Coloração de Gram finalizado

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DO MARANHÃO - UNIFACEMA
3° PERÍODO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA BÁSICA
PROF. DR. FRANCISCO CESINO DE MEDEIROS JÚNIOR
CONTROLE DE MICRORGANISMOS
EDUARDA GOMES DOS SANTOS LIMA
JOSÉ MATHEUS SILVA ASSUNÇÃO REGO
LUCIANA PACHECO E SILVA CHAVES
STEFANNE JÉSSICA NOGUEIRA CANDEIRA
CAXIAS - MA
2019
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................2
2. METODOLOGIA..............................................................................................4
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................5
4. CONCLUSÃO..................................................................................................8
REFERÊNCIAS...................................................................................................9
1. INTRODUÇÃO
Os líquidos biológicos, tais como líquido pleural, sinovial, peritonial e pericárdico são fluidos corporais normalmente estéreis, porém podem ser invadidos por diferentes microrganismos, como por exemplo, as bactérias e causar infecções (Henry, 1999). Estas infecções geralmente são graves e deixam sequelas. O isolamento e identificação do agente etiológico podem ser um fator crítico para a recuperação da saúde do paciente (Diaz et al., 2002). 
O diagnóstico das infecções bacterianas pode ser feito por métodos presuntivos, através da microscopia, ou por métodos definitivos como o isolamento e a identificação da bactéria através da cultura em meios artificiais. A microscopia pela coloração de Gram é o método mais comumente utilizado para a observação direta de microrganismos nas amostras clínicas, podendo fornecer um resultado presuntivo e rápido do agente infeccioso (Borbeau et al., 1998).
Coloração diferencial é um termo geral que pode se referir a um número variado de processos específicos. Geralmente, é usado para descrever processos de coloração os quais usam mais que um corante. Usando-se múltiplos corantes pode-se diferenciar entre diferentes microrganismos ou estruturas e componentes celulares de um mesmo organismo ou de suas diferentes células (Pelczar Jr et al., 1996). 
A técnica de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações histológicas para observação ao microscópio óptico, utilizada para corar diferencialmente microrganismos com base na composição química e integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, são classificados em Gram-positivo (roxo) ou Gram-negativo (vermelho) (Okura, 2008). 
Pode-se obter resultados satisfatórios quanto ao preparo de corantes alternativos para a visualização de células microbianas e suas diferenças morfológicas, utilizando-se substâncias como violeta genciana, anilina, corante para roupas e dentre outras (Gazola et al., 1999).
A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama (Portal São Francisco, 2019).
Desta forma, o complexo cristal violeta -iodo (CVI) pode ser retirado e as 
Bactérias Gram-negativas são descoradas e a parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna -se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído então por último o contrastante – safranina ou fucsina básica: cora o citoplasma de vermelho das células descoradas (gram-negativas) (Ribeiro1993).
Portanto, a prática tem como objetivo corar colônias de bactérias com a técnica de Gram e observar as diferenças tintoriais entre essas colônias.
2. METODOLOGIA 
2.1 Local 
No dia 2 de maio de 2019, sob orientação do professor Francisco Cesino de Medeiros Júnior, ocorrou no Laboratório. Multidisciplinar II do Centro Universitário de Ciências e Tecnologia do Maranhão - UNIFACEMA, Caxias - MA. 
2.2 Material
Swab estéril;
Lâminas;
Solução fisiológica;
Corantes para Gram. 
2.3 Procedimentos 
Preparou-se o esfregaço e desengordurou as lâminas com algodão embebido em álcool e deixou-se secar ao ar livre. Logo após, marcou com um lápis o lado da lâmina onde realizaremos o esfregaço e colocou-se sobre ela o material contendo os microrganismos. Passou o Swab estéril na região interna da boca movimentando-se circulares para pegar a saliva e deixou a lâmina secar ao ar livre. Em seguida, ele é passado rapidamente três ou quatro vezes através de uma chama aberta, processo chamado de fixação pelo calor.
Após, cobriu o esfregaço já fixado (no suporte) com solução de Cristal Violeta por 1 minuto. Escorreu o cristal violeta, lavar em fio de água e cobriu-se o esfregaço com Lugol por 1 minu to. Escorreu o Lugol, lavou-se em um fio de água. Descorou rapidamente com Álcool acetona por 20 segundos. Lavou-se rapidamente o esfregaço com fio de água. Cobriu-se o esfregaço com Fucsina diluída por 30 segundos. Lavou e secou ao ar livre.
Observou-se o esfregaço ao microscópio.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com base na aula prática, obtiveram-se resultados inesperados, observou-se estruturas que não foi possível a identificação. Na figura 1, é possível observar o resultado obtido em (a) e o resultado que deveria ter obtido em (b).
Figura 1: (a) estrutura encontrada e (b) estruturas das bactérias.
 (a) (b)
 
Fonte: Laboratório, Unifacema, 2019.
A parede celular da bactéria gram-positivas tem espessuras de 20 a 50nm e é formada quase exclusivamente por uma molécula chamada peptidioglicano. No entanto, a parede celular da bactéria gram-negativa é menos espessa e não tem contato direto com o meio ambiente, porque a parede representa outras camadas mais externas (Barbosa, Torres, 2005).
A coloração de Gram, provavelmente é a coloração diferencial mais utilizada, a partir das técnicas desenvolvidas pelo dinamarquês Hans Christian Gram em 18844. Na coloração gram, as células bacterianas primeiramente absorvem o cristal violeta, e então acrescenta-se iodo, que vai agir como um mordente, ou seja, uma substância química que ajuda na retenção do corante em determinadas células (Pelczar Jr et al., 2008).
Ao realizar a fixação, deve ter bastante cuidado para que o calor não seja em excesso, pois os microrganismos poderão ser incinerados e serão vistos como células distorcidas e restos celulares. Determinadas estruturas, tais como as cápsulas encontradas em alguns microrganismos, são destruídas na fixação pelo calor, então essa é uma possível justificativa para que a prática não tenha atingido o objetivo esperado (Black, 2002).
4. CONCLUSÃO
Foi possível observar na prática, a partir do modelo dado pelo professor, as estruturas da parede das bactérias gram-positivas, que tem a coloração cristal violeta e as gram-negativas, cuja não retém o corante cristal violeta. Então possível diferencias uma da outra através da coloração de cada. A prática chegou ao objetivo esperado que é observar essa diferença de cor entre as colônias, mas a lamina feita pela bancada não chegou ao objetivo. Sendo que uma das justificativas vem a ter ido a técnica de fixação. 
REFERÊNCIAS
BARBOSA, H. R., TORRES, B. B. Microbiologia básica. São Paulo, Rio de Janeiro, Ribeirão Preto, Belo Horizonte: Editora Atheneu, 2005.
BLACK, J. G. Microbiologia: fundamentos e perspectivas. 4°ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S. A., 2002.
BOURBEAU P; RILEY J; HEITER BJ; MASTER R; YOUNG C; PIERSON C. Use of the BacT/Alertblood culture system for culture of sterile body fluids other than blood. J Clin Microbiol. 36(11): 3273-7, 1998.
Coloração de Gram Disponível: https://www.portalsaofrancisco.com.br/biologia/coloracao-de-gram acessado: 08/05/2019.
DIAZ P. J., GARCIA C., Utility Of Cytocentrifugation In The Microscopic Bacterial Diagnosis Of Body Fluids. Rev. Chil. Infectol., Vol.19, No.3, P.167-173. Issn 0716-1018, 2002.
GAZOLA, K. C. P.; ANACLETO, C.; CISALPINO, P. S.; MOREIRA, E, S. A. Reino Monera: a Universidade na capacitação de Professores do Ensino Médio da Rede Estadual de Minas Gerais. In: XX Congresso Brasileiro de Microbiologia, 1999, Salvador. Caderno de Resumos do XX Congresso Brasileiro de Microbiologia, 1999. p. 409-409.
HENRY, J B. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais. 19 ed. São Paulo: Manole, 1999. 
OKURA, M. H.; RENDE, J. Microbiologia: roteiros de aulas práticas. Ribeirão Preto: Tecmedd, 2008. 
PELCZAR J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N. R. Microbiologia – conceitos e aplicações. Tradução: Celso Vataru Nakamura. São Paulo: Makron Books, 1996. 524 p.
RIBEIRO, M, C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia prática e roteiro manual; Atheneu; 1993.