BIologia molecular

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AULA 6:
VETORES
Clonagem molecular
· CONCEITO
· O termo “clonagem” vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial.
· A metodologia do DNA recombinante utiliza a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes:
· Primeiro o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de VETOR para formar o que se chama de DNA recombinante.
· Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada.
· Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.
Clonagem molecular
· Exemplo da insulina
Escolha do vetor para clonagem
· O vetor deve ser uma molécula relativamente pequena para conveniência da manipulação.
· Deve ser capaz de replicar-se prolificamente na célula, amplificando também o fragmento de DNA inserido (inserto).
· Outro requisito importante é que deve possuir sítios de restrição que possam ser usados como locais para inserção do DNA a ser clonado.
· Deve possuir também em sua estrutura mecanismos que facilitem sua identificação e recuperação da molécula recombinante.
· Há muitos vetores de clonagem em uso e a escolha entre eles depende do tamanho do segmento de DNA a ser clonado.
· Dessa forma, consideraremos os seguintes tipos a serem usados.
· Plasmídeos;
· Fagos;
· Cosmídeos;
· Cromossomos artificiais de leveduras e bactérias (Yac’s e Bac’s).
Plasmídeos
· Plasmídeos bacterianos são pequenas moléculas de DNA circular que são distintas do cromossomo bacteriano.
· Eles replicam seu DNA independentemente do cromossomo bacteriano.
· Muitos tipos de plasmídeos têm sido encontrado em bactérias. Sua distribuição é geralmente esporádica. Algumas células possuem plasmídeos, outras não.
· Em algumas células de E. coli podemos encontrar o plasmídeo “F”, o qual confere resistência a essas células. O plasmídeo F pode ser usado como um vetor para carrear grandes insertos de DNA.
· Entretanto, os plasmídeos que são rotineiramente usados como vetor são aqueles que trazem consigo genes de resistência a drogas. Esses genes são úteis porque esse fenótipo pode ser usado para selecionar não só as células transformadas pelos plasmídeos, mais também por vetores contendo o DNA recombinante.
· Plasmídeos são também eficientes meios de amplificar DNA clonado porque há muitas cópias por célula.
Plasmídeos
pBR322 e pUC18
Fagos
· Bacteriófago:
· É um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular.
· Biologia do fago:
 
· O fago é um parasita obrigatório da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactéria hospedeira para a sua multiplicação. Após a infecção da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias:
· Estado lítico: o DNA do fago permanece na bactéria como uma molécula independente, havendo a ativação de alguns genes do fago e a concomitante inativação de outros, dentro de um programa estritamente definido.
· Como resultado o cromossomo do fago é replicado ativamente, ocorre a síntese das proteínas da capa e da cauda, formam-se novas partículas virais. Em aproximadamente 45 minutos após a infecção a célula hospedeira é lisada havendo a liberação de cerca de 100 novos fagos.
Fagos
· Estado lisogênico: neste caso o DNA do fago é integrado no cromossomo da bactéria passando a ser chamado profago. No estado lisogênico, todos os genes do profago estão inativos com exceção do gene que produz a proteína repressora. A bactéria hospedeira carregando o profago multiplica-se e este é replicado passivamente e distribuído para as bactérias descendentes.
· 	Em condições naturais a opção entre seguir o estado lítico ou lisogênico depende das condições do meio. Assim, via de regra em meio rico em nutrientes o estado lítico é preferencial, por exemplo o fago na bactéria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como é o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisogênico. Em condições experimentais, o estado a ser seguido depende de um balanço entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genéticos da bactéria hospedeira e do bacteriófago. 
Biologia dos fagos
Fagos
· Genoma do fago :
· O bacteriófago é uma partícula viral constituída de aproximadamente 50% de proteínas e 50% de DNA.
· O DNA do fago , na forma como ele é isolado da partícula viral, é uma molécula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molécula contém uma fração de DNA fita simples com cerca de 12 nucleotídeos, os quais são complementares na sequência de bases e através delas é que o DNA assume a forma circular quando ele é injetado na célula hospedeira.
· Estas extremidades são denominadas de sítio cos. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 proteínas, cujos genes tem um cronograma de expressão bem definido, o que determina a instalação do estado lítico ou lisogênico.
Fagos
· O uso do fago como vetor de clonagem molecular:
· Durante o ciclo lítico, os genes envolvidos no processo de lisogênia são dispensáveis e consequentemente a chamada região de integração do genoma do fago pode ser totalmente substituída por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alteração nos processos envolvidos na via lítica.
· Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem é que o DNA inserido no fago é empacotado in vitro. Embora a eficiência de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos são empacotados teremos 100% de eficiência na infecção da E.coli hospedeira.
· Este processo é altamente eficiente quando comparado com o da transformação bacteriana com plasmídeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de 108 transformantes por µg de DNA o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos são transformados na E.coli hospedeira.
Clonagem no fago
Cosmídeos
· São vetores híbridos de fagos λ e plasmídeos, e seus DNA podem replicar na célula como o plasmídeo ou ser empacotado como os fagos.
· Entretanto, cosmídeos podem carrear insertos de DNA cerca de três vezes o tamanho dos carreados por fagos λ (tamanho aproximado de 45 Kb).
· O DNA do cosmídeo é injetado no interior da célula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmídeo normal, sem expressão de qualquer função do fago. As células infectadas serão selecionadas com base na resistência adquirida a um determinado antibiótico. A figura ilustra um típico processo de clonagem em cosmídeo.
Clonagem em cosmídeos
YAC - Yeast Artificial Chromosome
· São uma variação de um vetor de cópia única, que contém seqüências centroméricas (CEN) e seqüências teloméricas, que são seqüências das extremidades dos cromossomos. A presença de seqüências teloméricas nestes vetores permite que sejam replicados como moléculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal.
· YAC não são utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, têm se mostrado uma ferramenta valiosa na caracterização de grandes segmentos genômicos na medida em que é possível clonar em um YAC fragmentos que vão de 100 a 2000 Kb.
· BAC: (bacterial artificial chromosome). Vetor utilizado na clonagem de DNA genômico, baseado no fator F de plasmídeo que assegura que o plasmídeo seja mantido em pequeno número de cópias na bactéria.
Aula 7:
Bibliotecas genômicas e de cDNA
Introdução
· A tecnologia do DNA baseia-se em diferentes meios para se estudar uma seqüência específica de DNA de uma população complexa de DNA.
· Clonagem do DNA:
· Técnica que permite que um fragmento específico de DNA pode ser seletivamente amplificado in vivo e posteriormente purificado de um homogeinado.
· Não obstante, sua estruturae função podem ser ainda determinadas, por exemplo: através de seu seqüenciamento, através de estudo de sua expressão in vivo, etc. 
Introdução
· Dessa forma, a clonagem molecular consiste no isolamento e propagação de 	moléculas de DNA idênticas.
· inserto + vetor = rDNA
· rDNA + célula hospedeira = transformação
Passos para a clonagem
· Construção de uma molécula de DNA recombinante:
· Ligação covalente do fragmento de DNA desejado (alvo) e do replicon (vetor). 
· Consiste no corte do DNA alvo e do vetor com uma enzima de restrição e sua recombinação utilizando DNA ligase. 
· Transformação:
· O DNA recombinante (construção) é transferido para uma célula hospedeira (bactéria ou levedura) na qual ele pode replicar-se independentemente do cromossomo da célula hospedeira.
· Propagação seletiva dos clones celulares:
· Propagação das células transformadas em meio de cultura seletivo (sólido) para separar as colônias;
· Colônias isoladas da placa são posteriormente expandidas em meio de cultura líquido.
· Isolamento dos clones: 
Construindo uma biblioteca de DNA
· Um dos principais objetivos da tecnologia do DNA recombinante é a clonagem de um gene em particular ou de um fragmento gênico de interesse para o pesquisador.
· Os meios utilizados para clonar um gene específico depende:
· Do tamanho do gene em questão; e
· Do quanto se conhece sobre ele.
· Geralmente, o procedimento se inicia com uma amostra do DNA, como, por exemplo, DNA genômico eucariótico;
· O próximo passo é obter uma grande quantidades de clones feitos dessa amostra original de DNA;
· Essa coleção de clones é chamada de Biblioteca de DNA.
· A construção dessa biblioteca é considerada aleatório e o grande desafio é encontrar um clone (que possui o fragmento gênico de interesse) diante dessa grande quantidade de clones.
Tipos de bibliotecas
· Há vários tipos de bibliotecas, que podem variar de acordo com:
· O tipo de vetor usado;
· A origem (fonte) do DNA.
· Diferentes vetores de clonagem carreiam diferentes quantidades de DNA, então a escolha do vetor para a construção depende do tamanho do genoma (ou outra amostra do DNA) a ser inserido na biblioteca.
· Plasmídeos e fagos carreiam pequenas quantidades de DNA, dessa forma, esses vetores são utilizados para organismos com pequenos genomas
· Cosmídeos carreiam grandes quantidades de DNA, e outros vetores como os YACs e BACs carreiam quantidades ainda maiores de DNA.
· Facilidade de manipulação é outro fator importante na escolha do vetor. 
Tipos de bibliotecas
· Outra decisão importante é qual tipo de biblioteca construir. Se uma biblioteca genômica ou uma biblioteca de cDNA.
· Biblioteca genômica é feita de todo o DNA genômico do organismo em estudo e deve representar todo o seu acervo de genes. 
· Biblioteca de cDNA (ou DNA complementar) é feita de DNA sintetizado a partir de mRNA. Dessa forma, ela é desprovida de seqüências reguladoras (upstream e downstream) e de íntrons.
· Isso significa que cDNA de eucariontes podem ser transcrito e traduzido em proteína funcional em bactérias.
Tipos de bibliotecas
· A escolha entre um desses dois tipos de biblioteca depende da situação.
· Se um gene específico que é ativo em um tecido específico em uma planta ou animal está sendo expresso, então é sensato usar o respectivo tecido para isolar mRNAs e convertê-los em DNA e fazer uma biblioteca de cDNA daquela amostra.
· Essa biblioteca seria abundante em clones para esse determinado gene.
· A biblioteca de cDNA é baseada nas regiões transcritas do genoma, dessa forma ela é inevitavelmente menor que uma biblioteca genômica.
· Entretanto, bibliotecas genômicas são maiores e contêm genes na sua forma nativa incluindo íntrons e seqüências reguladoras.
· Se o propósito da construção da biblioteca é ter a clonagem do genoma por completo, então a biblioteca genômica é necessário para esse fim.
Biblioteca
genômica 
Biblioteca de cDNA
Purificação
de mRNA
Biblioteca de cDNA
· O primer para essa reação de síntese é provido por um fragmento de mRNA original.
· Como a DNA polimerase usada para sintetizar a segunda fita de DNA pode sintetizar a partir de fragmento de RNA ligado a extremidade 3’ da primeira fita de DNA formada, esse fragmento de RNA é usado como “primer” para a síntese dessa segunda fita.
· Esses fragmentos de RNA eventualmente são degradado durante os passos de clonagem subseqüentes.
· Como resultado, as seqüências de nucleotídeos na extremidade 5’ da molécula de mRNA original estarão ausentes na biblioteca de cDNA.
Síntese de
cDNA
Screening
da biblioteca
Diferença entre biblioteca de DNA genômico e de cDNA
Aula 8:
Hibridização e Blotting
Introdução
· A hibridização molecular é a associação de duas seqüências nucleotídicas complementares.
· Constitui um método de grande especificidade, porque permite detectar uma seqüência entre milhares de outras, sendo usada para identificar e, eventualmente, quantificar um “alvo” de RNA ou DNA particulares.
Introdução
· O uso de sondas (hibridização) é muito útil para o screening de uma biblioteca genômica, que é feito detectando-se “fago” ou “clones” contendo o gene de interesse.
· Para o genoma humano, cálculos mostraram que para uma probabilidade de 99% de sucesso requer um screening de 500.000 clones, o que seria obtido de forma rápida e eficiente utilizando-se a técnica de hibridização. 
Introdução
· São usados três métodos principais de hibridização:
· Hibridização em meio líquido;
· É feita durante a amplificação enzimática in vitro.
· Hibridização em suporte sólido;
· Usa membranas de nitrocelulose ou membranas sintéticas à base de nylon.
· A imobilização das seqüências (alvo + sonda) sobre a membrana permite uma separação simples por lavagem das seqüências não hibridizadas.
· Hibridização in situ.
· É usada para descobrir uma determinada seqüência de RNA ou DNA no interior de uma célula.
Hibridização in situ
Blotting
· É uma técnica usada para localização específica de uma macromolécula em uma determinada mistura (amostra).
· As macromoléculas são aplicadas em um gel de eletroforese para sua respectiva separação.
· Após separação, essas macromoléculas (proteínas, DNA e RNA) do gel são transferidas para um suporte sólido (superfície de uma membrana de nitrocelulose ou nylon), onde elas são facilmente localizadas através de sondas moleculares.
Western blotting
Southern blotting
Fragmentos de DNA são submetidos a uma eletroforese.
O gel é colocado em um tampão álcali e sobre o mesmo dispõe-se uma membrana de nitrocelulose que será coberta por várias camadas de papel absorvente (filtro).
Os fragmentos por capilaridade, migrarão para a membrana de nitrocelulose.
A nitrocelulose é removida e incubada com uma sonda marcada radioativamente que é complementar a seqüência de DNA alvo.
Um filme de raio-x é exposto à membrana.
Por causa da radioatividade emitida pela sonda, o filme após exposição irá revelar as bandas correspondentes aos fragmentos de interesse.
Comparando-se as bandas marcadas com o gel de eletroforese, revela-se, através do marcador de peso molecular, o número e tamanho do fragmento alvo.
Essa informação pode ser usada para se localizar a posição da seqüência ao longo do mapa de restrição.
Northern blotting
Blotting
Comparação entre os blotting
Aula 9:
Impressão digital de DNA
Introdução
· Impressão digital de DNA:
· É também conhecida como padrão polimórfico ou perfil de DNA ou, ainda, DNA fingerprint.
· Essa técnica tem utilidade nas mais variadas áreas da atualidade.
· Freqüentemente, os padrões polimórficos de DNA são utilizados:
· Reconhecimento de paternidade;
· Casos criminais;
· Estudos evolucionários;
· Avaliação de biodiversidade;
· Mapeamento de genes;
· Testes genéticos;
· Reconhecimento de cadáveres;
· Etc...
Introdução
· A impressão digital de DNA é baseada em marcadores moleculares.
· São fragmentos de DNA que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes.
· Os primeiros marcadores moleculares a serem utilizados foram os fragmentos produzidos pela digestão do DNA com enzimas de restrição.· A variação do tamanho dos fragmentos obtidos de diferentes indivíduos deu origem à classe de marcadores denominada RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Marcadores RFLP
· Desenvolvido por Alec Jeffreys na Inglaterra no início dos anos 80.
· Este processo é baseado no fato de que a distância entre os sítios de restrição no DNA difere entre os indivíduos.
· Os sítios de restrição de um determinado indivíduo são como uma impressão digital, pois permitem a identificação de forma precisa e inequívoca do indivíduo.
· Se o DNA de dois indivíduos for cortado com uma mesma enzima, obtêm-se dois padrões de fragmentação do DNA, que são distinguíveis pela variação no comprimento dos fragmentos gerados. 
Marcadores RFLP
· Cada padrão de fragmentos é único de cada indivíduo, a exemplo de uma impressão digital.
· A ocorrência de muitos padrões de fragmentos com diferentes comprimentos é denominada polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição ou simplesmente RFLP.
Marcadores RFLP
· Procedimentos para obtenção de RFLP:
· Isolar o DNA de um indivíduo;
· Digestão com enzimas de restrição;
· Eletroforese em gel de agarose;
· Transferência para um suporte sólido (membrana);
· Hibridização com sondas radioativas;
· Sensibilização de filme radiográfico (autoradiograma).
Marcadores RFLP
Marcadores RAPD
· Dois grupos de pesquisadores propuseram em 1990, independentemente, o uso de pequenos iniciadores aleatórios na reação em cadeia da polimerase (PCR) como método de geração de marcadores moleculares polimórficos.
· Essa técnica, conhecida como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), utiliza um oligonucleotídeo sintético como iniciador do processo de amplificação, que produz um polimorfismo detectado pela presença ou ausência de bandas discretas de DNA. 
Marcadores RAPD
· A técnica de RAPD é mais simples e mais rápida que a do RFLP.
· Ela requer menores quantidades de DNA;
· Não envolve o uso de sondas radioativas;
· Demanda menos mão-de-obra;
· Tem sido utilizada com sucesso principalmente em espécies vegetais, pois não detecta muita variação na espécie humana e muitos outros animais.
Marcadores RAPD
· Procedimentos:
· Extração do DNA dos indivíduos a serem analisados;
· Realização da reação de amplificação;
· Utilizando um iniciador de polimerização do DNA diferente de cada vez;
· Um produto de amplificação é gerado para cada região cromossômica flanqueada por um par de sítios de iniciação.
· Os fragmentos amplificados são separados por eletroforese em um gel de agarose;
· Diferentes indivíduos produzem distintos padrões de fragmentos amplificados.
Técnica do RAPD
DNA na prática forense
· O método de identificação individual molecular (impressão digital de DNA) tem contribuído muito para soluções de casos forenses.
· O primeiro caso de grande repercussão do uso de DNA como evidência criminal ocorreu em 1986 na Inglaterra, com a exoneração de um suspeito de homicídio após análise de evidências de DNA coletadas na cena do crime e comparadas com o DNA do acusado.
· A partir de 1987, o FBI e vários laboratórios de criminalística passaram a utilizar os marcadores de DNA.
DNA na prática forense
· Amostras de sangue, saliva, pêlos, sêmen, etc. encontrados na cena do crime passaram a ser considerados evidencias contundentes e até mesmo utilizadas como instrumento de prova.
· Portanto, o perfil de DNA é uma simples e rápida maneira de se compararem seqüências de dois ou mais indivíduos.
Análise do DNA mitocondrial
· As células possuem grande número de mitocôndrias;
· A variabilidade dos perfis de DNA mitocondrial é substancialmente menor, uma vez que essa organela é de origem materna;
· É muito utilizado nos teste de:
· Paternidade;
· Identificação de indivíduos e corpos;
· Estudos de filogenia.
Testes de paternidade
· O teste de DNA é a mais precisa e confiável tecnologia disponível para identificação de paternidade.
· Normalmente, quando se deseja a identificação de um dos pais de um indivíduo, faz a análise do DNA do suposto pai, da mãe e do filho.
· O laudo de um teste de paternidade deve claramente relatar uma destas duas alternativas:
· O indivíduo testado está excluído e, portanto, não pode ser o pai biológico em questão.
· O indivíduo testado não está excluído da possibilidade de ser o pai biológico em questão.
· A estatística no laudo estabelece com qual probabilidade o indivíduo pode ser o pai biológico do filho considerado.
Precisão dos testes
· Os testes podem provar com 100% de certeza que um indivíduo não é o pai biológico de uma criança.
· No entanto, não existe ainda nenhum teste que prove com 100% de certeza que um indivíduo seja o pai biológico da criança (99,9%).
· Situação que podem resultar em menor precisão:
· Casamentos inter-raciais ou populações não padronizadas;
· Pai biológico é parente do suposto pai;
Aula 10:
Seqüênciamento de DNA
Introdução
· A determinação da seqüência de um ácido nucleico é atualmente muito simples de fazer graças aos processos tecnológicos e aos meios de informática moderna.
· No final de 1970, duas técnicas de seqüênciamento foram desenvolvidas, uma por MAXAN e GILBERT, a abordagem por clivagem química, e outra por SANGER, a abordagem enzimática. 
Introdução
· Ambos os procedimentos podem empregar a marcação de um nucleotídeo terminal, seguida pela separação e detecção dos oligonucleotídeos gerados.
· Método de Maxan-Gilbert:
· As necessidades para esse método incluem:
· Marcação do nucleotídeo terminal;
· Hidrólise seletiva da ligação fosfodiéster para cada nucleotídeo separadamente, produzindo fragmentos com 1, 2, 3 ou mais bases;
· Separação quantitativa dos fragmentos hidrolisados e
· Determinação quantitativa da marca adicionada na etapa 1.
· Quando as moléculas cortadas são tratadas com piperidina, o arcabouço do DNA é quebrado no sítio em que a base foi destruída. 
Método de Maxan-Gilbert
· Como conseqüência, gera-se uma série de fragmentos marcados, cujo comprimento depende da distância da base destruída à extremidade marcada da molécula.
· Por exemplo:
· Se existirem resíduos G situados a 3, 6 e 9 bases distantes da extremidade marcada, o tratamento da fita de DNA com substâncias que clivam em G originará fragmentos marcados de 2, 5 e 8 bases de comprimento.
· As séries de fragmentos marcados, obtidos de cada uma das quatro reações, são submetidas a um gel de acrilamida que permite a separação de fragmentos de DNA de acordo com o tamanho; o gel é auto-radiografado.
· O padrão de bandas no filme de raio-x é lido para determinar a seqüência do DNA.
Método de Maxan e Gilbert
Método de Sanger
· O procedimento de Sanger para o seqüênciamento baseia-se na terminação aleatória da cadeia de DNA durante a síntese enzimática.
· Os 2’,3’ didesoxinucleotídeos (ddNTP) de cada uma das quatro bases são preparados.
· Essas moléculas podem ser incorporadas ao DNA usando-se DNA polimerase; entretanto, uma vez incorporados a uma fita de DNA crescente, o ddNTP não pode formar uma ligação fosfodiéster com o próximo dNTP a ser incorporado.
Síntese interrompida
Método de Sanger
· Dessa forma, o crescimento daquela cadeia de DNA, em particular, é interrompido.
· O seqüênciamento de Sanger consiste de:
· Uma fita de DNA a ser seqüênciada;
· Um pequeno fragmento de DNA marcado (primer);
· Uma proporção, cuidadosamente controlada, de um determinado ddNTP e de seu dNTP normal;
· As outras três misturas.
· Se uma proporção correta de ddNTP:dNTP é definida, a reação resultará em uma série de fitas marcadas, cujos comprimentos dependem da localização de uma determinada base em relação à extremidade da molécula de DNA.
Método de Sanger
· Uma fita a ser seqüênciada junto com o primer marcado é dividida em quatro grupos de reações, usando a enzima DNA polimerase, cada uma contendo um dos quatro ddNTPs.
· Os fragmentos marcados resultantes são separados por tamanho em um gel de poliacrilamida e o gel é auto-radiografado; o padrão dos fragmentos obtidos fornece a seqüência do DNA.
Método de Sanger
Seqüênciamento automático de DNA