Enzimas de Restrição e vetores de clonagem

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Enzimas de Restrição
Alunos: Bruno Rocha, Gleiciane Souza, Maria Eduarda Machado, Nathalia Marini e Pamela Junqueira 
Curso: Medicina Veterinária
Período: 5 º Semestre ‘B” 
 
Universidade Católica Dom Bosco - UCDB
Introdução
Também chamadas de Endonucleases de Restrição.
Usadas para cortar o plasmídeo e fracionar o DNA doador do gene de interesse. 
São enzimas obtidas de bactérias que as utilizam como defesa contra vírus. 
Responsáveis por reconhecer uma sequência específica de bases em uma molécula de DNA, clivar a molécula naquela sequência ou próximo dela. 
Elas são indispensáveis para:
 análise da estrutura dos cromossomos,
 no sequenciamento de DNA, 
 no isolamento de genes,
 na criação de moléculas novas de DNA que podem ser clonadas, 
 técnicas como RFLP. 
Uma característica marcante de muitos desses sítios de clivagem:
 possuem uma dupla simetria rotacional, 
sequência de reconhecimento é palindrômica 
sítios de clivagem são simetricamente posicionados
Essas sequências nunca ocorrem nos genes garantindo que nenhum deles será danificado durante o tratamento.
As sequências palindrômica são assim chamadas porque lembram palíndromos (como a palavra "arara" que pode ser lida em qualquer sentido). A sequência AATT//TTAA, por exemplo, é uma sequência palindrômica.
As enzimas atuam quando identificam determinadas sequências específicas – locais de restrição – geralmente compostas por 4-6 nucleotídeos.
 As enzimas cortam as ligações entre o grupo hidroxilo 3’ de um nucleotídeo e o grupo fosfato 5’ do nucleotídeo adjacente.
 
As extremidades das cadeias seccionadas – extremidades coesivas – quando contactam com outras resultantes da ação da mesma enzima podem emparelhar por complementaridade. 
 Os dois fragmentos emparelhados podem depois ser unidos pela enzima DNA ligase com consumo de ATP. 
Desenvolvimento
A tabela seguinte mostra alguns exemplos de enzimas de restrição, as sequências que reconhecem e a bactéria onde a encontraram. 
Enzimas de origem
Sequência de reconhecimento
EcoRIEscherichia coli
5’GAATTC 3’CTTAAG
BamHIBacillusamyloliquefaciens
5’GGATCC 3’CCTAGG
TaqlThermusaquaticus
5’TCGA 3’AGCT
XbalXanthomonasbadrii
5’ TCTAGA 3’AGATCT
Tipo I - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Têm sequências de reconhecimento específicas, mas cortam de forma inespecífica dentro da sequência de reconhecimento.
 Tipo II - Apenas possuem capacidade de corte. A metilação é feita por proteínas diferentes. Cortam sequências específicas de forma também específica.
			As mais utilizadas em biologia molecular. Existem mais de 600. Os locais de reconhecimento têm, quase sempre, 4 a 6 nucleotídeos e são geralmente caracterizados por "dyad symmetry" ( a sequência 5'-3' de uma das cadeias é semelhante à da cadeia complementar.
GGATCC CCTAGG 
Tipo III - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Cortam sequências específicas de forma também específica. 
Curiosidade 
Materiais e Métodos 
Artigos científicos;
Internet;
Material de outros autores;
Computador;
Revista de Ciências elementar.
Conclusão
As enzimas de restrição são importantes pois fragmentam DNA, fazem leituras de segmentos, reconhecem pequenas sequencias e produzem fragmentos que podem ser usados como sondas em diferentes técnicas, que são de extrema importância para a medicina. São enzimas que trabalham como fragmentadoras de sequências palindrômica garantindo que essas sequencias nunca ocorram no gene evitando fracassos de tratamento.
Artigo Cientifico 
..\Desktop\5 º Semestre Med. Veterinária\Biologia Molecular\Material para seminario\Diagnóstico e genotipagem do vírus da pseudoraiva por nested-PCR.pdf
file:///C:/Users/MAC%20Cliente/Downloads/CR-2112-14368-135726-1-PB%20(1).pdf
Referências
Revista de ciência elementar vol.2 - Moreira, C. (2014), Revista de Ciência Elementar, 2(02):0060 
Slides Descoberta da estrutura do DNA e da natureza do código genético pdf.
Protocolo de biologia molecular aplicada a produção animal - Gisele Batista Veneroni, Luciana Correia de Almeida Regitano – unidade 6;
file:///C:/Users/MAC%20Cliente/Downloads/CR-2112-14368-135726-1-PB%20(1).pdf
Vetores de Clonagem 
Introdução
Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA que leva até à célula hospedeira o DNA alvo, dando origem a replicação;
Deve apresentar uma sequência que permite a sua replicação no interior de uma célulahospedeira bacteriana;
Apresenta um local de clonagem, isto é, um local para inserir o DNA alvo.
Existem 4 tipos de vetores de clonagem:
Plasmídeos;
Fagos;
Cosmídeos;
YAC’s(yeastartificialchromosomes).
De um modo geral, o procedimento de clonagem, independentemente do vetor, engloba uma fase inicial de tratamento e o DNA em estudo com enzimas de restrição, de modo a originar terminais complementares; 
O passo seguinte corresponde à união do DNA alvo ao vetor com a DNA ligase;
 Em seguida, introduz o DNA alvo na célula hospedeira por transformação;
 Finalmente, selecionam-se as células que contêm o DNA alvo recorrendo a marcadores como é a resistência a antibióticos.
Desenvolvimento
Algumas características que um vetor de clonagem deve apresentar:
Possuem locais de reconhecimento para enzimas de restrição;
Permitem a replicação;
Fácil isolamento;
Pequenas dimensões;
Permitir a sua multiplicação dentro da célula com um elevado número de cópias;
Também precisa ser relativamente pequeno, sendo o seu tamanho ideal inferior a 10 Kb.
1. O vetor funciona como um veículo que transporta o gene para o interior da célula hospedeira, que é normalmente uma bactéria, embora outras células vivas possam ser utilizadas. 
2. Dentro da célula hospedeira o vetor multiplica-se, produzindo numerosas cópias idênticas não só de si próprio, mas também do gene que transporta. 
3. Quando a célula hospedeira se divide, a sua descendência recebe cópias das moléculas de DNA recombinante, continuando depois a replicação dos vetores. 
 4. Após um grande número de divisões celulares, é produzido uma colónia ou clone, de células hospedeiras idênticas. Cada célula no clone contém uma ou mais cópias da molécula de DNA recombinante. 
5. O gene transportado pela molécula recombinante é agora conhecido como sendo clonado. 
Como trabalha os vetores:
Plasmídeos
São pequenas moléculas de DNA de cadeia dupla, que contêm os elementos necessários à sua replicação e um gene que confere resistência a um antibiótico. 
Podem estar presentes em duas ou mais cópias na célula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases).
Sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, são utilizados como vectores de clonagem. 
Muitas vezes, são utilizados genes que conferem resistência a um antibiótico, destacando-se devido à sua grande utilização, o gene que confere resistência à ampicilina. Assim, as células que possuem este gene são capazes de crescer em meios com ampicilina, enquanto que as restantes não sobrevivem.
 Figura 1: Plasmídeo
 Figura 2: Clonagem em bacteriófagos 
Materiais e Métodos 
Artigos científicos;
Internet; 
Material de outros autores; 
Computador;
Revista de Ciências elementar.
Conclusão
Vetores de clonagem trabalham como transportadores de gene para o interior de uma célula hospedeira onde irá ocorrer a replicação, ou seja, sem as fases realizadas pelos vetores não pode haver replicação.
Referência 
Material para seminario\Vetores-de-clonagem.pdf
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/1720661/course/section/530598/Aula%2011%20-%20Tecnologia%20do%20DNA%20recombinante.pdf
Vídeo:
https://www.youtube.com/watch?v=EDF_T0t7gN0
 Obrigada !
Para descontrair ..
FIM !