio de cultura contendo um nutriente limitante até se atingir a capacidade do recipiente. A principal diferença entre este sistema e o fechado, reside no facto de o sistema fechado, todos os nutrientes necessários estão presentes desde o início, enquanto que no semi-fechado, estes são adicionados lentamente ao longo do crescimento. Aberto (contínuo) É um modo de cultura em contínuo que, contrariamente ao sistema fechado, permite manter o crescimento em fase exponencial por períodos consideráveis de tempo. Tal é conseguido pelo fornecimento contínuo de meio de cultura, de forma a impedir o esgotamento de nutriente. Existem 2 tipos de sistema Aberto: Quimiostato – sistema aberto que é mantido a um volume constante pela alimentação de meio de cultura fresco contendo um nutriente limitante, a um caudal idêntico ao caudal a que a cultura é removida. Aparelho que regula a 18 taxa de crescimento através do controlo da concentração de nutrientes essenciais Turbisdato Métodos de avaliação do crescimento microbiano Diluição seriada e contagem em placas Contagem directa ao microscópio; câmara de contagem de Petroff-Hausser, câmara de Neubauer Cálculo do Número Mais Provável Filtração Medição da turbidez; colorimetria, espectrofotometria. Determinação do peso seco da biomassa produzida. Avaliação de metabolitos produzidos, presentes no meio. CONTROLO DE MICRORGANISMOS POR AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS Os processos de esterilização e desinfecção permitem o controlo e desenvolvimento dos microrganismos. São métodos essenciais no tratamento e prevenção de infecções, na prevenção de contaminação de culturas microbianas puras e são componentes essências dos processos de produção nas Indústrias Farmacêuticas e Alimentares. Esterilização Processo a partir do qual todas as células vivas, esporos viáveis, vírus e viróides são destruídos ou removidos de um objecto ou ambiente. Desinfecção É o processo a partir do qual os microrganismos patogénicos são mortos, inibidos ou removidos.Desinfectantes Agentes, geralmente químicos, usados para assegurar a desinfecção e empregues somente em objectos inanimados. Um desinfectante não assegura necessariamente a esterilização dado que podem permanecer esporos viáveis e alguns microrganismos. Antiséptico Agente químico que permite controlar os microrganismos em tecidos vivos. Germicida Destrói microrganismos patogénicos (muitos não patogénicos) mas não necessariamente endósporos. Agentes antimicrobianosSubstâncias que matam ou inibem o crescimento de microrganismos. Microbiostáticos: inibem o crescimento Bacteriostáticos Fungistáticos Microbiocidas: matam Bactericidas Fungicidas Viricidas 19 A eficiência de um agente antimicrobiano é afectada por: Tamanho da população microbiana a destruir. Composição da população: diferentes microrganismos têm diferentes susceptibilidades. Os endósporos são mais resistentes aos agentes microbianos que as formas vegetativas. As células jovens são mais facilmente destruídas que organismos maduros. Algumas espécies suportam melhor as condições adversas que outras. Concentração do agente antimicrobiano. Muitas vezes quanto mais concentrado for o agente, mais rapidamente são destruídos os microrganismos. No entanto, a partir de um determinado momento, qualquer aumento na concentração não corresponderá a um aumento na taxa de destruição. Por vezes um agente é mais efectivo a baixas concentrações (etanol a 70%). Duração da exposição Temperatura. Ambiente circundante: o efeito do calor é maior quando associado a valores de pH baixos (utilização da pasteurização em bebidas ácidas e frutas). A matéria orgânica protege os microrganismos do calor e dos factores fisico-químicos (é necessário limpar os objectos antes da esterilização ou desinfecção). Os microrganismos morrem por contacto com um agente microbiano. Os microrganismos não entram todos ao mesmo tempo em contacto com o agente antimicrobiano. Desta forma morrem a uma determinada taxa ao longo de um período de tempo. Probabilidade de morte de uma população constituída, inicialmente, por um milhão de bactérias: 20 Controlo por AGENTES FÍSICOS CALOR A utilização de elevadas TºC é dos métodos mais eficazes na destruição de microrganismos. O calor pode ser aplicado em ambiente húmido (vapor de água) ou seco. Calor Húmido · A esterilização por calor húmido é feito através de uma autoclave. À TºC de 121ºC, o vapor de água saturado destrói as formas vegetativas e os endósporos numa pequena quantidade de líquido dentro de 10 a 12 minutos. O tratamento é prolongado até aos 15 minutos para se trabalhar com uma margem de segurança. Pensa-se que o calor húmido destrói os ácidos nucleicos e desnatura os enzimas e outras proteínas essenciais. Destrói também as membranas citoplasmáticas. Calor a Seco · O material é submetido a temperaturas de 160 a 170ºC durante 2 a 3 horas. A morte dos microrganismos ocorre por oxidação dos constituintes celulares e desnaturação das proteínas. O calor húmido é mais efectivo que o calor seco. Os esporos de Clostridium botulinum são destruídos em 5 minutos a 121ºC por calor húmido e somente depois de 2 horas a 160ºC em calor seco. Vantagens: Não provoca corrosão do material. É utilizado para a esterilização de material de vidro; pipetas, caixas de Petri, balões. No entanto não pode ser aplicado em materiais sensíveis ao calor (plásticos e borracha). Pasteurização · Tratamento através de temperaturas abaixo do, ponto de ebulição o HTST (High Temperature Short Time) - Consiste num aquecimento rápido a cerca de 72ºC durante 15 segundos, seguindo-se um rápido arrefecimento. o UHT (Ultra High Temperature) - Tratamento a 150ºC durante 1 a 3 segundos. Este processo é aplicado na indústria do leite, cerveja e outras bebidas. Não esteriliza os alimentos, mas destrói os microrganismos patogénicos e retarda a decomposição pela drástica redução dos microrganismos não patogénicos responsáveis pela decomposição dos alimentos. Tindalização · O material a ser esterilizado é aquecido entre 90º a 100ºC, durante 30 minutos em três dias consecutivos e incubado durante os intervalos a 37ºC. O primeiro aquecimento destrói as formas vegetativas, mas não os endósporos. A maioria dos endósporos germinará durante a incubação subsequente e serão destruídos no período de aquecimento seguinte. Qualquer esporo que tenha resistido será destruído durante a última etapa do tratamento. Icenerização · Destruição dos microrganismos por combustão. É aplicada em agulhas, ansas e material de vidro. 21 FILTRAÇÃO Utilizada na remoção de microrganismos de líquidos, gases, termolábeis, ou do próprio ar atmpsférico. Processo empregue em: Esterilização de soluções sensíveis a altas temperaturas, como por exemplo antibióticos. Análises microbiológicas de águas. Obtenção de filtrados, onde cresceram microrganismos, para obtenção de metabolitos (enzimas extracelulares, antibióticos). Esterilização do ar, como no caso das câmaras de fluxo laminar (filtros HEPA- High Eficiency Particulate Air). RADIAÇÕES As radiações de elevada energia destroem células vivas, incluindo naturalmente os microrganismos. Radiação UV (260nm) É bastante letal mas não penetra eficientemente o vidro, a água e outras substâncias. Assim a radiação UV é utilizada para reduzir a viabilidade dos microrganismos presentes no ar e superfícies expostas em salas e câmaras de segurança. Radiação Ionizante É um excelente agente esterilizante e penetra profundamente nos objectos. A radiação gama de uma fonte cobalto 60, é utilizada para esterilizar antibióticos, hormonas, material descartável como seringas e ainda para pasteurizar carne e outros alimentos. Dissecação Redução do metabolismo microbiano por remoção da água. Processo utilizado na conservação da carne, peixe e frutos. Controlo por AGENTES QUÍMICOS TDP - Ponto de morte térmica: mais baixa temperatura para a qual os microrganismos em suspensão são mortos em 10 minutos. TDT - Tempo de morte térmica: mais curto espaço de tempo necessário para matar, os microrganismos presentes numa suspensão, a uma dada temperatura e sob condições definidas. Tempo de redução decimal: tempo necessário para matar 90% dos microrganismos ou esporos numa amostra a uma temperatura específica. Concentração mínima inibitória: mais pequena quantidade, de agente químico, necessária para inibir o crescimento do organismo testado. 22 Principais grupos de desinfectantes e antissépticos: FENOL (ácido carbólico) e compostos fenólicos; lisol, hexaclorofeno ÁLCOOL As propriedades bactericidas do álcool aumentam com o número de carbonos da molécula. No entanto álcoois com cadeias mais longas do que o isopropílico são menos solúveis em água e por isso não são utilizados com fins antimicrobianos. Halogénios: o Iodo e compostos iodados o Cloro e seus compostos Hipocloritos de cálcio - Ca(OCl)2 e sódio – NaOCl Cloraminas: compostos orgânicos de cloro. São estáveis e libertam cloro durante períodos mais prolongados do que os hipocloritos. Estes compostos na presença da água sofrem hidrólise dando origem ao ácido hipocloroso. Este ácido em água dá ácido clorídrico e oxigénio nascente (O) que é um poderoso oxidante. Metais pesados ( mercúrio, chumbo, zinco, prata e cobre) e seus compostos; nitrato de prata - AgNO3 e sulfato de cobre CuSO4: O efeito letal exercido por certos metais sobre os microrganismosé designado por acção oligodinâmica. Este efeito pode ser demonstrado colocando uma moeda de prata sobre a superfície de uma placa onde se pretende observar o crescimento de uma bactéria. Após incubação, forma-se um halo ao redor da moeda devido à inibição de certos enzimas que se combinam com o metal. Compostos orgânicos de mercúrio têm mais actividade microbiana e são menos tóxicos que os compostos inorgânicos (mercurocromo e mertiolato). Detergentes: São compostos que têm a capacidade de transformar superfícies hibrófobas «mais molháveis». São também chamados surfactantes (agente superfície-activo). Esta capacidade deve-se ao facto de serem compostos anfipáticos. Um composto anfipático tem numa extremidade um grupo carboxílico com carga negativa e na outra extremidade um grupo hidrocarbonado não polar. A capacidade de lavagem reside no facto de o grupo não polar ser lipófilo (hidrófobo) e o grupo polar ser hidrófilo. Quando é adicionada uma solução aquosa de detergente a uma substância não polar (gordura): • grupo lipófilo liga-se à gordura; • grupos hidrófilos criam uma superfície que pode absorver água. 23 Os detergentes classificam-se em: Aniónicos: o poder detergente reside na fracção aniónica da molécula. Exemplo: dodecil sulfato de sódio (detergente sintético) Catiónicos: o poder detergente reside na fracção catiónica da molécula. Exemplo: cloreto de cetiltipiridinium (Ceeprin). Maioria dos detergentes com efeitos antimicrobianos pertencem a este grupo. Os compostos quaternários de amónio são os mais utilizados. Não iónicos: não ionizam quando dissolvidos em água. Estes detergentes não são antimicrobianos. Esterilizantes Químicos: Óxido de etileno: Mata formas vegetativas e endósporos. Grande poder de penetração. Baixa taxa de actuação (várias horas). Formaldeído: Gás estável a concentrações elevadas e a altas temperaturas. Mata formas vegetativas e endósporos. Glutaraldeído: Eficaz contra vírus, formas vegetativas e esporos de bactérias e fungos. Características de um agente antimicrobiano ideal 1. Actividade antimicrobiana: Capacidade para inibir ou matar microrganismos: Eficaz a baixas concentrações; Largo espectro de acção; 2. Solubilidade: solúvel em água ou em outros solventes; 3. Estabilidade: manutenção das suas propriedades antimicrobianas por períodos longos; 4. Não tóxico: não deve causar danos ao Homem e outros animais; 5. Homogeneidade: deve apresentar composição uniforme. A substância activa deve estar sempre presente me cada aplicação e não deve agregar-se nem precipitar; 6. Inactividade: a combinação com outros produtos ou substratos a tratar reduz a quantidade de substância activa; 7. Actividade à temperatura normal: não deve ser necessário aumentar a temperatura do ambiente em que o produto vai ser aplicado; 8. Poder de penetração: capacidade de introduzir-se em profundidade no substrato. Acção superficial, por vezes não é suficiente; 9. Não corrosivo e não corante: o produto não deve reagir com os metais ou manchar os tecidos ; 10. Inodoro: se tiver cheiro deve ser agradável. É desejável que seja desodorizante; 11. Capacidade detergente: poder para remover mecanicamente os microrganismos das superfícies a serem tratadas; 24 12. Acessível e de baixo custo: o produto deve ter um baixo custo de aplicação e estar disponível no mercado. Efeito de agentes antimicrobianos no crescimento Quando um agente antimicrobiano é adicionado a uma cultura bacteriana em fase exponencial de crescimento, podem ser observados três tipos de efeitos: bacteriostático: inibição do crescimento, sem ocorrer a morte das células. bactericida: morte das células, sem ocorrer ruptura. bacteriolítico: induz a morte das células por destruição da célula (penicilina). Avaliação da actividade antimicrobiana Determinação da concentração inibitória mínima: Técnica da diluição em tubos Fazem-se várias diluições do agente a testar (ex. detergente); Inoculam-se tubos, com igual volume de cada diluição de detergente, com um determinado volume de uma suspensão bacteriana; De cada tubo inoculado repica-se para tubos com meio adequado; Observa-se a turvação após 24 a 48 horas de incubação. A não turvação indica que, para aquela diluição o detergente matou as bactérias. Técnica da difusão em agar - Processo idêntico ao anterior. Nesta técnica o efeito do agente químico é observado pela formação de halos de inibição à superfície da placa onde se efectuou o crescimento bacteriano com discos embebidos no agente antimicrobiano. Coeficiente Fenólico - poder de mortalidade de um agente químico quando comparado com o fenol; Diluições do produto a testar; Diluições do fenol; Inoculação de todos os tubos com suspensão bacteriana; A intervalos regulares de tempo são retiradas ansadas de todos os tubos e transferidas para tubos com meio de cultura; Observação dos tubos após incubação; A maior diluição que mata o microrganismo ao fim de 10 minutos é dividida pela máxima diluição do fenol que apresentou o mesmo resultado. A este quociente denomina-se coeficiente fenólico. 25 SLIDES 8 A 13 26 Antibióticos e outros agentes quimioterápicos Antibióticos: Substâncias químicas, geralmente, produzidas por certos microrganismos que, em pequenas doses, inibem ou matam outros microrganismos. Microrganismos que produzem o maior número de antibióticos úteis: Bacillus, Penicillium, Streptomyces e Cephalosporium (fungo marinho, que produz as cefalosporinas). Formas de competição entre seres vivos: Espaço físico Nutrientes Modificações do pH Excreção de substâncias específicas que interferem com o metabolismo de outras espécies, impedindo a sua multiplicação ou destruindo-as. Bactéria do género Streptomyces, produz antibióticos importantes, tais como: cicloheximida, cloranfenicol, eritromicina, estreptomicina, griseofulvina, kanamicina, neomicina, nistatina, novobiocina, tetraciclina, vancomicina, entre outros. Modo de actuação de antibióticos, em bactérias: Inibição da síntese proteica - O cloranfenicol inibe a síntese proteica ao nível dos ribossomas 70 S dos procariontes, mas não interfere com a síntese que tem lugar ao nível dos ribossomas 80 S dos eucariontes. Por outro lado, a cicloheximida inibe a síntese proteica ao nível dos ribossomas dos eucariontes (80S), não intereferindo com a síntese ao nível dos ribossomas 70 S dos procariontes. Outros inibidores da síntese proteica: Tetracilina, penicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, eritromicina. Inibição da formação da parede celular: Penicilina, bacitracina, cefalosporinas, vancomicina. Inibição da síntese dos ácidos nucleicos: Ácido nalidíxico Alteração da estrutura da membrana citoplasmática: Polimixina Inibição da síntese de metabolitos essenciais: Trimetoprim, sulfonamidas. Bacteriocinas: Grupo de peptídeos ou proteínas com acção antimicrobiana contra organismos do mesmo género. Diversas bactérias Gram-negativas produzem bacteriocinas, como por exemplo: coliformes (colicinas), Pseudomonas (piocinas). Agentes quimioterápicos de síntese: Trata-se de substâncias antimicrobianas que diferem dos antibióticos por não ocorrerem naturalmente. Nitrofuranos - O furfural é um dos derivados nitrofurânicos que pode ser obtido a partir de espigas e caules de milho, da casca de aveia, da polpa de beterrabas, da cascado amendoim e de outros subprodutos vegetais. Os nitrofuranos são eficientes contra um largo espectro de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, protozoários patogénicos e fungos. 27 Isoniazida - Substância química utilizada contra micobactérias. Possui estrutura semelhante à piridoxina (vitamina B6), pelo que pode bloquear as reacções catalisadas pela piridoxina em alguns microrganismos. É utilizada no tratamento da tuberculose humana. Ácido nalidíxico - Actua por inibição da síntese proteica. Aplicada no tratamento de infecções urinárias devidas a bactérias Gram-negativas. Cloroquina - Utilizada na profilaxia e tratamento da malária (doença provocada pelo protozoário do género Plasmodium). Este medicamento substituiu o quinino (extraído da casca de uma árvore; cinchona) Controlo de Vírus É difícil inibir a multiplicação dos vírus sem afectar o hospedeiro, devido à dependência da replicação dos vírus relativamente à célula hospedeira. A rifamicina é um inibidor de RNA polimerase em bactérias, não o sendo para eucariontes e arquebactérias. No entanto esta substância também inibe, RNA polimerase, em vírus da varicela e varíola. A azidotimidina (AZT) é um químico usado na inibição de retrovírus. Interferons. Substâncias antivirais produzidas por células animais em resposta à infecção por certos vírus. Não são específicos para os vírus, mas sim para o hospedeiro. Por exemplo interferons produzidos por galinhas como resposta ao vírus da influenza, inibem a multiplicação de outras viroses em indivíduos da mesma espécie mas não tem efeito na multiplicação desse vírus em outras espécies. Não tem efeito em células não infectadas; parecem inibir a síntese viral especificamente. Controlo de fungos Dado que os fungos são eucariontes, os agentes quimioterapêuticos que afectam as vias metabólicas no fungo afectam também as vias metabólicas correspondentes nas células hospedeiras. Assim, muitos antifúngicos são para uso tópico (superfície). Os agentes antifúngicos actuam por interferência na: • Membrana citoplasmática; • Actividades da membrana citoplasmática; transporte de nutrientes; • Biosssíntese de metabólitos; • Síntese de ácidos nucleicos; • Formação da parede celular. 28 Resistência aos antibióticos - capacidade adquirida por um organismo, para resistir aos efeitos de um antibiótico, para o qual é normalmente susceptível. Os microrganismos produtores de antibióticos desenvolveram mecanismos genéticos para neutralizar ou destruir os seus próprios antibióticos. Em determinadas condições estes genes de resistência podem ser transferidos para outros microrganismos. Mecanismos de resistência O microrganismo pode não possuir a estrutura, sobre a qual o antibiótico actua Exemplo: Micoplasmas , não possuem parede celular e portanto são resistentes à penicilina. O microrganismo pode ser impermeável ao antibiótico. O microrganismo pode ter capacidade de alterar o antibiótico, inactivando-o. Através de modificação genética, pode ocorrer uma alteração na via metabólica que é bloqueada pelo antibiótico. O microrganismo pode ter capacidade de bombear para o exterior o antibiótico que entra na célula. 29 30
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