Artigo Traduzido - Clostridium Difficile

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Microbiologia Clínica
Variação na germinação de Clostridium difficile isolados clínicos correlaciona com a gravidade da doença
Paul E. Carlson um Jr., 1
, Alyssa M. Kaiser um
, Sarah A. McColm um
, Jessica M. Bauer uma
,
Vincent B. Young, um b
, David M. Aronoff c
, Philip C. Hanna a, *
um Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Michigan, Ann Arbor, MI 48109, EUA
b Departamento de Medicina Interna, Divisão de Doenças Infecciosas da Universidade de Michigan, Ann Arbor, MI 48109, EUA
c Divisão de Doenças Infecciosas do Departamento de Medicina, Departamento de Patologia, Microbiologia e Imunologia da Faculdade Universidade Vanderbilt de
Medicina, Nashville, TN 37232, EUA
Ao longo das últimas duas décadas, as infecções Clostridium difficile têm vindo a aumentar em número e gravidade em todo o mundo. Tal como acontece com outras bactérias formadoras de esporos, a germinação é um passo vital na vida ciclo deste patógeno. Estudos examinaram diferenças na esporulação e produção de toxinas, entre um número de C. difficile isolados clínicos; diferenças no entanto, poucos têm examinado em germinação e o relação entre este fenótipo e gravidade da doença. Aqui, acima de 100 C. difficile isolados a partir da Universidade de Michigan Health System foram examinados para a germinação geral em resposta a diversos combinações de germinants conhecidos (taurocolato) e co-germinants (glicina e histidina). Significativo variação foi observada entre os isolados em todas as condições testadas. Isolados representando ribotipo 014- 020, que foi o ribotipo isolado com maior freqüência em nosso hospital, apresentaram maior germinação em a presença de taurocholato e glicina, quando comparado com os isolados que representam os outros ribotipos.
Curiosamente, os isolados que doença grave causada exibiu significativamente menor germinação em resposta a condições de germinação mínima (apenas taurocholato), indicando maior controle sobre a germinação em estes isolados. Estes dados fornecem uma visão ampla de C. difficile germinação isolado e indicam um papel para controlo preciso da germinação na gravidade da doença.
1. Introdução
Clostridium difficile, uma bactéria Gram-positiva, anaeróbio formador de esporos bactéria, é atualmente uma das principais causas de infecção hospitalar em todo o mundo [1,2]. C. difficile infecção (CDI), muitas vezes se manifesta como o bactéria coloniza o tracto gastrointestinal após antibiótico tratamento, o que aumenta a susceptibilidade do paciente, alterando o estrutura populacional das bactérias comensais que tipicamente proporcionar resistência colonização [1E4]. A prevalência e gravidade de CDI têm aumentado na última década, com mais de um 250 mil casos, resultando em 14 mil mortes que ocorrem anualmente nos Estados Unidos sozinho [1,5,6].
Esporos desempenham um papel crucial na transmissão de C. difficile. Estes esporos são metabolicamente latente e resistente a uma ampla gama de estresses físicos e químicos, incluindo oxigênio ambiental e o ambiente ácido do estômago [7]. Após a entrada na intestino delgado, os esporos germinam para se tornar o metabolicamente células vegetativas activas [8,9]. A germinação ocorre em resposta às compostos específicos, germinants, encontradas no ambiente intestinal.
O sal de bile, taurocholato, é o principal para germinativo Esporos de C. difficile, com aminoácidos, incluindo glicina e histidina servindo como co-germinants, que aumentam a germinação na presença de taurocolato [10,11]. A germinação dos esporos é um earlyevent
pré-requisito para CDI e o processo é essencial tanto para patogenia e o ciclo infeccioso.
As diferenças nas taxas de germinação de C. difficile isolados clínicos foram examinados em estudos anteriores, com diferentes conclusões desenhado. Num estudo, os isolados da epidemia ribotipo, 027, eram mostrado exibir uma maior eficácia do que os isolados de germinação ribotipos outros [12]. Em contrapartida, outros relataram diminuição níveis de germinação em 027 esporos ribotipos em comparação com outros .
 Métodos e materiais
2.1. Strain isolamento e seleção 
Foram identificados casos clínicos de C. difficile [14,15] de potencial casos identificados pelo laboratório de microbiologia clínica na Universidade de Michigan como descrito anteriormente. Isolados de C. difficile foram
cultivado a partir de amostras de fezes de pacientes, utilizando-taurocholato cefoxitincycloserine-frutose agar (placas TCCFA) utilizando um protocolo publicado [16]. Todos os isolados analisados ​​foram previamente caracterizados pela nossa laboratório [17]. Todos os isolados estudados foram toxigenic baseado na inicial testes de diagnóstico (ELISA e / ou PCR para o gene da toxina B, TCDB) e um ensaio de confirmação toxicidade de células Vero. Os isolados foram seleccionados para neste estudo, utilizando três critérios. Em primeiro lugar, uma ampla selecção de isolados foi escolhidos para representar a diversidade de ribotipos na Universidade de Michigan hospitalar entre janeiro de 2010 e fevereiro de 2011, incluindo vários representantes dos 12 ribotipos distintos, bem como 27 isolados únicos representantes de outras ribotipos. Em segundo lugar, aumento do número de epidemia ribotipo 027 (n = 27) e o ribotipo predominante em nosso hospital na época, 014-020 (n ¼ 21) foram incluídos para avaliar diferenças nestas ribotipos altamente estudados. Finalmente, os isolados de todos os casos de grave CDI identificado em nosso hospital durante o tempo de amostragem, foram incluídos no estudo (N = 34). Cases exibindo uma infecção que: i) necessários internação na UTI, ii) exigiu uma cirurgia intervencionista (egcolectomia), ou iii) resultou em morte, no prazo de 30 dias de diagnóstico foram definidos como grave, de acordo com recomendações do CDC [18].
Estas apresentações teve de ser atribuível ao CDI para que o caso a ser considerado CDI grave.
2.2. Bacteriana condições de crescimento e estoques de esporos C. difficile isolados foram cultivadas numa câmara anaeróbia (Coy Produtos de laboratório, IM). Para experiências in vitro, C. difficile isolados foram cultivadas em BHIS (infusão cérebro-coração caldo suplementado com 0,5% de extracto de levedura e 0,1% de cisteína; nenhuma glicose ou
ferro foram adicionados a este meio), a menos que indicado de outra forma. Esporo existências para todos os isolados foram produzidos como se segue. Stocks congelador de
isolados clínicos (única passagem) foram semeadas em BHIS. Um isolado colónia foi utilizada para inocular uma cultura durante a noite. Quatro placas eram em seguida, inoculados com 100 ml da cultura durante a noite e incubadas durante sete dias a 37 ° C sob condições anaeróbicas antes da circulação de oxigénio normal para um dia para matar bactérias vegetativas. Bacteriano relvados foram então ressuspensas em água 4 C e lavados pelo menos
quatro vezes, para remover os detritos de célula vegetativa [16]. Suspensões de esporos
Também foram aquecidos a 65 ° C durante 30 minutos para assegurar a matar qualquer remanescente estoques de esporos de bactérias vegetativas foram armazenados em água a 4 C. O número de esporos viáveis ​​produzidos neste método variou entre isolados, como seria esperado a partir de estudos anteriores [17]. Para confirmar a consistência entre os preparativos, um pequeno número de isolados foram submetidos a múltiplas preparações utilizando tanto o método acima e pelo crescimento em caldo líquido. Estas preparações de esporos diferentes resultaram em testes de germinação de desempenho quase idêntico
(Dados não apresentados). Além disso, a pureza dos estoques de esporos, como observado pela microscopia de contraste de fase, não ter um efeito sobre a germinação totais (dados não mostrados).
2.3. Os ensaios de germinação
A germinação foi medida como uma função da capacidade de um esporos germinados a superar na ausência de taurocholato. Esporo existências incubou-se a 65 C durante 30 minutos, uma segunda vez imediatamente antes da sua utilizaçãoem testes de germinação para remover quaisquer esporos que tivessem submetido a germinação espontânea durante o armazenamento. Os esporos foram incubado anaerobicamente com qualquer taurocolato a 0,1% (Tc) ou 0,1% Tc / 0,4% de glicina em PBS durante 30 min. Após a incubação, a germinação
foi imediatamente interrompido por realização de uma diluição de 1:10 a menor Tc bem abaixo dos níveis ideais. Esporos germinados enumerado por plaqueamento para unidades formadoras de colônia (UFC) no BHIS placas sem Tc. As colónias que cresceram nestas placas eram 
Considera-se que germinaram bactérias vegetativas e eram em relação ao total de UFC / ml da amostra determinada por plaqueamento sobre BHIS þ0.1% Tc. Percentagem de germinação de uma dada amostra foi calculado como se segue: (CFU / ml BHIS só placa) / (CFU / ml BHIS þ placa Tc) * 100). Os ensaios foram realizados em triplicado para cada isolado. Seguir os estudos foram realizados utilizando o mesmo ensaio com apenas PBS, PBS / glicina / histidina (0,4%) / Tc, PBS / histidina / Tc, ou BHIS / Tc como o mistura de germinação.
2.4. As análises estatísticas
Todos os métodos estatísticos foram realizados utilizando GraphPad Prism versão 6 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA). Para comparação dos dois grupos, o teste não paramétrico ManneWhitney foi usado. Durante três comparações de grupos, os KruskaleWallis não paramétricos foi utilizado o teste.
2.5. Aprovação seres humanos
A Universidade de Michigan Institutional Review Board aprovado todos os protocolos de recolha de amostras de dados clínicos e utilizada neste estudo.
Se for caso disso, por escrito, o consentimento informado foi recebido de todos pacientes antes da inclusão no estudo.
3 .. Os resultados
3.1. Critérios de selecção do isolado clínico Isolados clínicos de C. difficile apresentam níveis iguais de germinação em resposta às condições ricas in vitro [17], no entanto, a capacidade de
Estes isolados para germinar tem condições mais rigorosas não foram examinados. Nossa hipótese é que a correlação pode existir entre a capacidade de um indivíduo isolado a germinar sob condições rigorosas, com a gravidade da doença provocada por esse isolar. Para testar isto, os isolados clínicos de C. difficile foram examinados para a capacidade de germinar sob tais condições. Os isolados foram escolhidos para incluir uma ampla gama de ribotipos incluindo uma sobre-representação de ribotipos 027 e 014-020, os dois mais comuns ribotipos encontrado em nosso sistema hospitalar. A fim de identificar uma correlação entre a gravidade da doença e germinação, isola a partir de todos os 34 casos de CDI grave que tinham sido identificadas durante o período de recolha foram incluídos no estudo.
3.2. Germinação de sementes de C. difficile isolados clínicos em taurocholato apenas
Apesar de diferenças significativas nas taxas de germinação não se observados em rich media [17], a possibilidade de que estes permaneceram isola apresentaria diferenças quando a germinação foi induzido sob mais restritas / condições rigorosas. É provável que o condições dentro do intestino não são tão rico em nutrientes como cultura bacteriana meios de comunicação; portanto o teste de germinação sob essas mais restrito condições poderia ser mais relevante do que o exame de germinação em BHIS. Para testar isto, os isolados clínicos de C. difficile foram incubadas em PBS com 0,1% de taurocolato de apenas (sem co-germinativo) durante 30 min e totais de germinação durante a incubação foram avaliados. Sob estas condições de germinação / rigorosas restritos, uma ampla gama de níveis de germinação foi observada (0.001e29.4%), com a maioria dos isolados clínicos testados exibiram níveis muito baixos de germinação (Inferior a 6%) durante este período de tempo (Fig. 1A). Alguns isolados
que exibem níveis mais elevados de germinação sob estas condições (Fig. 1A). Quando isolados foram agrupados de acordo com ribotipo, não significativa Foram observadas diferenças na capacidade de um grupo de germinar em resposta a taurocolato sozinho (Fig. 1B). Curiosamente, quando isolados foram agrupados de acordo com a gravidade da doença, uma significativa foi observada diferença (Fig. 1A, barras pretas; Fig. 1C). Os isolados que doença grave causada eram mais propensos a germinar mal na resposta a taurocolato sozinho (germinação média de 0,355% vs. 1,85% para os isolados não-graves; Figo. 1C). Este baixo nível de germinação para graves isolados associados com a doença implica um papel importante para o controle preciso de germinação na patogénese de C. difficile. Uma possível explicação para os níveis mais elevados de germinação observado para alguns isolados em resposta a taurocolato sozinho que é estes isolados são submetidos a germinação espontânea, como tem
foi observada anteriormente para os isolados clínicos de C. difficile [13]. Se este fosse o caso, estes isolados iria apresentar o mesmo nível de germinação na ausência de taurocolato. Para excluir esta possibilidade, todos os isolados que apresentaram germinação superior a 5% em
taurocolato sozinha (n = 19) foram avaliados quanto à germinação em PBS sozinho (Fig. 2). Apenas dois dos isolados testados apresentaram significativa níveis de germinação espontânea (Fig. 2, barras cinzentas). Na verdade, o maioria (15/19) dos isolados testados não apresentaram qualquer espontânea germinação após 30 min (Fig. 2). Estes resultados indicam que, para o maioria dos isolados testados, a germinação observado em resposta a
taurocolato sozinho é específico para esta germinativo e não devido eventos de germinação espontânea.
3.3. Germinação de isolados clínicos com co-germinativo
Enquanto taurocolato foi identificado como o principal germinativo para C. difficile e é necessária para a germinação de esporos ([10], Figo. 2), a germinação é muito mais eficaz na presença do co-germinativo glicina ([10, 11]). Para avaliar o papel da glicina sobre o germinação de C. difficile isolados clínicos, cada isolado foi incubada em PBS com 0,1% de taurocolato e 0,4% de glicina durante 30 min e então avaliada para a germinação total. Mais uma vez, estes isolados exibiram uma vasta gama de níveis de germinação (6.2e100%), no entanto 86,7% de isolados testados (92/106) exibiu germinação superior a 60% sob estas condições (Fig. 3A). Quando os isolados foram agrupados baseado em ribotipo, um claro padrão emergiu. Isolados de ribotipo 014-020 apresentou níveis significativamente mais elevados de germinação (Mediana ¼ 93%) em comparação com os outros ribotipos testados (027 ¼ 82%, "Outro" ¼ 85%) (Fig. 3B). Estes isolados também exibiu a menor variação nos níveis de germinação entre isolados (Fig. 3B). Ao contrário de germinação em taurocolato sozinho, quando os isolados foram agrupados com base na gravidade da doença, não foi observada diferença significativa para germinação na presença de glicina e de taurocolato, com a os dois grupos apresentaram germinação mediana quase idêntico valores (Fig. 3C).
Alguns dos isolados testados apresentaram totais baixa germinação mesmo na presença de glicina. A fim de avaliar qualquer influência de como ainda desconhecidos co-germinants nestes isolados, cada isolado exibindo germinação de 60% menos do que na presença de taurocolato e glicina foi incubada em taurocolato ou mais glicina, histidina, glicina e histidina, ou BHIS caldo (Fig. 4). 
Taurocholato mistura / glicina induzida germinação como discutido acima (fig 3; A Fig. 4, barras pretas.). A adição de histidina, outra conhecida de C. difficile co-germinativo [11], conduziu a um aumento significativo no germinação total, sendo a maioria dos isolados atingindo mais de 80% germinação em 30 min (Fig. 4, barras cinzentas escuras). Embora histidina pode melhorar a germinação na presença de glicina e taurocolato, a combinação de histidina e taurocolato (sem glicina) não foi capaz de induzir a germinação superior a 15% em qualquer única isolar e, em muitos casos, resultou em menos de 1% de germinação (Fig. 4, luz barras cinza).Como esperado, a incubação em meio rico em taurocholato levou a germinação quase completa no todos, mas um isolar testados (Fig. 4, barras brancas), o que sugere a presença de um ou outro co-germinants adicionais ou níveis mais elevados de glicina / em histidina este meio. Um isolado (Cd004) apresentou uma fraca germinação sob todas as condições testadas, embora de germinação foi reforçada por a presença de histidina glicina ° ou caldo BHIS além taurocholato. Os dados para os isolados individuais são apresentados na suplementar informação (Tabela S1).
4. Discussão
Nos últimos anos, os hospitais viram um aumento significativo casos de infecção por C. difficile. Muitos estudos examinaram clínica isola e ribotipos comuns específicas, nas tentativas para explicar os aumentos em ambos os casos e a gravidade dos casos ser visto
[19,20]. Aqui nós mostramos evidências ligando a capacidade de responder a germinants de um modo específico, controlada a um aumento no caso severidade. Além disso, isola do ribotipo mais comum observado em da Universidade de Michigan hospitais, 014-020, exibem uma maior nível de germinação do que as de outros ribotipos testados, incluindo o ribotipo altamente estudados 027.
O aumento da incidência de infecções por C. difficile ao longo da última década levou a um corpo crescente de pesquisa que examina isolados individuais, ribotipos específicas e casos individuais em um tentar encontrar correlações de gravidade da doença [21e26]. Neste estudo, foco específico foi colocado em dois ribotipos, 027 e 014-020. Para anos, ribotipo 027 tem sido estudada como uma hipervirulento e / ou epidemia ribotipo e tem sido frequentemente encontrado para ser responsável por um maior número de CDI do que outros ribotipos [27,28]. Curiosamente, enquanto vários estudos têm encontrado maiores níveis de toxina para os isolados ribotipo de 027 [17,21,29], este fenótipo não tem sido consistentemente correlacionados com a gravidade da doença em seres humanos em todos os estudos [15,17]. O epidemia ribotipo, 014e020, foi visto em números crescentes nos últimos anos e tornou-se o ribotipo mais comum encontrado em alguns hospitais de todo o mundo [30e32]. Este foi também o mais comumente isolada ribotipo na Universidade de Michigan
hospitais durante o nosso período de coleta [15,17]. Nós recentemente relataram uma correlação entre os níveis de esporulação e gravidade da doença, com isolados que causaram doença grave produzindo níveis mais elevados de esporos do que as que causaram mais leve
casos de CDI [17]. Nesse estudo, não houve diferença na germinação isolado foi identificado quando incubados sob condições ricas (BHIS caldo lus taurocholato) [17]. Aqui, ao contrário, diferenças significativas foram observadas em níveis de germinação do mesmo grupo de isolados quando foram examinados condições mais rigorosas. Quando isolados foram incubadas em taurocolato sozinho, diferenças significativas nas Foram observadas taxas de germinação. Embora houvesse diferenças gerais em todos os isolados, quando estas foram agrupadas com base em ribotipo sozinho, não há padrões significativos surgiram, indicando uma falta de correlação entre ribotipo e germinação sob essas condições. Estes resultados são semelhantes aos estudos anteriores que falharam para identificar as diferenças fenotípicas entre isolados com base em ribotipos grupos, com a excepção da produção de toxina, que é
aumentou entre os isolados representam ribotipo 027 [17]. Outros estudos têm relatado diferenças na germinação cia deficiências de isolados de ribotipo 027, um observando aumento germinação e outro diminuiu germinação entre estes isola [11,12]. Existem várias explicações possíveis para o discrepância entre esses três estudos. Em primeiro lugar, os métodos de medir a germinação diferem com Moore et al. usando queda na óptica densidade [12] enquanto Wheeldon et al. e nosso estudo utilizou perda de resistência ao calor e incapacidade para superar na ausência de germinativo identificar porcentagens de germinação ([11], Métodos). A mais provável possibilidade é o número relativamente baixo de isolados testados
Nestes estudos prévios. No presente estudo, 27 isolados representando ribotipo 027 foram examinados. Não houve diferenças significativas foram encontrados em germinação para estes isolados sob qualquer condições testadas (Figs. 1 e 3). Uma situação semelhante ocorreu anteriormente quando os laboratórios começaram a examinar esporulação de ribotipo 027 isolados. Os primeiros estudos que olham o baixo número de isolados apresentaram aumento da esporulação para este ribotipo [21,33], enquanto estudos que examinam os números elevados de isolados não significativa diferença entre este ribotipo e outros [17,34].
Curiosamente, quando estes isolados foram agrupados de acordo com a doença severidade, um claro padrão emergiu. Os isolados que causou grave doença foram bastante prejudicada para germinação, sob este mínimo condição. Este resultado foi surpreendente, uma vez que a hipótese de que que isola a doença severa causada exibiriam níveis mais elevados de
germinação. Uma possível explicação para esse resultado é que ter maior controle sobre a localização específica de germinação poderia proporcionar uma vantagem selectiva para um isolado em detrimento de outro. Por não germinando até entrar condições ideais, representada pela presença de ambos, taurocolato e um co-germinativo, a toda dose infectante de esporos germinam e podem proliferar com apenas mínima perda de viabilidade. Isto conduziria essencialmente a uma alta infecciosa dose, o que poderia, por sua vez, produzir um caso mais grave de CDI. A relação entre a dose infecciosa e gravidade da doença
tem sido descrita em modelos murinos de CDI [35].
Com poucas exceções, os isolados de todos os ribotipos germinadas muito bem em resposta à combinação de taurocolato e glicina.
Estes resultados são semelhantes ao que foi observado anteriormente para um subconjunto destes isolados incubados em BHIS com 0,1% de taurocolato, onde não foram observadas diferenças entre os 30 isolados [17]. Este elevada taxa de germinação indica que, para a maioria dos isolados testada, a combinação de glicina e taurocolato é suficiente para induzir a germinação quase completo de esporos viáveis. Curiosamente, isola representando ribotipo 014-020 exibindo significativamente maiores níveis de germinação em resposta a uma combinação de glicina e taurocolato (Fig. 3). É possível que o sucesso de este ribotipo na propagação através de hospitais é especificamente relacionado com este aumento de eficiência de germinação. Germinação mais eficiente pode resultar em uma dose mais baixa para um dado infeccioso estirpe.
Os dados aqui apresentados mostram uma clara correlação entre ambos ribotipo uma epidemia (014e020) e gravidade da doença de clínica isola e a capacidade de reconhecer e responder a combinações específicas de germinants. Estes dados sugerem uma ligação entre
a capacidade de germinar no meio adequado e o a capacidade de um dado isolado de causar doença grave. Além disso vontade estudo ser necessário para identificar as diferenças inerentes a estes isolados que levam para este maior controle sobre a germinação e para elucidar o papel deste controlo na patogénese de C. difficile.
Agradecimentos Este trabalho foi apoiado Clostridium difficile Cooperative Centro de Pesquisa (U19 AI09087). PEC também foi apoiado pela concessão número UL1RR024986 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e
não representam necessariamente a posição oficial do NCRRR ou o National Institutes of Health.