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Imunologia de crustáceos 
com ênfase em camarões 
 
 
 
Margherita Anna Barracco, Luciane Maria Perazzolo e 
Rafael Diego Rosa 
 
 
 
 
Laboratório de Imunologia Aplicada à Aqüicultura 
Departamento de Biologia Celular Embriologia e Genética 
Universidade Federal de Santa Catarina 
Florianópolis, Santa Catarina, Brasil 
 
 
 
 
 
2007 
 2 
SUMÁRIO 
 
 
RESUMO ................................................................................................................................ 03 
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 04 
1. SISTEMA IMUNE DE CRUSTÁCEOS ............................................................................ 05 
1.1 Células imunocompetentes ou hemócitos................................................................. 07 
1.2 Reações imune-celulares: fagocitose e formação de cápsulas e nódulos ................ 08 
1.3 Mecanismos líticos e degradativos .......................................................................... 11 
1.3.1 Enzimas lisossomais e espécies intermediárias reativas de oxigênio 
(ROIs) e de nitrogênio (RNIs) ................................................................................ 11 
1.3.2 Proteínas e peptídeos antimicrobianos (AMPs) ............................................. 15 
1.4 Proteínas de reconhecimento de padrão (PRPs) ...................................................... 21 
1.4.1 Proteínas que se ligam às �-1,3-glicanas: �GBP e GBP ................................ 22 
1.4.2 Proteínas que se ligam a ambos, LPS e às �-1,3-glicanas: LGBP ................. 26 
1.4.3 Proteínas mas-like (do inglês, masquerade-like proteins) ............................. 27 
1.4.4. Aglutininas e lectinas .................................................................................... 28 
1.4.5 Receptores Toll e TLR (do inglês, Toll-like receptor) ................................... 30 
1.5 Cascata proteolítica: sistema de ativação da pró-fenoloxidase (proPO) ................. 32 
1.6 Sistema de coagulação ............................................................................................. 37 
1.7 Defesas antivirais .................................................................................................... 39 
1.7.1 Sistema Interferon .......................................................................................... 40 
1.7.1.1 Vertebrados .......................................................................................... 40 
1.7.1.2 Camarões .............................................................................................. 42 
1.7.2 Sistema RNA de interferência (RNAi) .......................................................... 43 
1.7.3. Apoptose celular mecanismo antiviral ou pró-viral? .................................... 44 
1.7.4 Conceito de acomodação viral em camarões ................................................. 46 
1.7.5 Outros mecanismos antivirais ........................................................................ 48 
1.7.6 Mecanismos de evasão viral .......................................................................... 48 
2. IMUNOESTIMULANTES ................................................................................................. 49 
3. PARÂMETROS HEMATO-IMUNOLÓGICOS COMO INDICADORES DE SAÚDE .. 53 
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ...................................................................................... 60 
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 62 
 3 
RESUMO 
 
Dentre os crustáceos, os camarões assumem especial destaque em vista de sua grande 
importância comercial na aqüicultura mundial. O sucesso desta atividade vem contudo 
sofrendo graves limitações, devido aos constantes surtos de novas enfermidades, 
principalmente de origem viral, que causam mortalidades maciças e levam a prejuízos 
econômicos incalculáveis. O presente capítulo oferece uma visão geral e atualizada do 
sistema imune inato dos crustáceos, em especial de camarões, com base no recente 
progresso realizado, na elucidação dos diferentes mecanismos de defesa contra 
patógenos. No capítulo, são discutidos as reações celulares e humorais desencadeadas 
em resposta aos agentes infecciosos, os processos de reconhecimento e os diferentes 
mecanismos imunoefetores. Ênfase especial é dada às defesas antivirais, uma vez que os 
vírus constituem os principais agentes infecciosos a ameaçar seriamente a 
sustentabilidade da carcinicultura mundial. Finalmente, o capítulo discute ainda a 
utilização e eficácia de compostos imunoestimulantes. 
 4 
INTRODUÇÃO 
 
Os crustáceos pertencem a um grupo zoológico antigo e bem sucedido, constituído 
por mais de 40 mil espécies, incluindo inúmeras espécies muito apreciadas para 
consumo humano, como camarões, lagostas, lagostins, caranguejos e siris. 
O cultivo de crustáceos, principalmente de camarões, desponta neste contexto 
como uma importante alternativa para a produção rápida e em alta escala de espécies 
para alimentação humana, auxiliando ainda a proteger as populações naturais de uma 
extração excessiva. Atualmente, cerca de 30% dos camarões consumidos no mundo são 
provenientes de cultivo e as espécies marinhas mais cultivadas são os peneídeos 
Litopenaeus vannamei (40,66%), Penaeus monodon (37,41%) e Fenneropenaeus 
chinensis (10,97%) (FAO, 2007). A carcinicultura é responsável hoje por milhões de 
empregos em países tropicais emergentes e os principais produtores mundiais são a 
China e a Tailândia na Ásia e o Equador, México e Brasil na América Latina. 
O principal fator limitante para o sucesso da carcinicultura mundial consiste 
atualmente no controle das infecções, principalmente as de origem viral. As altas 
densidades populacionais, usualmente requeridas nos cultivos, propiciam a rápida 
propagação dos agentes infecciosos, resultando geralmente em mortalidades maciças e 
levando, por conseqüência, a prejuízos econômicos incalculáveis. No momento, a 
profilaxia e o controle de doenças nos cultivos restringem-se basicamente a práticas 
adequadas de manejo e à redução das condições de estresse, uma vez que os fatores que 
determinam o estado de saúde dos camarões são ainda muito pouco conhecidos. Neste 
contexto, o estudo do sistema imune de crustáceos desponta como uma estratégia 
recente e promissora, visto que permite conhecer as bases da susceptibilidade e 
resistência destes animais a microrganismos patogênicos e parasitas, além de fornecer 
subsídios valiosos para o estabelecimento de parâmetros de saúde e imunomarcadores 
para seleção genética de animais mais resistentes a infecções. 
 
 
 5 
1. SISTEMA IMUNE DE CRUSTÁCEOS 
 
Os invertebrados marinhos estão em constante contato, em seu ambiente natural, 
com uma grande diversidade de microrganismos, incluindo múltiplos vírus, que podem 
constituir uma séria ameaça à sua sobrevivência. Contudo, o evidente sucesso desse 
grupo zoológico ao longo dos mais de 500 milhões de anos de sua história evolutiva 
confirma a presença de um sistema imunológico eficiente e capaz de protegê-los contra 
a invasão por agentes causadores de doenças. 
A primeira linha de defesa desses animais é conferida pela presença de uma 
carapaça externa rígida ou exoesqueleto, que funciona como uma barreira físico-
química protetora. Além disso, todo o trato digestivo desses animais, que é a principal 
via de entrada de microrganismos, é também revestido por uma camada quitinosa e 
oferece um ambiente ácido e repleto de enzimas, capaz de inativar e digerir a maioria 
dos microrganismos que não faz parte de sua microbiota natural. Quando essas barreiras 
são transpostas, não sendo suficientes paraimpedir a penetração de patógenos, 
desencadeia-se no hospedeiro uma série de reações imunológicas complexas com o 
objetivo de neutralizar e eliminar os agentes invasores. 
A exemplo de outros invertebrados, os crustáceos apresentam apenas um sistema 
imune inato, diferentemente dos vertebrados que possuem, além desse, um sistema 
imune adaptativo. O sistema imune inato, filogeneticamente mais antigo, é encontrado 
em todos os organismos multicelulares, incluindo invertebrados e plantas, enquanto o 
sistema adaptativo ocorre apenas nos vertebrados. Este último caracteriza-se pela 
presença de uma infinidade de receptores e anticorpos altamente específicos e pela 
indução de células de memória, que garantem uma resposta de defesa altamente 
eficiente e específica para os mais diversos patógenos. Esta resposta decorre da 
presença de uma linhagem celular linfocítica, presente apenas nos vertebrados, e em 
quem se apóiam todos os mecanismos de especificidade e de memória imunológica. 
Desta forma, sua ausência nos invertebrados inviabiliza qualquer tentativa de 
desenvolvimento de vacinas, na concepção clássica da palavra, diminuindo assim de 
forma substancial, a possibilidade de se prevenir e controlar infecções em crustáceos. 
O sistema circulatório dos crustáceos é do tipo aberto ou semi-aberto, por onde 
transita um tecido fluido denominado hemolinfa, correspondente ao sangue dos 
vertebrados (Fig. 1). Na hemolinfa são transportados continuamente nutrientes, 
excretas, oxigênio, hormônios e outras moléculas importantes para os diferentes órgãos 
 6 
desses animais. Devido à sua fluidez e pela capacidade de atingir diretamente todos os 
tecidos dos crustáceos, a hemolinfa contém ainda todos os componentes do sistema 
imunológico. 
 
 
 
Figura 1: Sistema circulatório aberto/semi-aberto de camarão e órgãos associados. C: coração; 
HP: hepatopâncreas; OHA: órgão hematopoiético antenal; OHD: órgão hematopoiético dorsal; 
OHV: órgão hematopoiético ventral; OL: órgão linfóide; VD: vaso dorsal (adaptado de Bachère 
et al., 2004). 
 
 
A hemolinfa é composta por uma fração celular, representada pelas células 
circulantes ou hemócitos, e por uma fração líquida, constituída pelo plasma que contém 
diferentes fatores humorais. As respostas imune-celulares e humorais atuam de forma 
integrada nos crustáceos, protegendo-os contra a invasão de microrganismos e parasitas 
e garantindo assim sua integridade corpórea e homeostática. 
Os principais sistemas de defesa atualmente reconhecidos nos crustáceos são: (1) 
coagulação da hemolinfa; (2) melanização mediada pelo sistema pró-fenoloxidase; (3) 
reconhecimento e aglutinação celular mediada por lectinas; (4) sistemas antibacterianos, 
antifúngicos e antivirais mediados por peptídeos, RNA de interferência e por proteínas 
de reconhecimento padrão; (5) produção de espécies reativas de oxigênio e de 
nitrogênio; e (6) sistema fagocítico e de encapsulamento (vide revisão de Iwanaga e 
Lee, 2005). 
 7 
1.1 Células Imunocompetentes ou Hemócitos 
 
As respostas imune-celulares dos crustáceos estão basicamente relacionadas às 
células da hemolinfa ou hemócitos, e incluem a fagocitose de microrganismos, a 
formação de cápsulas e nódulos em torno de partículas estranhas e os mecanismos 
citotóxicos e/ou degradativos intracelulares utilizados para degradar e eliminar os 
agentes invasores. Muitas dessas moléculas microbicidas encontram-se armazenadas 
dentro de vesículas ou grânulos de certas populações de hemócitos, enquanto outras são 
constitutivamente secretadas para a hemolinfa, atuando em diferentes cascatas 
imunológicas. Além de atuarem nas respostas de defesa, os hemócitos ainda participam 
no reparo de ferimentos, esclerotização da cutícula e acredita-se ainda que estejam 
envolvidos no metabolismo e transporte de carboidratos (Jiravanichpaisal et al., 2006). 
A compreensão das reações imune-celulares dos crustáceos depende, de forma 
crucial, da identificação e caracterização de suas células imunocompetentes. Apesar de 
não haver ainda uma classificação uniforme e consensual para estas células, três tipos de 
hemócitos são usualmente reconhecidos e descritos nos crustáceos (Figs. 2A-F): 
hemócitos hialinos (HHs), hemócitos semi-granulares ou com grânulos pequenos 
(HGPs) e hemócitos granulares ou com grânulos grandes (HGGs) (vide revisões de 
Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Johansson et al., 2000). A falta de uniformidade na 
identificação dos hemócitos deriva principalmente do fato de estas células serem muito 
lábeis e reativas, alterando rapidamente suas características morfofisiológicas in vitro, o 
que torna seu estudo mais difícil do que aquele dos leucócitos dos vertebrados. 
A ativação dos hemócitos dos crustáceos resulta geralmente em seu espraiamento 
e degranulação, havendo a liberação de uma grande variedade de efetores imunológicos 
para o plasma. Nestes últimos anos houve um grande progresso no estudo destas 
células, devido ao desenvolvimento de várias soluções anticoagulantes específicas, além 
de meios capazes de estabilizar adequadamente os hemócitos in vitro. Além do mais, a 
separação das diferentes populações de hemócitos por gradientes de Percoll, a produção 
de anticorpos monoclonais, a clonagem e caracterização de genes que codificam para 
efetores imunológicos nos diferentes tipos celulares vêm contribuindo para uma maior 
compreensão do funcionamento das diferentes populações hemocíticas. 
De uma maneira geral, os HHs de crustáceos são usualmente descritos como os 
menores hemócitos, com uma alta relação núcleo-citoplasmática e contendo de nenhum 
a poucos grânulos (Figs. 2A,D). De acordo com alguns autores, esse tipo de hemócito 
 8 
pertence a uma linhagem celular distinta daquela dos hemócitos granulares e estão 
essencialmente relacionados aos mecanismos de coagulação (Hose et al., 1990). Outros 
autores acreditam, no entanto, que os HHs sejam as principais células fagocíticas 
(Johansson et al., 2000) e que este tipo celular seja uma forma intermediária da 
linhagem de hemócitos granulares (van de Braak et al., 2002a). Por sua vez, os 
hemócitos granulares (HGPs e HGGs) são descritos como células de citoplasma mais 
abundante e ricos em grânulos de diversos tamanhos e conteúdos (Figs. 2B,C,E,F). 
Alguns autores apontam os HGPs como formas intermediárias e que, após 
amadurecimento, transformam-se em HGGs (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; 
Söderhäll e Cerenius, 1992; Gargioni e Barracco, 1998). Quanto à função, os hemócitos 
granulares parecem estar envolvidos principalmente na fagocitose de microrganismos, 
na formação de cápsulas e nódulos e também na produção de moléculas tóxicas e 
microbicidas (Hose et al., 1990; Gargioni e Barracco, 1998; van de Braak et al., 2002b). 
Em caranguejos e lagostins sugere-se que os HGPs atuem nos processos de 
encapsulação, os HGGs no armazenamento de moléculas imunoefetoras e os HHs na 
fagocitose de microrganismos (Johansson et al., 2000). 
 
 
1.2 Reações Imune-celulares: Fagocitose e Formação de Cápsulas e Nódulos 
 
Após a invasão por microrganismos, os hemócitos migram para os sítios de 
infecção gerando uma resposta inflamatória clássica. Nos sítios de infecção ocorre então 
a fagocitose dos microrganismos e/ou a formação de agregados celulares densos em 
torno das partículas invasoras, podendo culminar na liberação de diferentes moléculas 
imunoefetoras, capazes de neutralizar e degradar os patógenos. 
No processo de fagocitose, o agente estranho é englobado e interiorizado dentro de 
um fagossomo, que posteriormente se funde com as vesículas/grânulos presentes no 
citoplasma (Fig. 2G). Uma vez fundidas essas duas estruturas, um arsenal de compostos 
degradativos e microbicidas são liberados nos vacúolos fagocíticos, levando à 
neutralização/degradação das partículas endocitadas (Martin et al., 1996). Afagocitose 
de microrganismos já foi bem demonstrada em diferentes espécies de crustáceos (Hose 
et al., 1990; Martin et al., 1996; Gargioni e Barracco, 1998; Muñoz et al., 2002). 
Embora exista ainda controvérsia na literatura no que se refere aos tipos de hemócitos 
envolvidos nos processos de fagocitose em crustáceos, sabe-se que esse mecanismo 
 9 
extremamente importante constitui a primeira linha de defesa celular contra a invasão de 
microrganismos. 
 
 
Figura 2: Tipos de hemócitos (A-F) e reações celulares de defesa em crustáceos (G-J). A, D: 
hemócitos hialinos (HHs) de camarões observados ao microscópio de contraste de fase e 
eletrônico de transmissão, respectivamente; B, E: hemócitos com grânulos pequenos (HGPs); C, 
F: hemócitos com grânulos grandes (HGGs). G: fagocitose de uma levedura por um hemócito 
de Litopenaeus vannamei; H: encapsulamento in vitro do nematóide Panagrellus redivirus por 
hemócitos de Macrobrachium rosenbergii; I: encapsulamento in vitro de hifas do fungo 
Ganoderma sp por hemócitos de Farfantepenaeus paulensis, com forte reação de melanização; 
J: nódulo hemocítico no hepatopancreas de L. vannamei com agregados bacterianos no centro 
(reproduzido de Covarrubias, 2004). 
 
 
Quando a cavidade corpórea dos crustáceos é invadida por uma quantidade maciça 
de microrganismos ou por partículas/patógenos de grande tamanho cuja fagocitose não 
é possível, desencadeia-se a formação de nódulos e cápsulas celulares, respectivamente. 
 10 
A formação de cápsulas caracteriza-se pela agregação de várias camadas de hemócitos 
em volta de patógenos de grande tamanho, como hifas de fungos, nematódeos e 
determinadas formas de protozoários, promovendo o seu aprisionamento dos tecidos do 
hospedeiro e levando a sua posterior destruição (Fig. 2H,I). A formação de nódulos, por 
outro lado, ocorre em torno de uma grande quantidade de microrganismos invasores que 
também são aprisionados em agregados celulares (Fig. 2J), semelhantes às cápsulas. 
Esta reação evita sua disseminação e produção de septicemia. 
Nas regiões mais centrais dos nódulos é comum observar a fagocitose de 
microrganismos pelos hemócitos que estão em contato mais próximo dos 
microrganismos (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Söderhäll e Cerenius, 1992). Ambas 
as reações de encapsulamento e formação de nódulos levam não apenas ao 
aprisionamento de patógenos, como também limitam as respostas imunológicas apenas 
à região agredida. Esta resposta localizada, durante as reações imunológicas, ajuda a 
proteger os tecidos do hospedeiro dos danos causados pelas moléculas tóxicas e 
degradativas produzidas durante o processo inflamatório. Nas regiões mais centrais 
desses agregados de hemócitos, ocorre também a presença de uma pigmentação escura, 
ou melanização, resultante da liberação de compostos imunoefetores presentes nas 
células hemocíticas (Fig. 2I) que serão discutidos adiante (Cerenius e Söderhäll, 2004). 
O número de hemócitos livres na hemolinfa pode diminuir drasticamente durante 
uma infecção, como resultado de sua infiltração nos tecidos infectados e sua utilização 
na formação de nódulos e cápsulas. Deste modo, novos hemócitos precisam ser 
produzidos e liberados para a circulação a partir dos tecidos hematopoiéticos (Johansson 
et al., 2000; van de Braak et al., 2002a; Söderhäll et al., 2003; Jiravanichpaisal et al., 
2006). Esses tecidos são geralmente constituídos por lóbulos densos, situados na região 
dorsal e dorso-lateral do estômago e do intestino anterior (região epigástrica), e também 
na base dos maxilípedes, no caso de camarões peneídeos (van de Braak et al., 2002a) 
(Fig. 1). Os tecidos hematopoiéticos apresentam uma alta taxa de proliferação celular e 
são os responsáveis pela diferenciação e a maturação dos hemócitos que serão liberados 
na hemolinfa (van de Braak et al., 2002a; Söderhäll et al., 2003). 
A identificação de um ou mais progenitores celulares, assim como a distinção das 
linhagens hemocíticas produzidas é ainda controversa (van de Braak et al., 2002a; 
Söderhäll et al., 2003; Bachère et al., 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). Apesar de os 
tecidos hematopoiéticos serem os principais responsáveis pela produção de hemócitos, 
evidências da divisão dessas células na hemolinfa já foram relatadas nos camarões 
 11 
peneídeos Marsupenaeus japonicus (Sequeira et al., 1996) e Farfantepenaeus paulensis 
(Gargioni e Barracco, 1998), apesar da freqüência de divisão ser muito baixa. 
Outro órgão bastante irrigado e importante nas reações celulares é o órgão linfóide 
(Fig. 1). Esse órgão, ausente em muitas espécies de crustáceos decápodos, está 
localizado na parte anterior do hepatopâncreas de camarões e parece participar nos 
processos eliminação e depuração de agentes patogênicos, havendo muitas vezes a 
formação de corpos esferoidais durante as infecções. Não está claro se o processo de 
fagocitose ocorre principalmente nesse órgão ou se os hemócitos contendo 
microrganismos já fagocitados migram para esse local para realizar sua depuração (van 
de Braak et al., 2002b). 
 
 
1.3 Mecanismos Líticos e Degradativos 
 
1.3.1 Enzimas lisossomais e espécies intermediárias reativas de oxigênio (ROIs) e 
de nitrogênio (RNIs) 
 
Como já mencionado anteriormente, após a fagocitose dos microrganismos, estes 
são aprisionados em vacúolos fagocíticos intracelulares que se fundem com os grânulos 
lisossomais. Estes se caracterizam pelo seu pH ácido e pela presença de uma ampla 
variedade de enzimas hidrolíticas, capazes de matar e degradar a grande maioria dos 
micróbios invasores (Fig. 3). Por ocasião da fagocitose pode ainda ocorrer a liberação 
do conteúdo enzimático dos lisossomos para o plasma, a partir da degranulação dos 
hemócitos granulares. Dentre as enzimas liberadas, destaca-se a lisozima, capaz de 
romper polissacarídeos complexos ou peptidoglicanas (PGs) das paredes bacterianas, 
reação que será melhor discutida na próxima secção. 
Além da destruição dos microrganismos invasores pelas enzimas lisossomais, 
observa-se ainda, durante as reações imune-celulares, em especial na fagocitose, a 
produção e liberação de moléculas altamente tóxicas, que auxiliam na morte e 
degradação do agente invasor. Neste momento, ocorre um importante aumento no 
consumo intracelular de oxigênio, chamado de burst respiratório, que resulta na 
produção de uma variedade de espécies intermediárias altamente reativas de oxigênio 
(do inglês, ROIs) e de nitrogênio (do inglês, RNIs) (vide revisões de Anderson, 1996; 
Roch, 1999; Bogdan et al., 2000). As ROIs são oxidoradicais que possuem elétrons 
 12 
livres ou não pareados em sua camada orbital mais externa, o que lhes confere uma 
elevada reatividade com estruturas e compostos próximos, tais como membranas 
celulares, proteínas e ácidos nucléicos (DNA). Sendo assim, funcionam como agentes 
microbicidas potentes, destruindo ou inibindo o crescimento dos microrganismos 
invasores (Anderson, 1996; Bogdan et al., 2000). 
 
 
Figura 3: Mecanismos degradativos e microbicidas associados aos hemócitos de crustáceos 
durante o processo de fagocitose. ROI: espécies reativas de oxigênio; RNI: espécies reativas de 
nitrogênio; AMPs: peptídeos antimicrobianos. 
 
 
A produção desses vários radicais está ligada à ativação de um complexo 
enzimático denominado NADPH oxidase, localizado na membrana celular e na 
superfície dos grânulos lisossomais (Fig. 4). Este complexo é ativado por componentes 
microbianos, tais como os lipopolissacarídeos (LPS) e lipoproteínas de bactérias e �-
glicanas de fungos (Bogdan et al., 2000). A ativação da NADPH resulta na redução do 
oxigênio molecular a ânion superóxido (O2-) que pode dismutar-se espontaneamente ou 
através da enzima intracelular superóxido dismutase (SOD), em peróxido de hidrogênio 
(H2O2). O H2O2 é um composto igualmente tóxicoe, se não for decomposto pela 
catalase do peroxissomo, pode difundir-se e atingir o meio extracelular (Warner, 1994). 
O O2- pode ainda ser convertido em outros componentes citotóxicos, como no radical 
hidroxila (-OH) e ânions hidroxila (OH-) pela reação de Haber-Weiss ou, após 
 13 
dismutação em H2O2, ácido hipocloroso (HOCl), oxigênio singlet (1O2) e em cloraminas 
pela ação da mieloperoxidase (MOP) (Bogdan et al., 2000) (Fig. 4). 
Além das ROIs, ocorre ainda a produção intracelular de espécies reativas de 
nitrogênio (RNIs), como o NO e o peroxinitrito (ONOO-), compostos altamente 
citotóxicos e microbicidas (Kröncke et al., 1997). O peroxinitrito é resultante da reação 
entre o óxido nítrico (do inglês, NO) com o ânion superóxido (Anderson, 1996; Murphy 
et al., 1998) (Fig. 4). 
 
 
Figura 4: Produção de espécies reativas de oxigênio (ROIs) e nitrogênio (RNIs) pelos 
hemócitos de crustáceos durante o processo fagocítico e outras reações celulares. CAT: catalase; 
iNOS: óxido nítrico sintase induzível; SOD: superóxido dismutase. As espécies reativas 
tóxicas/microbicidas estão representadas em vermelho. 
 
 
É importante salientar que a produção destas moléculas altamente tóxicas, 
importantes na destruição de patógenos invasores, pode também provocar danos sérios 
aos tecidos do hospedeiro. Para evitar esta auto-agressão, o hospedeiro conta 
basicamente com três mecanismos de proteção ou defesas antioxidantes. Os primeiros 
dois mecanismos são endógenos e envolvem a presença de enzimas intracelulares, como 
as enzimas antioxidantes SOD, catalase e glutationa peroxidase, capazes de 
degradar/neutralizar as ROIs, ou as enzimas de reparo, capazes de reparar os danos 
provocados pelas ROIs no DNA, membranas e proteínas do hospedeiro (Warner, 1994). 
 14 
O terceiro mecanismo envolve a ação de compostos antioxidantes de origem exógena, 
como o ácido ascórbico (vitamina C), a glutationa e o �-tocoferol (vitamina E), que 
podem interagir diretamente com os radicais livres neutralizando-os (Warner, 1994). 
Convém ressaltar que os antioxidantes de origem exógena, assumem especial 
importância nos cultivos de camarões, uma vez que podem ser adicionados às dietas em 
doses apropriadas. 
A produção de ROIs in vitro por hemócitos imunoestimulados por componentes 
microbianos já foi relatada no caranguejo Carcinus maenas (Bell e Smith, 1993) e em 
várias espécies de peneídeos, como em P. monodon (Song e Hsieh, 1994; Sung et al., 
1996), L. vannamei (Muñoz et al., 2000), Macrobrachium rosenbergii (Sierra et al., 
2005), e em espécies nativas brasileiras, F. paulensis e Litopenaeus schmitti (Guertler, 
2007). 
A quantificação in vitro da produção de ânion superóxido pelos fagócitos é 
usualmente realizada através do método de redução do NBT (do inglês, nitro-blue-
tetrazolium) ou pela técnica da quimioluminescência. Esta avaliação permite determinar 
o grau de estresse oxidativo dos animais, em conseqüência a diferentes fatores de 
estresse como infecções, destacando-se como um valioso imunoparâmetro na 
determinação do estado imunológico dos camarões (Song e Hsieh, 1994; Muñoz et al., 
2000; Campa-Córdova et al., 2002a; b; Chang et al., 2003; Guertler, 2007). 
A produção de ânion superóxido vem sendo muito utilizada em camarões, para 
avaliar o efeito de substâncias consideradas imunoestimulantes, como as �-glicanas de 
fungos e os polissacarídeos sulfatados de algas, que podem ser adicionados à dieta ou 
via banhos de imersão (Campa-Córdova et al., 2002a;b; Chang et al., 2003), e que será 
discutida posteriornente. 
Por outro lado, a produção de RNIs tem origem na enzima óxido nítrico sintase 
(do inglês, NOS) presente no citoplasma de vários tecidos animais, incluindo as células 
do sistema imunológico. Nestas últimas, a NOS é induzida por situações de estresse 
(iNOS) e produz NO e em seguida o peroxinitrito (ONOO-), ambos compostos 
altamente tóxicos (Fig. 4). Nos outros tecidos, a NOS é expressa de forma constitutiva. 
Em vertebrados, estão bem documentadas as atividades antiviral, antibacteriana e 
antiparasitária das RNIs, que assim como as ROIs causam danos ao DNA, a várias 
enzimas e às membranas dos patógenos, direta ou indiretamente (vide revisão Kröncke 
et al., 1997; Chakravortty e Hensel, 2003). Infelizmente, existem ainda pouquíssimos 
relatos sobre a participação do NO e seus derivados nas respostas de defesa de 
 15 
crustáceos. Dentre estes, destacam-se os trabalhos de Jiang et al. (2006) que mostraram 
uma atividade da NOS nos hemócitos dos camarões F. chinensis e M. japonicus e de 
Yeh et al. (2006) no lagostim Procambarus clarkii. A atividade da NOS nestes animais 
é particularmente estimulada por LPS bacterianos, sugerindo que nos crustáceos, as 
RNIs devam atuar como agentes microbicidas. 
Cabe ainda ressaltar que a utilização da produção de RNIs como imunoparâmetro 
para avaliar o estado imunológico de camarões de cultivo é ainda uma ferramenta muito 
pouco utilizada, apesar de seu potencial promissor. Espera-se num futuro próximo, que 
haja um maior progresso nas técnicas de detecção de RNIs em camarões, para permitir 
sua utilização como imunoparâmetro e/ou como indicador de imunoestimulação. 
 
 
1.3.2 Proteínas e peptídeos antimicrobianos (AMPs) 
 
Proteínas e/ou peptídeos antimicrobianos (do inglês, antimicrobial 
proteins/peptides ou AMPs) são componentes essenciais do sistema imune inato, 
podendo apresentar uma atividade microbicida rápida e potente contra um amplo 
espectro de microrganismos. Nos crustáceos, que são desprovidos do sistema imune 
adaptativo dos vertebrados, a presença de AMPs na hemolinfa reveste-se da maior 
importância para o controle e prevenção de infecções por microrganismos. Essas 
moléculas estão amplamente distribuídas entre os diferentes reinos de seres vivos, tendo 
sido encontradas desde bactérias até mamíferos, incluindo protozoários, invertebrados e 
plantas. 
Os AMPs foram inicialmente identificados por Steiner et al. (1981) na hemolinfa 
da mariposa Hyalophora cecropia e desde então, mais de mil diferentes peptídeos têm 
sido isolados e caracterizados (Bulet et al., 2004). São moléculas relativamente 
pequenas, contendo menos de 150-200 resíduos de aminoácidos. A grande maioria dos 
AMPs destaca-se por suas características anfipáticas, apresentando uma região 
altamente catiônica e uma região hidrofóbica, o que facilita a sua interação e inserção 
nos fosfolipídios aniônicos presentes na face externa das membranas de muitos 
microrganismos (Bulet et al., 2004). 
De acordo com a sua composição aminoacídica e estrutura tridimensional, os 
AMPs foram classificados em quatro grandes classes: (1) peptídeos �-hélice linear 
anfipáticos, (2) peptídeos cíclicos ou cíclicos com extremidades abertas com uma ou 
 16 
mais pontes de cisteína, (3) peptídeos ricos em um tipo particular de aminoácido e (4) 
peptídeos gerados a partir da hidrólise de uma proteína precursora (vide revisão de 
Bulet et al., 2004). O local de síntese dessas moléculas é variável entre os diferentes 
organismos. Em muitas espécies de insetos, os AMPs são sintetizados nos corpos 
gordurosos no momento de uma infecção e secretados para a hemolinfa onde atuam de 
forma sistêmica (Hoffmann et al., 1996). Em contrapartida, em outros invertebrados 
como limulídeos, aranhas, moluscos e camarões, os AMPs são sintetizados 
constitutivamente nos hemócitos e armazenados em seus grânulos (vide revisão de 
Bachère et al., 2004). 
Os diferentes AMPs, caracterizados até o momento, possuem uma atividade 
inibitória rápida e potente contra um amplo espectro de microrganismos, incluindo 
bactérias, fungos filamentosos, leveduras e, em alguns casos também contra vírus e 
protozoários (Bachère et al., 2004; Reddy et al., 2004). 
O mecanismo de ação dos AMPs manifesta-se geralmente a nível da membrana do 
microrganismo,provocando sua desestabilização. Apresentam geralmente uma 
atividade detergente, através da interação eletrostática com os fosfolipídeos aniônicos 
da membrana, o que leva a um desequilíbrio de suas funções. Podem ainda inserir-se na 
bicamada lipídica, formando grandes poros, o que leva ao influxo descontrolado de 
solutos e extravasamento dos conteúdos citoplasmáticos, resultando na morte do 
microrganismo. Outras classes de AMPs podem ainda ser interiorizadas e interferir com 
diferentes vias metabólicas essenciais ao ciclo de vida do microrganismo (Bulet et al., 
2004; Toke, 2005). É importante assinalar que a indução de mecanismos de resistência 
contra essas moléculas pelos microrganismos é muito rara, uma vez que os 
componentes afetados (membranas) são essenciais para a sobrevivência desses 
microrganismos e que mutações nessas estruturas, a fim de escapar dos efeitos danosos 
dos AMPs são praticamente inviáveis. 
Somente em meados da década de 90 foram identificados os primeiros peptídeos 
com atividade microbicida em crustáceos. O primeiro AMP isolado e parcialmente 
caracterizado de um crustáceo foi um peptídeo catiônico de 6,5 kDa no caranguejo C. 
maenas. Este peptídeo, rico em resíduos de prolina, mostrou um amplo espectro de 
atividade, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Schnapp et al., 1996). 
Estes mesmos autores identificaram ainda outro AMP de 11,5 kDa com atividade 
restrita a bactérias Gram-positivas marinhas, que mais tarde foi caracterizado como uma 
 17 
molécula hidrofóbica rica em resíduos de cisteína e denominado de crustina/carcinina 
(Relf et al., 1999; Bartlett et al., 2002; Brockton et al., 2007). 
Em camarões peneídeos, três famílias de AMPs foram descritas e caracterizadas a 
partir de seus hemócitos: penedinas (Destoumieux et al., 1997), crustinas (Gross et al., 
2001; Bartlett et al., 2002) e os fatores anti-lipopolissacarídeos (ALFs) (Gross et al., 
2001; Supungul et al., 2002) (Tab. 1). 
 
Tabela 1: Famílias de peptídeos antimicrobianos (AMPs) constitutivamente expressos nos 
hemócitos de camarões peneídeos. 
 
 
AMP 
 
Atividade Antimicrobiana 
 
Estrutura 
 
Referências 
 
 
 
 
ALF 
 
 
 
bactérias Gram+ e Gram- 
fungos filamentosos 
 
 
 
Gross et al., 2001 
Supungul et al., 2002 
Supungul et al., 2004 
Somboonwiwat et al., 2005 
 
 
Crustina 
 
 
bactérias Gram+ e Gram- 
 
 
 
nd 
 
Gross et al., 2001 
Bartlett et al., 2002 
Zhang et al., 2007 
Amparyup et al., 2007a 
 
 
 
 
Peneidina 
 
 
 
bactérias Gram+ 
fungos filamentosos 
 
 
 
 
 
 
Destoumieux et al., 1997 
Destoumieux et al., 1999 
Gueguen et al., 2006 
nd = não determinada. 
 
 
As peneidinas são peptídeos antimicrobianos de 5 a 8 kDa, inicialmente isolados e 
caracterizados a partir da hemolinfa do camarão L. vannamei. São moléculas altamente 
catiônicas, compostas por uma região N-terminal rica em resíduos de prolina e uma 
região C-terminal contendo seis resíduos de cisteína ligados por três pontes dissulfídicas 
(Destoumieux et al., 1997). As peneidinas estão subdivididas em vários subgrupos 
(peneidinas 2 a 5), sendo que cada um contém várias isoformas distintas (Gueguen et 
 18 
al., 2006). Algumas isoformas possuem um motivo molecular de ligação à quitina em 
sua região C-terminal, que também é encontrado em algumas lectinas de plantas e em 
vários peptídeos antifúngicos (Destoumieux et al., 2000). Essa família de AMP é 
expressa de forma constitutiva nos hemócitos e apresenta uma atividade potente contra 
bactérias Gram-positivas e fungos filamentosos (Destoumieux et al., 1999; 2000). 
Interessantemente, a presença de peneidinas parece estar restrita apenas a camarões 
peneídeos. Vários subgrupos e isoformas de peneidinas foram identificados e 
caracterizados em diferentes espécies de peneídeos de diferentes oceanos (Gueguen et 
al., 2006) A expressão de peneidinas inicia-se nas primeiras fases do desenvolvimento 
ontogenético dos camarões (náuplios IV e V) (Muñoz et al., 2003; Jiravanichpaisal et 
al., 2007a). As peneidinas são expressas em grande quantidade, em comparação a outros 
AMPs produzidos nos hemócitos de peneídeos (cerca de 36% dos AMPs de P. monodon 
e 75% de L. vannamei e Litopenaeus setiferus), em especial as isoformas do subgrupo 3 
(PEN3) (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002). 
As crustinas são AMPs homólogos aos peptídeos de 11,5 kDa inicialmente 
isolados dos hemócitos granulares do caranguejo C. maenas (Relf et al., 1999), que 
posteriormente foram denominados carcininas (Brockton et al., 2007). As crustinas de 
camarões peneídeos incluem várias isoformas e são moléculas compostas por uma 
região N-terminal rica em resíduos de glicinas e por uma porção C-terminal contendo 
doze resíduos conservados de cisteína, onde se encontra um domínio WAP (do inglês, 
whey acidic protein), com possível função de inibição de proteases (Bartlett et al., 
2002). A atividade antimicrobiana das crustinas abrange essencialmente bactérias 
Gram-positivas (Zhang et al., 2007), contudo, uma ação contra vibrios marinhos (Gram-
negativos) foi também relatada muito recentemente para algumas isoformas (Amparyup 
et al., 2007a). 
Essa família de AMPs (crustinas/carcininas) é constitutivamente expressa em 
hemócitos e parece estar distribuída em diferentes grupos de crustáceos, como camarões 
peneídeos (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002; Rattanachai et al., 2004a; Zhang et 
al., 2007; Rosa et al., 2007a) e também em caranguejos, lagostas e lagostins (Relf et al., 
1999; Hauton et al., 2006; Christie et al., 2007; Jiravanichpaisal et al., 2007b). No 
lagostim Pacifastacus leniusculus e nos peneídeos L. setiferus e L. vannamei, as 
crustinas representam cerca de 3, 4 e 9% dos AMPs transcritos em seus hemócitos, 
respectivamente (Gross et al. 2001; Jiravanichpaisal et al., 2007b), em contraposição ao 
camarão P. monodon, onde esse AMP pode alcançar cerca de 26% dos AMPs expressos 
 19 
(Supungul et al., 2004). A expressão de crustinas, assim como a das peneidinas, inicia-
se nas fases iniciais do desenvolvimento dos camarões (náuplios IV), (Jiravanichpaisal 
et al., 2007a). 
Os fatores anti-lipopolissacarídeos (ALFs: do inglês, anti-lipopolysaccharide 
factors) são moléculas de 10 a 14 kDa, inicialmente isoladas e caracterizadas nos 
hemócitos granulares do limulídeo Limulus polyphemus (Tanaka et al., 1982). Em 
camarões peneídeos, os ALFs foram primeiramente detectados nas espécies L. setiferus 
(Gross et al., 2001) e P. monodon (Supungul et al., 2002) e mostraram conter dois 
resíduos conservados de cisteína engajados na formação de uma estrutura terciária em 
forma de grampo (�-hairpin) como nos ALFs de limulídeos. Essa estrutura concentra 
uma região altamente hidrofóbica com um domínio de ligação a LPS. Os ALFs incluem 
várias isoformas e são moléculas constitutivamente expressas nos hemócitos (cerca de 
26% dos transcritos de AMPs de P. monodon) com atividade antimicrobiana potente e 
de amplo espectro, sendo ativas contra bactérias Gram-positivas e negativas e fungos 
filamentosos e tendo ainda a propriedade de se ligar e neutralizar LPS (Somboonwiwat 
et al., 2005; Nagoshi et al., 2006). Ainda não é conhecido quando se dá o início da 
produção de ALFs durante o desenvolvimento ontogenético de camarões. Seqüências 
codificadoras para esses peptídeos têm sido amplamente detectadas nos hemócitos de 
diferentes espécies de peneídeos e de outros crustáceos (Gross et al., 2001; Supungul et 
al., 2004; Liu et al., 2005; Liu et al., 2006a; Nagoshi et al., 2006; Towle e Smith, 2006; 
Imjongjirak et al., 2007). 
Além destas três principais famílias de AMPs, outros grupos de moléculas 
antimicrobianas foram recentemente caracterizadas em crustáceos, a calinectina de 
Callinectessapidus (Khoo et al., 1999), as astacidinas de P. leniusculus (Lee et al., 
2003; Jiravanichpaisal et al., 2007b), a armadilidina de Armadillidium vulgare 
(Herbinière et al., 2005) e a cigonadina de Scylla serrata (Wang et al., 2007). 
Outras importantes moléculas com potente atividade antimicrobiana são também 
encontradas nos hemócitos de crustáceos. Dentre estas, destaca-se a lisozima, enzima 
mencionada anteriormente, que representa aproximadamente 4% das proteínas totais 
dos hemócitos de camarão (Sotelo-Mundo et al., 2003). As lisozimas possuem uma 
atividade lítica potente contra um amplo espectro de bactérias Gram-positivas e 
negativas, incluindo espécies de vibrios marinhos, devido à clivagem das 
peptidoglicanas das paredes bacterianas (Hikima et al., 2003; de-la-Re-Vega et al., 
2006). 
 20 
Em adição às famílias de AMPs constitutivamente produzidas nos hemócitos, 
outros grupos de moléculas antimicrobianas, como os peptídeos originados a partir da 
hidrólise de proteínas precursoras, foram também encontradas em camarões. Entre 
estas, destaca-se o peptídeo derivado da porção C-terminal da proteína plasmática 
hemocianina. Este fragmento, de características aniônicas, apresenta atividade restrita a 
fungos filamentosos e pode ainda funcionar como molécula imunosinalizadora 
(Destoumieux-Garzón et al., 2001). Peptídeos antifúngicos originados a partir da 
hidrólise da hemocianina foram também relatados no lagostim P. leniusculus (Lee et al., 
2003). Ainda em camarões peneídeos, foi demonstrado que peptídeos gerados a partir 
da clivagem de proteínas histônicas apresentavam atividade antimicrobiana contra 
bactérias Gram-positivas (Patat et al., 2004). 
Durante infecções causadas por diferentes tipos de patógenos, ocorre a modulação 
da expressão de diferentes famílias de AMPs, assim como de outras moléculas 
microbicidas importantes como a lisozima (Supungul et al., 2004; de Lorgeril et al., 
2005; Somboonwiwat et al., 2006). Em camarões desafiados com LPS ou com bactérias 
Gram-negativas do gênero Vibrio ocorre uma diminuição significativa dos níveis de 
expressão de peneidinas e crustinas nas primeiras horas após a injeção (3 e 6 h). Esse 
decréscimo é seguido pelo retorno aos níveis basais dessas moléculas após 12 h e por 
um aumento significativo nos níveis de expressão após 72 h da injeção, sugerindo 
interessantemente uma indução tardia destas moléculas durante as infecções 
(Destoumieux et al., 2000; Bachère et al., 2004; Okumura, 2007). Foi ainda mostrado, 
que nas primeiras horas da infecção, quando o nível de expressão de peneidinas diminui 
drasticamente, ocorre simultaneamente um aumento nas suas concentrações plasmáticas 
(Destoumieux et al., 2000). Acredita-se que esse aumento seja proveniente da liberação 
deste AMP pelos hemócitos que se encontram próximos aos sítios de infecção (Bachère 
et al., 2004). 
Por outro lado, a expressão de ALFs parece mostrar uma cinética contrária às 
outras duas famílias de AMPs de camarões. Em P. monodon, os níveis de expressão de 
ALFs aumentam significativamente nas primeiras horas após desafio com bactérias 
Gram-negativas (3 e 6 h) e retornam aos seus níveis basais cerca de 48 h após o início 
do processo inflamatório (Supungul et al., 2004; Somboonwiwat et al., 2006). 
A presença de diferentes famílias de AMPs em crustáceos, aliada à ocorrência de 
inúmeras isoformas dentro de um mesmo subgrupo, provavelmente com atividades 
antimicrobianas distintas, sugere uma atuação sinérgica destas diferentes moléculas 
 21 
imunoefetoras, que podem assim eliminar um amplo espectro de agentes patogênicos 
simultaneamente. A modulação da expressão das diferentes famílias de AMPs de 
camarões durante uma infecção assinala a grande importância dessas moléculas no 
combate a agentes patogênicos. Dessa forma, a quantificação da expressão dos genes 
codificantes para esses peptídeos pode ser uma importe ferramenta para avaliar as 
condições de saúde dos animais em cultivo e ainda um interessante parâmetro para a 
seleção de reprodutores que estejam conseqüentemente mais protegidos contra 
infecções. Esses compostos podem, ainda, representar uma nova geração de agentes 
terapêuticos, podendo encontrar aplicações não apenas em aqüicultura, como também 
em saúde humana e veterinária, no sentido de constituir uma alternativa biotecnológica 
para o problema do crescente número de linhagens de microrganismos resistentes aos 
antibióticos atualmente utilizados. 
 
 
1.4 Proteínas de Reconhecimento de Padrão (PRPs) 
 
O mecanismo de reconhecimento do não-próprio é certamente um dos 
mecanismos centrais no desencadeamento de uma resposta imunológica. Como dito 
anteriormente, os invertebrados, incluindo crustáceos, não produzem moléculas de 
reconhecimento altamente específicas como os anticorpos, nem contêm as células 
antígeno-específicas como os linfócitos dos vertebrados. No entanto, eles possuem 
moléculas capazes de diferenciar eficientemente o próprio do não-próprio e, assim, 
desencadear mecanismos que resultem na neutralização e/ou destruição dos 
microrganismos e parasitas invasores. 
As respostas de defesa nos crustáceos são desencadeadas a partir do contato com o 
patógeno, através de seus componentes, ou ainda com antígenos ambientais. Essas 
reações são iniciadas pelo reconhecimento do agente invasor por proteínas de 
reconhecimento-padrão, presentes no hospedeiro. O termo “proteínas de 
reconhecimento padrão” (do inglês, pattern-recognition proteins) ou PRPs faz alusão ao 
fato de que o sistema imunológico reconhece primariamente padrões moleculares 
presentes especificamente nos microrganismos ou PAMPs (do inglês, pathogen-
associated molecular patterns) (Medzhitov e Janeway, 1997; Janeway e Medzhitov, 
2002). As PRPs são moléculas produzidas pelo hospedeiro, secretadas para o plasma ou 
 22 
localizadas na superfície das células, principalmente as do sistema imune, que 
reconhecem e se ligam aos PAMPs. 
Em invertebrados, os principais PAMPs reconhecidos por PRPs são os 
lipopolissacarídeos (LPS) da superfície das bactérias Gram-negativas e as 
peptidoglicanas (PGs) da parede das Gram-positivas, as �-1,3-glicanas da parede de 
fungos e o dsRNA (do inglês, double-stranded RNA) produzido durante a replicação de 
vários vírus (Lee e Söderhäll, 2002). Estes PAMPs, característicos de microrganismos e 
ausentes no hospedeiro, são essenciais para a sobrevivência dos microrganismos, o que 
significa que estes “alvos” da imunidade inata não podem ser evolutivamente 
descartados pelos micróbios para se evadirem do reconhecimento pelo hospedeiro. 
Uma vez dentro do hospedeiro, os padrões moleculares do patógeno são 
reconhecidos e ligados às suas respectivas PRPs e, no caso dos crustáceos, iniciam a 
ativação principalmente dos hemócitos, desencadeando uma resposta imune-celular ou à 
produção/liberação de uma série de moléculas imunoefetoras/imunoreguladoras por 
degranulação ou ainda modular a expressão de genes imunológicos específicos (Fig. 5). 
Várias PRPs foram identificadas e caracterizadas na hemolinfa dos crustáceos, tais 
como a proteína que se liga a LPS ou LBP (do inglês, LPS-binding protein), as 
proteínas que se ligam a �-1,3-glicanas ou �GBP e GBP (do inglês, �-glucan binding 
proteins), a proteína que se liga a ambos LPS e �-1,3-glicanas ou LGBP, a proteína 
mas-like (do inglês, masquerade-like protein) que reconhecem vários microrganismos, 
além de várias classes de lectinas (vide revisão de Lee e Söderhäll, 2002). As diferentes 
PRPs identificadas em crustáceos até o momento estão apresentadas na Tabela 2. 
 
1.4.1 Proteínas que se ligam às �-1,3-glicanas: �GBP e GBP 
 
Proteínas que reconhecem exclusivamente �-glicanas têm a capacidade de se ligar 
a componentes da parede celular de fungos e foram caracterizadas em muitas espécies 
animais, sendo genericamente denominadasde �GBP e GBP. 
Nos crustáceos, existem pelo menos duas diferentes classes de proteínas que 
reconhecem e se ligam às �-glicanas. A primeira é representada por uma lipoproteína de 
alta densidade, a �GBP (Hall et al., 1995; Yépiz-Plascencia et al., 1998), sintetizada no 
hepatopâncreas (Cerenius et al., 1994; Romo-Figueroa et al., 2004) e constitutivamente 
presente na hemolinfa destes animais. A segunda classe é composta por pequenas 
proteínas, a GBP (Sritunyalucksana et al., 2002) e a LGBP (Lee et al., 2000; Roux et al., 
 23 
2002; Cheng et al. 2005; Du et al., 2007), sintetizadas pelos hemócitos e/ou 
hepatopâncreas dos crustáceos. 
 
 
Figura 5: Respostas imunológicas induzidas nos hemócitos após reconhecimento de patógenos, 
via PRPs plasmáticas ou celulares, e subseqüente ativação: (1) degranulação, com liberação de 
diferentes imunoefetores e imunoreguladores; (2) indução e/ou repressão de genes 
imunológicos; (3) ativação de respostas celulares como fagocitose e formação de nódulos e 
cápsulas. 
 
 
A �GBP já foi isolada e caracterizada em vários crustáceos, como nos lagostins P. 
leniusculus (Duvic e Soderhäll, 1990; Cerenius et al., 1994), Astacus astacus e P. clarkii 
(Duvic e Soderhäll, 1993), no caranguejo C. maenas (Thörrnqvist et al., 1994), e nos 
camarões Farfantepenaeus californiensis (Vargas-Albores et al., 1996) e L. vannamei 
(Yépiz-Plascencia et al., 1998; Jiménez-Vega et al., 2002; Romo-Figueroa et al., 2004). 
Bioquimicamente, as �GBPs são glicolipoproteínas monoméricas (95 a 112 kDa), 
contendo na sua estrutura oligossacarídeos ricos em manose e uma alta porcentagem de 
lipídeos (aproximadamente 50%), sendo os fosfolipídeos a classe lipídica predominante 
(Ruiz-Verdugo et al., 1997). Estas proteínas apresentam domínios semelhantes às 
glucanases bacterianas, porém sem atividade catalítica, além de conterem um motivo de 
adesão celular RGD (arginina-glicina-asparagina) que, provavelmente, se ligue aos 
 24 
hemócitos através de uma proteína transmembrana semelhante à integrina (vide revisão 
de Sritunyalucksana e Söderhäll, 2000). 
 
Tabela 2: Identificação e caracterização das principais proteínas de reconhecimento padrão em 
crustáceos até o momento. 
 
 
PRPs (PAMPs) 
 
 
Ano 
 
Status 
 
Tamanho Referências 
 
BGBP (�-glicanas) 
 
P. leniusculus 
A. .astacus 
P. clarkii 
C. maenas 
F. californiensis 
L. stylirostris 
L. vannamei 
L. vannamei 
F. californiensis 
L. vannamei 
P. leniusculus 
L. vannamei 
 
GBP (�-glicanas) 
 
P. monodon 
 
LGBP (LPS e �-glicanas) 
 
P. leniusculus 
L. stylirostris 
L. vannamei 
F. chinensis 
 
Lectinas (Açúcares) 
 
Várias espécies 
 
LBP (LPS) 
F. californiensis 
P. leniusculus 
L. schmitti 
P. monodon 
 
Mas-like (LPS e �-glicanas) 
 
P. leniusculus 
P. leniusculus 
P. monodom 
 
 
 
 
1990 
1993 
1993 
1994 
1996 
1997 
1997 
1998 
1998 
2002 
1994 
2004 
 
 
 
2002 
 
 
 
2000 
2002 
2005 
2007 
 
 
 
-- 
 
 
1993 
1993 
2002 
2006 
 
 
 
2000 
2001 
2007 
 
 
 
 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Clonada 
Clonada 
 
 
 
Purificada/clonada 
 
 
 
Purificada/clonada 
Clonada 
Clonada 
Clonada 
 
 
 
Purificadas/clonadas 
 
 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada/clonada 
 
 
 
Clonada 
Purificada 
Clonada 
 
 
 
 
100kDa 
95-105kDa 
100kDa 
110kDa 
100kDa 
100kDa 
100kDa 
112kDa 
112kDa 
100kDa 
4679pb 
6379pb 
 
 
 
31 kDa/1314pb 
 
 
 
40 kDa/1650pb 
1352pb 
1272pb 
1253pb 
 
 
 
várias 
 
 
175kDa 
65-80kDa 
31+34kDa 
18kDa/709pb 
 
 
 
3277pb 
134+129kDa 
1572pb 
 
 
 
 
Duvic e Söderhäll 
Duvic e Söderhäll 
Duvic e Söderhäll 
Thörnqvist et al. 
Vargas-Albores et al. 
Vargas-Albores et al. 
Vargas-Albores et al. 
Yépiz-Plascencia et al. 
Yépiz-Plascencia et al. 
Jiménez-Vega et al. 
Cerenius et al 
Romeo-Figueroa et al. 
 
 
 
Sritunyalucksana et al. 
 
 
 
Lee et al. 
Roux et al. 
Cheng et al. 
Du et al 
 
 
 
Marques e Barracco 
(2000) 
 
Lee et al. 
Kopacék et al. 
Cominetti et al. 
Luo et al. 
 
 
 
Huang et al 
Lee e Söderhäll 
Amparyup et al. 
 
 
 
 25 
Lubzens et al. (1997) demonstraram que a �GBP do lagostim era idêntica a uma 
lipoproteína de alta densidade (LP1), presente na hemolinfa de machos e fêmeas do 
camarão Penaeus semisulcatus, e que estava envolvida no transporte de lipídeos para o 
ovário, no caso das fêmeas. Em seguida, foi demonstrado em camarões que a �GBP e a 
HDL (do inglês, high density lipoprotein) eram de fato a mesma proteína (Yépiz-
Plascencia et al., 1998). Desta forma, considera-se atualmente, que a �GBP dos 
crustáceos tenha uma dupla função: transportando lipídeos, como uma HDL e 
participando no sistema imune, como uma PRP. 
A interação da �GBP com as �-1,3-glicanas leva à formação de um complexo que 
se liga a receptor(es) de membrana nos hemócitos (Duvic e Söderhäll, 1990; 1992). 
Após esta ligação ocorre uma ativação celular, que resulta no espraiamento e 
degranulação parcial dos hemócitos granulares (Barracco et al., 1991). A exocitose do 
material granular promove a liberação das moléculas do sistema proPO, entre outras 
moléculas, havendo uma posterior ativação deste sistema pelas próprias �-1,3-glicanas 
(Cerenius et al., 1994; Vargas-Albores et al., 1996; Perazzolo e Barracco, 1997). Foi 
ainda demonstrado que a �GBP pode atuar como uma opsonina, aumentando in vitro a 
fagocitose de leveduras pelos hemócitos de lagostim (Cerenius et al., 1994). 
O complexo �GBP-�-1,3-glicanas do lagostim P. leniusculus pode se ligar na 
superfície de hemócitos granulares através do motivo RGD, o que sugere que esta 
ligação seja mediada por uma proteína semelhante à integrina, presente na membrana do 
hemócito, como mencionado anteriormente. Efetivamente, uma proteína da família das 
�-integrinas foi isolada dos hemócitos do lagostim e é uma candidata a receptor da 
�GBP (Holmblad et al., 1997). 
No entanto, um receptor de membrana para �GBP foi isolado dos hemócitos do 
lagostim por Duvic e Söderhäll (1992), sendo caracterizado como um heterodímero 
protéico (de 230 e 90 kDa). A interação com o hemócito só ocorre se a �GBP estiver 
complexada com as �-1,3-glicanas. Curiosamente, este receptor é o mesmo que se liga à 
proteína de adesão celular peroxinectina (discutida adiante) e é uma superóxido 
dismutase (SOD) contendo CuZn (Johansson et al., 1999a), não pertencendo portanto à 
família das integrinas. 
Uma outra proteína que se liga às �-glicanas, a GBP, foi recentemente clonada dos 
hemócitos do camarão P. monodon (Sritunyalucksana et al., 2002). Esta proteína (39,5 
kDa) é constitutivamente expressa nos hemócitos e se liga a �-1,3-glicanas presentes em 
 26 
curdlan e zymosan, mas não se liga aos LPS bacterianos, demonstrando sua 
especificidade no reconhecimento de fungos. 
 
 
1.4.2 Proteínas que se ligam a ambos, LPS e às �-1,3-glicanas: LGBP 
 
PRPs que se ligam a ambos LPS e �-1,3-glicanas (LGBPs) foram identificadas em 
crustáceos e insetos e apresentam um importante papel nas respostas imune inatas. As 
LGBPs dos crustáceos são proteínas pequenas (36-46 kDa) produzidas nos hemócitos 
(Lee et al., 2000; Cheng et al., 2005; Du et al., 2007) e/ou no hepatopâncreas destes 
animais (Roux et al., 2002; Cheng et al., 2005). 
A primeira LGBP isolada e caracterizada em crustáceos foi no lagostim P. 
leniusculus (Lee et al., 2000). Esta LGBP (36 kDa) está presente nos hemócitos,porém 
ausente no plasma, e apresenta a propriedade de se ligar tanto a LPS como a �-1,3-
glicanas, mas não com peptidoglicanas, mostrando sua especificidade para bactérias 
Gram-negativas e fungos. Uma vez ligada aos seus respectivos PAMPs, a LGBP, assim 
como a �GBP, leva a ativação do sistema proPO do lagostim. Em camarões peneídeos, 
existem três relatos sobre a clonagem do gene da LGBP: em Litopenaeus stylirostris 
(Roux et al., 2002), L. vannamei (Cheng et al., 2005) e F. chinensis (Du et al., 2007), 
com massas moleculares deduzidas de 40, 46 e 44 kDa, respectivamente (Tab. 2). 
Análises das seqüências aminoacídicas das LBGPs e GBPs de crustáceos 
revelaram que estas proteínas, a exemplo das �GBPs, exibem domínios semelhantes ao 
das �-glucanases bacterianas e também o domínio de adesão celular RGD, embora não 
possuam atividade enzimática (Lee et al., 2000; Roux et al., 2002; Cheng et al., 2005; 
Du et al., 2007). Acredita-se que estas proteínas tenham evoluído a partir de proteínas 
semelhantes à glucanases bacterianas e que, durante a evolução, tenham perdido a 
atividade catalítica. No entanto a propriedade de se ligar ao padrão molecular foi 
conservada, garantindo assim a sua participação no sistema imune destes animais (Lee 
et al., 2000). Interessantemente, foi demonstrado recentemente em L. vannamei que a 
região da LGBP requerida para a ligação ao LPS e a �-1,3-glicanas é justamente o sítio 
�-1,3-glucanase (Cheng et al. 2005). 
Assim como as outras PRPs acima descritas, as LGBPs participam também da 
ativação do sistema proPO do lagostim (Lee et al., 2000) e de L. stylirostris (Roux et al., 
 27 
2002). No entanto, a proteína do lagostim deve estar simultaneamente ligada aos dois 
PAMPs para que ocorra a completa ativação do sistema proPO (Lee et al., 2000). 
Análises da expressão diferencial da LGBP de L. stylirostris infectados com o 
WSSV demonstraram que ocorre uma super-expressão do gene em resposta à infecção 
viral, sugerindo que a LGBP seja uma proteína induzível de fase aguda, importante não 
somente para infecções bacterianas, mas também nas virais (Roux et al., 2002). 
Apesar de todas as proteínas, LGBP, GBP e �GBP, possuírem domínios de adesão 
celular RGD e sítios semelhantes às glucanases bacterianas (Cerenius et al., 1994; Lee 
et al., 2000; Sritunyalucksana et al., 2002; Romo-Figueroa et al., 2004), as duas 
primeiras diferem da �GBP por não serem lipoproteínas e por apresentarem um menor 
tamanho. Apesar disto, todas estas PRPs ativam o sistema proPO dos crustáceos após se 
ligarem às �-1,3-glicanas. 
 
 
1.4.3 Proteínas mas-like (do inglês, masquerade-like proteins) 
 
A mas-like é uma proteína de reconhecimento padrão multifuncional descrita em 
insetos e crustáceos. No lagostim P. leniusculus a mas-like se liga a bactérias Gram-
negativas e leveduras, e conseqüentemente aos LPS e �-1,3-glicanas como a LGBP. 
Após reconhecimento, esta PRP promove a ativação do sistema proPO, a adesão celular 
e o aumento da fagocitose (Huang et al., 2000; Lee e Söderhäll, 2001). A mas-like de P. 
leniusculus foi assim denominada devido a sua similaridade com a masquerade de 
Drosophila, expressa durante sua embriogênese, desenvolvimento larval e estágio de 
pupa (Murugasu-Qei et al., 1995). 
A mas-like existe sob forma inativa nos hemócitos do lagostim, como um 
heterodímero (134 e 129 kDa) e apresenta homologia com serino-proteases, porém sem 
atividade catalítica. A mas-like é exocitada dos hemócitos ainda sob forma inativa e 
sofre clivagem através de uma protease desconhecida ao se ligar no microrganismo, 
produzindo vários fragmentos peptídicos. Um deles promove a adesão celular no 
lagostim (Lee e Söderhäll, 2001). Contudo, a mas-like in vitro funciona como uma 
opsonina, estimulando a fagocitose pelos hemócitos do lagostim. 
Uma outra classe de mas-like, homóloga à serino-proteases, foi mais recentemente 
identificada também no lagostim P. leniusculus (Sricharoen et al., 2005) e no camarão 
P. monodon (Amparyup et al., 2007b). Estas proteínas hemocitárias têm uma massa 
 28 
molecular inferior (42 e 52 kDa, respectivamente) e apresentam homologia com os 
fatores de ativação da proPO (do inglês, FAPPs) de insetos, diferentemente da mas-like 
descrita anteriormente, que parece ser uma PRP. 
Além destas PRPs existem outras em invertebrados, destacando-se as proteínas 
que se ligam às peptidoglicanas (do inglês, PGRPs) que foram bem descritas em insetos 
(Kang et al., 1998; Ochiai e Ashida, 1999), mas que não foram ainda encontradas em 
crustáceos. Todavia, já foi demonstrado em P. monodon que as PGs podem induzir à 
ativação do sistema proPO, o que sugere a presença de uma PGRP em camarões 
(Sritunyalucksana et al., 1999a). 
 
 
1.4.4 Aglutininas e lectinas 
 
Lectinas são proteínas, sem atividade catalítica, com capacidade de ser ligar 
especificamente a carboidratos da superfície de diferentes células, incluindo 
microrganismos, causando sua aglutinação. Essa propriedade deriva do fato de estas 
moléculas serem pelos menos bivalentes, apresentando dois ou mais sítios de ligação. 
Devido a essa característica, acreditava-se inicialmente que as lectinas dos 
invertebrados fossem análogas funcionais das imunoglobulinas dos vertebrados, mas 
hoje se sabe que são estrutural e funcionalmente distintas (Marques e Barracco, 2000). 
Devido ao fato de as lectinas, tanto de vertebrados como de invertebrados, serem 
capazes de reconhecer e se ligar a açúcares específicos da superfície patógenos, estas 
moléculas são também definidas como PRPs. 
Além de atuarem como PRPs em invertebrados, as lectinas estão ainda envolvidas 
em vários processos biológicos, devido a sua interação com carboidratos, como a adesão 
celular, opsonização e formação de nódulos (vide revisão de Lee e Söderhäll, 2002), 
Algumas lectinas de invertebrados parecem estar ainda implicadas na ativação do 
sistema proPO de insetos (Yu et al., 1999) e possuir atividade antibacteriana em 
tunicados e limulídeos (Suzuki et al., 1990; Kawabata e Iwanaga, 1999). 
A maioria das lectinas envolvidas no sistema imune pertence à superfamília das 
lectinas do tipo-C, cuja atividade biológica é Ca2+-dependente e apresentam dois 
domínios para reconhecimento de carboidratos (do inglês, CRD) (Drickamer e Taylor, 
1993). 
 29 
As lectinas de crustáceos são muito menos conhecidas e investigadas do que as de 
outros artrópodes, como insetos e limulídeos. Nestes dois últimos grupos zoológicos, já 
foi descrita a ocorrência de lectinas múltiplas na hemolinfa, com especificidade para 
diferentes tipos de microrganismos. Algumas destas lectinas apresentam um amplo 
espectro de reconhecimento, ligando-se tanto a bactérias Gram-positivas como Gram-
negativas, enquanto outras são altamente específicas, reconhecendo configurações 
químicas de açúcares da superfície de um determinado microrganismo (vide revisão de 
Marques e Barracco, 2000). 
Nos crustáceos, as lectinas são proteínas constitutivas, plasmáticas, sintetizadas 
geralmente pelo hepatopâncreas (Gross et al., 2001; Luo et al., 2006) e que reconhecem 
principalmente açúcares N-acetilados, em especial derivados do ácido siálico e 
sialoglicoconjugados (vide revisão de Marques e Barracco, 2000). 
A ocorrência de lectinas múltiplas foi descrita inicialmente na hemolinfa da 
lagosta Homarus americanus, há cerca de 30 anos (Hall e Rowlands, 1974) e desde 
então, várias outras lectinas foram identificadas e isoladas em diferentes crustáceos. No 
entanto, a maioria dos trabalhos restringe-se a caracterizar uma única lectina, havendo 
muito poucos relatos de lectinas múltiplas na hemolinfa de outros crustáceos (vide 
revisão de Marques e Barracco, 2000). 
Apesar de os esforços realizados no isolamento e caracterização de lectinas em 
diferentes crustáceos, pouco progresso tem sido feito quanto a seu papel imunológico.Dentre os poucos exemplo, podemos citar as lectinas de P. monodon (monodina e 
PmLec) (Ratanapo e Chulavatnanol, 1992; Luo et al., 2006), F. californiensis (Vargas-
Albores et al., 1993), Parapenaeus longirostris (Fragkiadakis e Stratakis, 1995) e M. 
rosenbergii (Vázquez et al., 1997), todas capazes de aglutinar diferentes espécies de 
bactérias, sendo algumas capazes de aglutinar espécies patogênicas do gênero Vibrio. 
No entanto, a maioria destes estudos restringe-se a analisar a capacidade destas 
moléculas em aglutinar diferentes tipos de bactérias, mas pouco se sabe sobre sua 
atuação como opsonina ou em outros aspectos das respostas imunológicas. 
Recentemente, uma lectina do tipo-C (31.8 kDa), denominada Fclectin, foi 
identificada nos hemócitos do camarão F. chinensis, (Liu et al., 2007), diferentemente 
da maioria das lectinas que é sintetizada no hepatopâncreas. Interessantemente, a 
Fclectin é super-expressa após 3 e 12 h de inoculação com WSSV ou bactérias Gram-
negativas, respectivamente, sugerindo uma cinética de expressão diferente segundo o 
agente infeccioso (Liu et al., 2007). 
 30 
Um grupo de aglutininas que se liga a LPS bacterianos do tipo LBP foi isolada e 
caracterizada no lagostim P. leniusculus (Kopácek et al., 1993a), nos camarões F. 
californiensis (Vargas-Albores et al., 1993), L. schmitti (Cominetti et al., 2002) e P. 
monodon (Luo et al., 2006) (Tab. 2). Todas elas se ligam a LPS, sugerindo que tenham 
um importante papel no controle de infecções causadas por bactérias Gram-negativas 
como as do gênero Vibrio, que podem ser patogênicas para camarões. É importante 
salientar que as LBPs se diferenciam funcionalmente de outras PRPs, como as LGBPs 
que também reconhecem LPS, porque não apenas atuam no reconhecimento de PAMPs, 
mas também causam a aglutinação das células portadoras de LPS, o que não ocorre com 
as LGBPs. 
A LBP de P. leniusculus é uma proteína plasmática formada por várias 
subunidades (de 65 a 80 kDa) e que aglutina fortemente várias cepas bacterianas Gram-
negativas (Escherichia coli, Salmonella spp, Serratia marcescens) e eritrócitos de 
vertebrados expondo ácido siálico (Kopácek et al., 1993a). Já a LBP do camarão F. 
californiensis é uma aglutinina plasmática de maior tamanho (175 kDa), que reconhece 
e aglutina diferentes cepas de Vibrio e também eritrócitos de vários vertebrados 
(Vargas-Albores et al., 1993). Para ambas LBPs a atividade hemaglutinante é 
especificamente inibida por LPS bacterianos. 
Muito recentemente, uma LBP foi purificada e caracterizada da hemolinfa de P. 
monodon e seu gene clonado (Luo et al., 2006). Esta proteína foi identificada como 
sendo uma lectina tipo-C (PmLec, 18 kDa), apresentando uma acentuada atividade 
aglutinante contra várias bactérias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, 
Aeromonas hydrophila e Vibrio alginolyticus), além de forte capacidade opsonizante 
durante a fagocitose de E. coli. Interessante observar que, a PmLec não apresenta 
atividade antibacteriana, nem capacidade de induzir o sistema proPO (Luo et al., 2006). 
 
 
1.4.5 Receptores Toll e TLR (do inglês Toll-like receptor) 
 
As proteínas ou receptores Toll foram inicialmente identificados na mosca da fruta 
Drosophila melanogaster e revelaram ter importante função na determinação do eixo 
dorso-ventral no desenvolvimento embrionário deste inseto (Anderson e 
Nussleinvolhard, 1984). Além de seu importante papel na embriogênese, os receptores 
Toll mostraram ainda estar crucialmente implicados nas respostas imunológicas de D. 
 31 
melanogaster (Lemaitre et al., 1996). Mais tarde, proteínas semelhantes aos receptores 
Toll de D. melanogaster foram também identificadas em vertebrados e foram 
denominadas de TLRs (do inglês, Toll-like receptors). Os TLRs estão implicados no 
sistema imune inato de vertebrados e atuam de forma essencial no reconhecimento de 
PAMPs. Os receptores Toll e TLRs são glicoproteínas transmembrana caracterizadas 
por apresentar um domínio extracelular rico em resíduos de leucina ou LRR (do inglês, 
leucine-rich repeat) e por um domínio de sinalização citoplasmático homólogo ao do 
receptor de interleucina 1, denominado de TIR (do inglês, Toll/interleucin-1 receptor 
domain). 
Os TLRs de mamíferos possuem regiões de ligação a PAMPs em seu domínio 
LRR, e após ativação, induzem a expressão de citocinas inflamatórias importantes como 
os interferons (vide secção 1.7.1) e outras moléculas ativadoras da resposta imune 
adaptativa (Akira et al., 2006). Em mamíferos, já foram identificados doze TLRs 
distintos, todos implicados no reconhecimento direto de PAMPs, como LPS (TLR4), 
lipoproteínas (TLR2), dsRNA (TLR3), flagelina (TLR5), DNA CpG (TLR9) e vários 
componentes virais (TLR7) (vide revisão de Akira et al., 2006). 
Em D. melanogaster, diferentes receptores Toll foram também identificados, 
como o dToll, o d18W e os dToll3 a dToll9. Entretanto, apenas dToll e dToll5 parecem 
estar relacionados com a ativação de respostas imunológicas (Tauszig et al., 2000). 
Diferentemente dos TLRs de mamíferos, os dToll e dToll5 não possuem regiões de 
ligação a PAMPs no domínio LRR como nos mamíferos, indicando que estas proteínas 
de D. melanogaster não funcionam diretamente como proteínas de reconhecimento 
padrão ou PRPs. No entanto, estes Tolls de D. melanogaster são ativados indiretamente, 
por proteínas PRPs, no caso as PGRPs circulantes na hemolinfa, que reconhecem PGs 
de bactérias Gram-positivas e componentes da superfície de fungos. Após reconhecerem 
seus PAMPs, as PGRPs da hemolinfa iniciam uma cascata proteolítica que culmina com 
a clivagem de uma proteína circulante denominada Spätzle. Uma vez clivada, a Spätzle 
liga-se diretamente ao receptor Toll, que inicia uma cascata de transdução de sinal, que 
culmina com a transcrição do peptídeo antimicrobiano drosomicina (Lemaitre et al., 
1996). Além de atuar nas respostas contra bactérias Gram-positivas e fungos, a via Toll 
parece ainda ser requerida para inibir a replicação e propagação do vírus DXV 
(Drosophila X Virus) (Zambon et al., 2005). 
No que diz respeito a camarões, apenas muito recentemente foram identificados 
receptores tipo Toll nas células dos peneídeos L. vannamei (lToll) (Yang et al., 2007) e 
 32 
P. monodon (PmToll) (Arts et al., 2007). Esses receptores presentes em peneídeos 
apresentam uma alta homologia com os Tolls de D. melanogaster (dToll e dToll5), do 
mosquito Anopheles gambiae (AeToll), da abelha Apis mellifera (AmToll) e do 
limulídeo Tachypleus tridentatus (tToll). Assim como as demais seqüências de Toll e 
TLRs, os Toll de camarões também possuem domínios LRR e TIR conservados. 
Contudo, os Tolls de camarões, identificados até o momento, não possuem regiões de 
ligação a PAMPs no domínio LRR, como os TLRs de vertebrados, assemelhando-se 
mais uma vez aos Toll conhecidos em outros artrópodes. 
As proteínas Toll de camarões parecem ser expressas constitutivamente em 
diferentes tecidos e sua expressão parece não ser afetada durante as infecções virais 
(Arts et al., 2007). A similaridade desses receptores de camarões com os Toll de insetos, 
que induzem a transcrição do AMP drosomicina (dToll e AeToll), leva a suposição que 
essas proteínas possam estar também implicadas na imunidade inata de camarões 
peneídeos, inclusive em suas respostas antivirais como em Drosophila. Contudo, nada 
ainda se conhece sobre a atividade funcional dos recém identificados Tolls de 
crustáceos. Num futuro próximo, espera-se melhor compreender seu envolvimento no 
sistema imune inato de camarões e seu potencial como imunomarcador por ocasião de 
infecções. 
 
 
1.5 Cascata Proteolítica: Sistema de Ativação da Pró-fenoloxidase (proPO) 
 
Como dito anteriormente, a formação de nódulos e cápsulas hemocíticas em 
crustáceos é freqüentemente acompanhada por uma reação de melanização na regiãomais central. A melanização é também observada durante a cicatrização de ferimentos, 
onde a coagulação da hemolinfa e a migração dos hemócitos ao local da injúria 
permitem a formação de um tampão celular até que uma nova cutícula seja reconstituída 
(Fig. 6). 
A biossíntese de melanina nos artrópodes é um processo complexo envolvendo 
uma série de reações químicas em cascata, denominadas de sistema de ativação da pró-
fenoloxidase ou sistema proPO. Este sistema é composto por vários zimógenos de 
proteases, pela pró-fenoloxidase, além de PRPs associadas (Lee e Söderhäll, 2002) (Fig. 
6). O sistema proPO é reconhecido como uma das principais respostas imunoefetoras de 
crustáceos, desencadeada por componentes da superfície de microrganismos, como os 
 33 
LPS de bactérias Gram-negativas e �-1,3-glicanas de fungos (vide revisão Cerenius e 
Söderhäll, 2004). 
 
 
Figura 6: Liberação de diferentes efetores imunológicos e moléculas imunoreguladoras, após 
ativação dos hemócitos por patógenos. Ainda não está confirmado se a TGase é liberada por 
hemócitos granulares ou hialinos. 
 
 
Durante as infecções, estes compostos se ligam a receptores dos hemócitos 
granulares diretamente ou através de PRPs plasmáticas e induzem uma degranulação ou 
exocitose regulada, com liberação de várias moléculas imunoefetoras, entre as quais as 
moléculas do sistema proPO. Uma vez liberadas, ocorre a ativação deste sistema pelos 
próprios componentes dos microrganismos presentes na hemocele . 
A presença do sistema proPO e de algumas moléculas associadas nos grânulos dos 
hemócitos granulares (HGPs e HGGs) foi especialmente estudada no lagostim P. 
leniusculus (vide revisão de Cerenius e Söderhäll, 2004) e também em vários camarões, 
como por exemplo em P. monodon (Kondo et al., 1992), F. californiensis (Hernández-
López et al., 1996), L. stylirostris (Le Moullac et al., 1997) e F. paulensis o (Perazzolo e 
Barracco, 1997). 
 34 
Análises moleculares e bioquímicas da proPO de crustáceos, revelaram que esta 
proteína (76-78 kDa) apresenta similaridade com a hemocianina, uma vez que também 
apresenta sítios de ligação para o cobre (vide revisão de Sritunyalucksana e Söderhäll, 
2000). Além disso, as proPOs de lagostim e camarão apresentam uma região tiol-éster 
(GCGWPRHM), como as proteínas C3 e C4 do sistema complemento de vertebrados e 
as �2-macroglobulinas (Aspán et al., 1995; Sritunyalucksana et al., 1999b; Lai et al., 
2005; Liu et al., 2006b). 
A ativação da forma inativa ou proPO para a enzima ativa ou PO ocorre pela ação 
de serino-proteases, denominadas enzimas ativadoras da proPO (do inglês, proPO-
activating enzymes ou PPAEs), iniciando uma cascata proteolítica cujo produto final é a 
melanina (Fig. 7). Em crustáceos, uma PPAE batizada por ppA foi purificada (Aspán e 
Söderhäll, 1991) e posteriormente clonada (Wang et al., 2001) dos hemócitos do 
lagostim P. leniusculus. A ppA é sintetizada e mantida como um zimógeno (pró-ppA) 
nos hemócitos, sendo ativada após sua exocitose, em decorrência de uma injúria ou 
infecção microbiana. Sua ativação se dá por clivagem proteolítica, por uma protease 
ainda desconhecida (vide revisão de Cerenius e Söderhäll, 2004). 
A forma PO é uma oxidoredutase que catalisa duas reações sucessivas: a primeira, 
de hidroxilação de um monofenol a �-difenol (atividade monofenoloxidásica) e, a 
segunda, de oxidação do �-difenol a �-quinona (atividade difenoloxidásica) (Fig.7). A 
produção de o-quinonas resulta na síntese de melanina através de uma cascata de 
reações químicas intermediárias, sendo a maioria espontânea, não mediada por enzimas 
(Fig.7). A produção de quinonas leva também à esclerotização da cutícula dos 
camarões, fenômeno essencial nos períodos de muda (Söderhäll e Cerenius, 1998). 
Em relação ao papel imunológico do sistema proPO, sabe-se que esta via gera 
transitoriamente moléculas altamente tóxicas, como as quinonas, hemiquinonas (Fig. 7) 
e radicais livres como as próprias ROIs, uma vez que ocorre consumo de oxigênio 
molecular e que leva a destruição dos patógenos invasores. O pigmento escuro e 
insolúvel melanina parece ter uma atividade fungistática (Cerenius e Söderhäll, 2004), 
podendo ainda funcionar como scavenger de radicais livres (Nappi e Vass, 1993; Nappi 
e Ottaviani, 2000), minimizando assim os efeitos deletérios destas moléculas altamente 
tóxicas para o organismo do hospedeiro. Contudo, deve ser salientado que a melanina, 
per se, não é a molécula imunoefetora mais importante durante a ativação do sistema 
proPO, sendo os compostos citotóxicos intermediários os mais efetivos (Nappi e Vass, 
 35 
1993). Assim sendo, a melanização representa, mais especificamente, o final de um 
potente processo imunoefetor. 
 
 
 
Figura 7: Reação de melanização em crustáceos. A: Ferimento melanizado (seta) no camarão 
Farfantepenaeus paulensis; B: Principais passos da biossíntese de melanina desencadeados pela 
enzima fenoloxidase (PO) em presença de substratos fenólicos (adaptado de Nappi e Vass, 
1993). 
 
 
Cabe ainda ressaltar que, concomitantemente à liberação dos componentes do 
sistema proPO, várias outras moléculas são também exocitadas pelos hemócitos 
imunoestimulados (Fig. 6). Uma delas é a peroxinectina (76 kDa) que é uma peroxidase, 
homóloga à mieloperoxidase humana, e que atua tanto na adesão celular, possuindo 
 36 
ainda atividade peroxidásica. Esta proteína ganha sua atividade biológica 
concomitantemente à ativação do sistema proPO no plasma e promove o 
encapsulamento de parasitas invasores de grande tamanho, após se ligar ao receptor 
SOD da membrana dos hemócitos, mencionado anteriormente (vide revisão de 
Johansson, 1999b). Por outro lado, a peroxinectina induz ainda uma forte degranulação 
dos hemócitos, levando à liberação de mais compostos imunoefetores e 
conseqüentemente a uma acentuada amplificação da resposta imunológica do 
hospedeiro. Outras moléculas são ainda exocitadas durante a ativação hemocítica, como 
a enzima transglutaminase (TGase) que induz o processo de coagulação, diferentes 
inibidores de proteases, PRPs como a mas-like, AMPs e outras moléculas 
imunoefetoras/imunorereguladoras (vide revisões de Lee e Söderhäll, 2002; Cerenius e 
Söderhäll, 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). 
A ativação do sistema proPO deve, portanto, ser estritamente regulada para evitar 
uma ativação indesejada ou generalizada no organismo do crustáceo. Para isso, os 
animais possuem inibidores de proteases no plasma e/ou hemócitos. Dentre eles, 
podemos destacar a pacifastina (Liang et al., 1997), os inibidores da família Kazal 
(Johansson et al., 1994; Jiménez-Vega e Vargas-Albores, 2005; Somprasong et al., 
2006), a serpina (Liang e Söderhäll, 1995) e a �2-macroglobulina (Hergenhahn et al., 
1988). 
O inibidor mais eficiente da ppA do lagostim é a pacifastina, uma proteína 
plasmática heterodimérica (155-kDa), formada por uma cadeia leve com nove 
subunidades (inibidoras de protease) e uma cadeia pesada contendo três transferrinas 
(Liang et al., 1997). Esta molécula deu origem a uma nova classe de inibidores de 
serino-proteases denominada “pacisfatina-like”, que foi recentemente identificada 
também regulando o sistema proPO de insetos (Simonet et al., 2002). 
Outro importante inibidor de proteases em crustáceos é a proteína plasmática �2-
macroglobulina (�2M), que é constitutivamente sintetizada pelos hemócitos destes 
animais (Gross et al., 2001; Rattanachai et al., 2004b). A α2M é um inibidor de 
proteases de amplo espectro (serino, aspartato, cisteína e metalo-proteases), que inibe 
tanto as proteases do próprio hospedeiro, como aquelas produzidas pelo patógeno 
durante o processo infeccioso (vide revisões de Armstrong e Quigley, 1999; Armstrong, 
2006). Uma característica fundamental destes inibidores é a presença na molécula de 
uma região tiol-éster,como ocorre nas proteínas C3 e C4 do sistema complemento dos 
vertebrados. 
 37 
A �2M dos crustáceos é uma glicoproteína homodimérica (380-400 kDa), tendo 
sido isolada e caracterizada na lagosta H. americanus (Spycher et al., 1987), no 
lagostim P. leniusculus (Hergenhahn, et al., 1988) e no camarão L. vannamei (Góllas-
Galvan et al., 2003). A seqüência codificante para a �2M de peneídeos foi determinada 
apenas muito recentemente em M. japonicus, P. monodon, L. vannamei, L. schmitti e F. 
paulensis (Rattanachai et al., 2004b; Lin et al. 2007a;b; Rosa et al., 2007b). 
O papel imunomodulador da �2M nos crustáceos ainda não está bem estabelecido. 
No entanto, sabe-se que a �2M inibe parcialmente serino-proteases ativadoras do 
sistema proPO do lagostim (Hergenhahn et al., 1988; Aspán et al., 1990) e proteases 
produzidas pelo fungo Aphanomyces spp, um patógeno conhecido para lagostins 
(Dieguez-Uribeondo e Cerenius, 1998). 
Análises da expressão gênica da �2M de crustáceos através da técnica de PCR em 
tempo real revelaram que sua expressão é aumentada nas primeiras 48 h de infecção 
com vírus (Tonganunt et al., 2005) ou após tratamento dos animais com LPS 
(Vaseeharan et al., 2007) ou PGs bacterianos (Lin et al., 2007a;b). Estes achados são 
relevantes, pois sugerem que a �2M participe das respostas imunológicas, sendo talvez 
capaz de inibir proteases de patógenos e/ou regular a ativação do sistema proPO com 
suas moléculas tóxicas, minimizando assim a agressão do patógeno e/ou os danos 
causados aos tecidos do hospedeiro. 
 
 
1.6 Sistema de Coagulação 
 
A coagulação da hemolinfa é um mecanismo imunológico essencial para a 
sobrevivência de animais invertebrados com um sistema circulatório aberto ou semi-
aberto, como os crustáceos. Ela previne tanto a perda da hemolinfa, quanto a 
disseminação dos patógenos pela cavidade corpórea do animal. 
Dois diferentes mecanismos de coagulação são reconhecidos em invertebrados, 
(vide revisões de Theopold et al., 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). O primeiro é uma 
cascata proteolítica ativada por componentes microbianos, como LPS e �-1,3-glicanas, 
ocorrendo no limulídeo T. tridentatus (Kawabata et al., 1996) e o segundo é uma reação 
de coagulação dependente de transglutaminase (TGase), ocorrendo em insetos e 
crustáceos. 
 38 
No caso da coagulação dos crustáceos, um componente-chave no processo de 
gelificação do plasma é a proteína de coagulação (CP), que forma coágulos estáveis por 
meio de uma reação de ligação cruzada entre suas moléculas, mediada pela TGase (Fig. 
6). (Martin et al., 1991; Muta e Iwanaga, 1996). TGases são enzimas Ca2+-dependentes, 
usualmente compartimentalizadas dentro dos hemócitos dos crustáceos (Lorand et al., 
1979; Greenberg et al., 1991), capazes de formar ligações covalentes �-glutamil-�-lisina 
(Fig. 8) entre certas proteínas, como a proteína de coagulação (Lorand e Conrad, 1984). 
 
 
Figura 8: Reação de coagulação em crustáceos, mediada pela formação de ligações cruzadas 
entre resíduos de lisina e glutamina das proteínas de coagulação através da ação da TGase e 
cálcio. 
 
 
Em crustáceos, a CP foi isolada e caracterizada em várias espécies, dentre elas na 
lagosta Panulirus interruptus (Fuller e Doolittle, 1971; Doolittle e Riley, 1990), nos 
lagostins P. leniusculus (Kopácek et al., 1993b) e Ibacus ciliatus (Komatsu e Ando, 
 39 
1998), e nos camarões P. monodon e M. japonicus (Yeh et al., 1998), L. vannamei 
(Montaño-Pérez, et al., 1999) e F. paulensis (Perazzolo et al., 2005). 
As CPs dos crustáceos são lipoproteínas homodiméricas (200 kDa) (vide revisão 
de Sritunyalucksana e Söderhäll, 2000). Seqüências aminoacídicas completas da CP 
foram determinadas em P. leniusculus (Hall et al., 1999), P. monodon (Yeh et al., 1999) 
e M. japonicus (Cheng et al., 2007), sendo que o RNAm correspondente é expresso no 
hepatopâncreas do lagostim e em vários outros tecidos (Yeh et al., 2007; Cheng et al., 
2007), com exceção dos hemócitos e dos músculos dos peneídeos. Interessantemente, o 
tecido epidérmico sub-cuticular de M. japonicus demonstrou ser o principal sítio de 
síntese da CP, justamente ressaltando a importância da coagulação durante a muda do 
animal, quando ele torna-se potencialmente mais exposto às injúrias e ataques 
microbianos (Cheng et al., 2007). 
Exceto pela sua similaridade funcional, as CPs dos crustáceos não possuem 
nenhuma característica molecular em comum com o fibrinogênio dos mamíferos ou 
com o coagulogênio dos limulídeos, o que sugere que a CP dos crustáceos represente 
um tipo distinto de proteína formadora de coágulo (Hall et al., 1999). 
Curiosamente, as CPs pertencem à classe das lipoproteínas de densidade muito 
alta (VHDL) (Hall et al., 1995; Yépiz-Plascencia et al., 2002) e estão evolutivamente 
relacionadas às vitelogeninas (VTG) (Hall et al., 1999; Yeh et al., 1999). A VTG é a 
principal proteína precursora do vitelo em fêmeas ovíparas e não estão envolvidas em 
reações de coagulação. No entanto, ambas CP e VTG, contêm uma região similar ao 
domínio D do fator von Willebrand, envolvido na coagulação do sangue dos mamíferos 
(Sadler, 1991). 
 
 
1.7 Defesas Antivirais 
 
Como já mencionado anteriormente, as doenças virais constituem, no momento 
atual, a mais séria ameaça para a indústria da carcinicultura a nível mundial e o 
principal risco para a sustentabilidade da atividade. 
A primeira doença viral a afetar seriamente a indústria do camarão ocorreu nas 
Américas no início dos anos 80, causada pelo vírus da necrose hipodermal e 
hepatopancreática (do inglês, IHHNV) e resultou em mortalidades maciças. Outros 
surtos virais graves se sucederam ao IHHNV, destacando-se o vírus da cabeça amarela 
 40 
(do inglês, YHV) na Ásia, o vírus da síndrome de Taura (do inglês, TSV) nas Américas 
e mais recentemente o vírus da síndrome da mancha branca (do inglês, WSSV) que 
atingiu proporções catastróficas primeiramente na Ásia (no início dos anos 90) e em 
seguida nas Américas (no final dos nos 90) (para referências vide revisão de Flegel, 
2007). O WSSV parece ser um dos vírus mais desastrosos da história da carcinicultura, 
causando um índice altíssimo de mortalidade que se estende até o momento presente, e 
que tem levado a perdas econômicas incalculáveis (Flegel, 2007). A contribuição mais 
urgente e esperada na indústria da carcinicultura é indiscutivelmente o controle das 
infecções virais. 
Em vertebrados, as infecções virais induzem diversas respostas imunológicas, que 
em última instância visam controlar a replicação e propagação dos vírus e os danos 
celulares causados por eles. Dentre estas respostas destacam-se, (1) a destruição das 
células infectadas pelas células NKs (do inglês, natural killer) e linfócitos T citotóxicos 
(CTLs), (2) a produção de anticorpos neutralizantes para vírus, (3) a indução de 
proteínas do sistema interferon (IFN) que ativam a transcrição de diversos genes que 
protegem as células dos danos causados pelos vírus, gerando um estado antiviral e, (4) o 
silenciamento de genes virais pela via do RNA de interferência (RNAi). 
Os crustáceos possuem apenas um sistema imune inato, como já mencionado 
anteriormente, e portanto são desprovidos da linhagem celular linfocítica. Assim sendo, 
só podem contar eventualmente com os últimos dois mecanismos antivirais acima 
mencionados, uma vez que os dois primeiros são diretamente ligados aos linfócitos. A 
ocorrência destes dois últimos mecanismos em crustáceos será discutida a seguir. 
 
 
1.7.1 Sistema interferon 
 
1.7.1.1 Vertebrados 
 
Em vertebrados, os interferons (IFNs) são conhecidos principalmente pela sua 
capacidade de interferir na replicação viral e induzir um estado antiviral no hospedeiro. 
Na realidade, os IFNs são mais do que simples proteínas antivirais e exercem um amplo 
espectro deoutras funções biológicas, sendo a maioria relacionada com o sistema 
imune. No que se refere à defesa antiviral, apenas os interferons tipo I, IFN-α e IFN-β, 
são de real importância (Samuel, 2001). Em mamíferos, as infecções virais induzem à 
 41 
produção de IFN-α/β que por sua vez estimulam a expressão de uma série de genes 
implicados nas respostas antivirais. Nas infecções virais, as células do hospedeiro 
reconhecem PAMPs específicos através de receptores celulares específicos, 
principalmente as proteínas da família Toll ou TLRs, já comentados anteriormente, e 
que têm um papel crucial na imunidade inata, dando início à primeira linha de defesa 
contra patógenos (Uematsu e Akira, 2006; 2007). Os TLRs de mamíferos são 
homólogos à proteína Toll inicialmente identificada em Drosophila e que induz uma 
resposta imunológica contra fungos (Lemaitre et al., 1996). Dentre os diferentes TLRs 
de mamíferos alguns reconhecem particularmente PAMPs de vírus, sendo o TLR3 um 
dos mais importantes, por reconhecer dsRNA, produzido durante a replicação de muitos 
vírus de RNA e DNA. 
Recentemente, foi ainda descrito que as enzimas citoplasmáticas do tipo RNA-
helicases (RIG-I: do inglês, retinoic acid inducuble gene I) e Mda5 (do inglês, 
melanoma differentiation-associated gene 5) também são capazes de reconhecer dsRNA 
(Fujita et al., 2007; Andrejeva et al., 2004). 
Após a internalização dos vírus na célula, seus ácidos nucléicos são liberados pelo 
sistema endossomo/fagolisossomo e são reconhecidos pelos diferentes TLRs. Os TLRs 
ativam uma complexa cascata de sinalização intracelular, induzindo a transcrição de 
uma variedade de genes, incluindo os IFN-α/β (Uematsu e Akira, 2006; 2007). Por sua 
vez, os IFN-α/β desencadeiam a ativação de múltiplas vias intracelulares que interferem 
com muitos passos do ciclo de vida viral, limitando a amplificação e o espalhamento 
dos vírus e atenuando assim o processo infeccioso (Guidotti e Chisari, 2001). Os IFNs 
secretados participam de um loop de ativação autócrino/parácrino, através da ativação 
da via de sinalização intracelular JAK/STAT (do inglês, kinase/signal transducer and 
activator of transcription), que resulta na indução de múltiplos genes que codificam 
para diversas proteínas implicadas em respostas antivirais. Entre elas, destacam-se a 
PKR (do inglês, serine/threonin protein kinase), a OAS (do inglês, 2´-5´-oligoadenylate 
synthetase), a RNase L, a ADAR (do inglês, RNA-specific adenosine desaminase) e a 
Mx (do inglês, myxovirus-resistance protein GTPase). Estas proteínas afetam 
principalmente a multiplicação dos vírus na célula infectada, gerando um estado 
antiviral inespecífico nas células do hospedeiro (Samuel, 2001). 
 
 
 42 
1.7.1.2. Camarões 
 
Até muito recentemente, proteínas do sistema IFN eram consideradas moléculas 
presentes de cordados inferiores até mamíferos (Krause e Pestka, 2005), não estando 
presentes em invertebrados, principalmente no ramo dos protostômios que abrange os 
crustáceos. Além do mais, nos genomas completos disponíveis de vários invertebrados, 
como o do nematódio Caenorhabditis elegans (TCSC, 1998), da mosca de fruta D. 
melanogaster (Adams et al., 2000), do mosquito da malária A. gambiae (Holt et al., 
2002) e da abelha A. mellifera (THGSC, 2006), não foram encontradas seqüências 
gênicas com homologia para IFNs. Contudo, muito recentemente, a expressão de uma 
proteína com homologia para o IFN-α de mamíferos foi referida pela primeira vez em 
um invertebrado, nos hemócitos do peneídeo M. japonicus (He et al., 2005). 
Interessantemente, esta proteína deduzida, denominada IntlP (do inglês, interferon-like 
protein; GenBank AY695938) só é expressa em camarões sobreviventes à infecção pelo 
WSSV e não em camarões sadios 
A detecção deste produto gênico em 2005 causou grande otimismo, uma vez que 
implicava na presença de um sistema antiviral baseado em IFN em crustáceos, como 
nos vertebrados. Os autores produziram a IntlP em sistema recombinante e mostraram 
que esta proteína possuía de fato uma atividade antiviral, uma vez que conferia proteção 
celular contra os efeitos citopáticos causado por um vírus de peixe (SGIV - Singapore 
grouper iridovirus). 
Infelizmente, os resultados obtidos por He et al. (2005) parecem não corresponder 
à realidade, uma vez que em análises moleculares recentes realizadas por nosso grupo, 
foi mostrado que a IntlP corresponde de fato a uma cadeia β da porção F0 da ATP 
sintetase mitocondrial e não a uma proteína do sistema interferon. Trata-se portanto de 
uma proteína expressa constitutivamente, independentemente ou não da presença e 
infecções virais, e que foi detectada em vários peneídeos (Barracco e Rosa, in press). 
Cabe contudo salientar, que apesar da aparente ausência de moléculas homólogas 
aos IFNs de mamíferos em peneídeos, a indução de um estado antiviral inespecífico foi 
inequivocamente mostrado no camarão L. vannamei, um pouco antes (Robalino et al., 
2004) do relato da IntlP por He et al. (2005). Robalino et al. (2004) mostraram que a 
injeção de dsRNA, de seqüência inespecífica, em camarões, causava um aumento 
significativo da sua resistência a infecção por dois vírus não relacionados, o TSV e o 
WSSV. Estes resultados mostraram, pela primeira vez, em crustáceos, a indução de um 
 43 
estado antiviral inespecífico, independente da seqüência de dsRNA injetada e portanto 
muito semelhante ao estado antiviral produzido pelos IFNs de mamíferos. Além do 
mais, pouco depois, Westenberg et al. (2005) mostraram também que pequenos RNAs 
dupla fita de interferência (siRNA: do inglês, small interference RNA) eram capazes de 
induzir uma proteção antiviral. Estes resultados, aliados ainda à existência de receptores 
Toll nos hemócitos de camarões L. vannamei (Yang et al., 2007) e P. monodon (Arts et 
al., 2007) levaram à suposição natural da existência de citocinas semelhantes a IFNs em 
camarões. Em contraposição a esta idéia, está o fato da ausência de seqüências gênicas 
com homologia para IFNs nos genomas completos de insetos, filogeneticamente 
relacionados aos crustáceos.Frente a estes resultados, é razoável supor que citocinas 
análogas, e não homólogas, aos IFNs de vertebrados devam existir em camarões e 
seriam as responsáveis pela produção do estado antiviral inespecífico relatado pelos 
autores acima. 
A identificação destas citocinas, ainda não descritas em crustáceos levará 
certamente a uma maior compreensão dos mecanismos antivirais de camarões, e poderá 
abrir novas perspectivas para a estimulação de um estado antiviral geral em camarões de 
cultivo, visando um maior controle dos surtos de infecção viral. 
 
1.7.2 Sistema RNA de interferência (RNAi) 
 
Além de induzir o sistema IFN em vertebrados, o padrão molecular dsRNA viral é 
também capaz de desencadear múltiplas outras vias intracelulares que também levam a 
outras respostas antivirais. Dentre elas, destaca-se o mecanismo de silenciamento pós-
transcricional de genes, conhecido por RNA de interferência ou RNAi (Hannon et al, 
2002, Robalino et al., 2007a). Neste processo o dsRNA desencadeia a destruição de 
RNAm homólogos à sua seqüência. O RNAi representa um mecanismo de defesa 
natural contra vírus e transposons, presente nos mais diferentes seres vivos desde 
plantas até mamíferos (Hannon, 2002). 
Em animais, este mecanismo foi primeiramente descrito no nematódeo C. elegans 
(Fire et al., 1998). De forma resumida, a ativação deste sistema inicia-se pelo 
processamento de precursores longos de dsRNA em RNAs pequenos de 21-25 pb 
(siRNAs e miRNAs) pela enzima Dicer semelhante à RNase III (Hamilton e 
Baulcombe, 1999). Estes pequenos RNAs fornecem as seqüências específicas para um 
complexo de silenciamento multiprotéico induzido pelo RNA (RISC), que dirige uma 
 44 
degradação específica ou a repressão da tradução de RNAmcom regiões 
complementares à seqüência do dsRNA desencadeante (vide revisão de Robalino et al., 
2007a). 
Diferentemente, do sistema IFN que é induzido inespecificamente por qualquer 
seqüência de dsRNA (padrão molecular), a proteção antiviral baseada na via RNAi é 
seqüência-específica. Interessantemente, os ensaios realizados em C. elegans mostraram 
que o silenciamento pós-transcricional via RNAi pode ser induzido experimentalmente 
não apenas pela injeção de dsRNA, mas também por sua ministração via oral, ou ainda 
por expressão transgênica (Grishok, 2005). De acordo com Robalino et al. (2007a), a 
capacidade da célula em detectar e interiorizar dsRNA, como demonstrado em C. 
elegans, se estende também a outros invertebrados como em D. melanogaster (Goto et 
al., 2003) e no camarão L. vannamei. 
Em L. vannamei, Robalino et al. (2005) mostraram num trabalho elegante e 
inequívoco, a ocorrência de uma proteção antiviral praticamente completa contra 
infecções por WSSV e por TSV, mediante a injeção de seqüências específicas de 
dsRNA para ambos tipos de vírus. De forma semelhante, seqüências específicas de 
dsRNA foram também capazes de suprimir a replicação do vírus YHV em células em 
cultura de P. monodon (Tirasophon et al., 2005). 
Assim sendo, o mecanismo antiviral mediado por RNAi vem assumindo especial 
destaque nas respostas antivirais de crustáceos, uma vez que sua eficiência e 
especificidade foram claramente demonstradas em peneídeos infectados por diferentes 
vírus. Além do mais, sua indução por dsRNA via sistêmica (Robalino et al., 2005) e 
eventualmente por via oral, implica na atraente possibilidade de se desenvolver terapias 
antivirais, baseadas em dsRNA, de forma compatível à carcinicultura. 
 
 
1.7.3 Apoptose celular: mecanismo antiviral ou pró-viral? 
 
A morte celular programada ou apoptose é um processo bem conhecido, com 
implicações variadas na regulação da homeostase de um organismo, atuando tanto no 
desenvolvimento embrionário, como no controle dos tecidos em geral e também nas 
respostas imunológicas contra vírus. A apoptose é um mecanismo filogeneticamente 
antigo e bem conservado entre os diferentes grupos de seres vivos. 
 45 
A indução de apoptose inicia-se em resposta a uma variedade de estímulos, 
incluindo as infecções virais, e envolve várias alterações morfológicas celulares, como a 
condensação da cromatina, a fragmentação do núcleo, o blebbing da membrana, o 
encolhimento celular e finalmente a fragmentação da célula em pequenas vesículas 
revestidas por membrana, denominadas de corpos apoptóticos, que são em geral 
rapidamente fagocitados pelas células vizinhas (Fig. 9). As alterações bioquímicas 
subjacentes a estas alterações morfológicas incluem a ativação de enzimas nucleases e 
proteases, dentre as quais destaca-se a família das caspases. As caspases têm um papel 
crucial no processo apoptótico, pois catalisam muitos dos diferentes passos na morte 
celular. 
 
 
Figura 9: Apoptose celular. Representação da apoptose de uma célula, com formação de corpos 
apoptóticos endocitados por uma célula saudável (A). Núcleos apoptóticos (B) e não-
apoptóticos (C) de hemócitos de Litopenaeus vannamei infectados com o vírus da mionecrose 
infecciosa (IMNV), corados com bis-benzimida. 
 
 
Muitas proteínas virais perturbam a fisiologia celular e fornecem sinais celulares 
que induzem a morte celular. Contudo, deve ser salientado que apenas a indução da 
apoptose em estágio precoce da infecção viral, pode limitar a produção de partículas 
virais e reduzir ou eliminar a propagação da progênie viral para outros tecidos. Muitos 
vírus conseguem, porém, retardar o processo apoptótico, matando as células apenas no 
final do ciclo infeccioso (vide revisão de Roulston et al., 1999). 
A apoptose celular em estágio final do ciclo da replicação viral oferece muitas 
vantagens aos vírus. Durante este processo, todo o conteúdo celular, incluindo a 
progênie do vírus, é empacotado nos corpos apoptóticos. Os vírus tornam-se assim 
 46 
indetectáveis pelo sistema imune, ficando protegidos dentro dos corpos apoptóticos e 
evitando assim as respostas inflamatórias e a sua inativação por anticorpos e proteases 
do hospedeiro. Estes corpos apoptóticos, alojando inúmeros vírus replicados, são em 
seguida rapidamente fagocitados pelas células vizinhas, e ironicamente garantem a 
propagação e a infecção viral. Ou seja, a indução de uma apoptose tardia parece ser uma 
ótima estratégia de propagação para os vírus que evolutivamente não desenvolveram 
ainda defesas anti-apoptóticas ou outros mecanismos de evasão imunológica (vide 
revisão de Roulston et al., 1999). 
Em camarões, a indução de apoptose em infecções virais vem sendo ativamente 
descrita nestes últimos anos. Em P.monodon infectados pelo WSSV (Sahtout et al., 
2001; Wongprasert et al., 2003) ou pelo YHV (Khanobdee et al., 2002) ocorre um 
aumento progressivo de apoptose até níveis muito altos, comprometendo assim vários 
tecidos e parecendo ser a principal causa da morte dos camarões. Também em M. 
japonicus infectados pelo WSSV a incidência de apoptose mostrou-se muito alta, 
resultando em elevadas mortalidades dos animais (Wu e Moroga, 2004). Estes relatos 
sugerem que nas infecções virais severas de camarões, ocorra a indução de uma 
apoptose tardia, levando a uma forte propagação da progênie viral e resultando na morte 
do camarão por excesso de apoptose em seus tecidos. 
Muito recentemente, caspases foram identificadas e clonadas nos camarões 
Penaeus merguiensis (Phongdara et al., 2006) e P. monodon (Wongprasert et al., 2007) 
e em ambos animais estas proteases são induzidas durante as infecções pelo WSSV. A 
relação apoptose-infecção viral em camarões será melhor explorada abaixo, no âmbito 
do conceito de acomodação viral. 
 
 
1.7.4 Conceito de acomodação viral em camarões 
 
Uma forma alternativa de se encarar os surtos virais e o controle de infecções em 
camarões refere-se ao conceito de acomodação viral proposto por Flegel em 1998 e 
recentemente atualizado pelo mesmo autor (2007). Este atraente conceito propõe que os 
crustáceos se adaptam aos novos vírus patogênicos que surgem, desenvolvendo uma 
espécie de memória específica que impede o mecanismo de apoptose induzido pelo 
vírus. Esta proposta se baseia no fato de que após surtos virais graves nos cultivos de 
camarões, a severidade do problema regularmente se atenua de forma rápida, em termos 
 47 
evolutivos (cerca de 1 a 2 anos), apesar de haver ainda uma alta prevalência destes vírus 
em camarões de aparência saudável. Tudo indica que os camarões sobreviventes 
desenvolvem uma tolerância ao vírus e se tornam portadores de infecção persistente, 
sem nenhum efeito negativo aparente ou sintoma da doença. Esta situação contrasta 
com o conceito de resistência viral dos vertebrados, que implica numa 
eliminação/depuração do agente causador da infecção pelos sobreviventes que se 
tornam então resistentes a uma nova re-infecção. A condição de tolerância adquirida 
pelos camarões sobreviventes permanece por toda sua vida e é transferida em baixa 
dose para toda sua progênie que também desenvolve infecções virais persistentes sem, 
contudo, desencadear a doença. 
Este conceito encontra suporte no fato de que infecções duplas, triplas e múltiplas 
são freqüentemente detectadas em camarões de aparência saudável. Flegel (2007) 
sugere que as infecções persistentes atuariam como uma espécie de memória, que 
levaria a uma diminuição especifica da severidade da doença através da redução da 
apoptose induzida pelo vírus. Esta hipótese baseia-se no fato já mencionado que os 
níveis de apoptose aumentam drasticamente em camarões moribundos durante os surtos 
virais, podendo atingir valores muito altos (até 40%, de morte celular, Sahtout et al., 
2001) e que a morte do camarão seria uma conseqüênciadeste excesso de apoptose. 
O conceito de acomodação viral propõe, assim, que o camarão coexista com os 
vírus sem haver efeitos negativos, devido a um processo combinado vírus-hospedeiro, 
que envolve a redução do processo apoptótico no hospedeiro induzido pelo vírus. 
Reforçando este conceito, foi ainda evidenciado que camarões sem sintomas de doença, 
mas com infecção viral persistente não apresentavam apoptose nas células infectadas 
(Wongprasert et al., 2003). Contudo, os mecanismos moleculares subjacentes à 
tolerância aos vírus patogênicos pelo camarão são ainda desconhecidos e provavelmente 
distintos da tolerância imunológica dos vertebrados. Por outro lado, falta também 
confirmar se esta aparente tolerância adquirida é efetivamente provocada por uma 
redução/supressão de apoptose, ou se é devida a outros processos celulares/moleculares 
de controle viral ainda desconhecidos. 
 
 
1.7.5 Outros mecanismos antivirais 
 
 48 
Além das defesas antivirais discutidas acima, outros mecanismos antivirais foram 
também relatados em crustáceos, sendo alguns mencionados a seguir. Recentemente, 
uma proteína com propriedade antiviral foi descrita na hemolinfa de P. monodon e 
denominada PmAV (Luo, 2003; 2007). A PmAV mostrou forte atividade contra um 
vírus de peixe (SGIV) já mencionado anteirormente, e sua expressão é induzida em 
resposta a infecção pelo WSSV em P. monodon. 
Foi também recentemente relatado, que o silenciamento do ALF no lagostim P. 
leniusculus, via RNAi, resulta num aumento significativo de sua susceptibilidade ao 
WSSV. Estes resultados evidenciam o papel deste AMP de amplo espectro também nas 
defesas antivirais de crustáceos, embora de forma ainda desconhecida (Liu et al., 
2006a). 
Mostrou-se ainda que extratos de vários tecidos de crustáceos (caranguejos e 
camarões) apresentam atividades antivirais significativas contra uma série de vírus de 
interesse médico (Pan et al., 2000). Contudo, estas moléculas e seu mecanismo de ação 
não são ainda conhecidos, assim como seu papel antiviral nos próprios crustáceos. 
Finalmente, foi referido recentemente que a hemocianina purificada da hemolinfa 
de P. monodon possui atividade antiviral contra vírus de peixes (Zhang et al., 2004). 
Contudo, estes resultados parecem bastante inconsistentes, uma vez que a hemocianina 
é a molécula mais abundante da hemolinfa dos crustáceos, podendo representar 90-95% 
do total de proteínas hemolinfáticas e mesmo assim, as infecções virais ocorrem em 
camarões. 
 
 
1.7.6 Mecanismos de evasão viral 
 
Em vertebrados, após a entrada dos vírus no organismo, estes são geralmente 
reconhecidos como partículas estranhas e iniciam uma série de respostas imunológicas 
que tentam impedir sua entrada nas células, sua replicação e sua propagação. Após seu 
reconhecimento, ocorre no hospedeiro uma cascata de respostas celulares e humorais, 
que incluem a ativação de células NK e de linfócitos T citotóxicos (CTLs), a produção 
de anticorpos específicos neutralizadores, a produção de várias citocinas sinalizadoras, 
como os IFNs, que interagem com os linfócitos e suprimem ou expandem suas funções 
imunológicas. 
 49 
Os vírus podem utilizar diferentes mecanismos para se evadir das defesas 
imunológicas do hospedeiro vertebrado, sendo as principais (1) a modulação da função 
do complexo principal de histocompatibilidade (do inglês, MHC) que apresenta os 
antígenos virais, (2) a inibição/modulação de diferentes quimiocinas e citocinas 
sinalizadoras incluindo os IFNs, (3) a evasão dos CTLs e NK, (4) a inibição da 
apoptose, e (5) a interferência com a via RNAi (Abbas et al., 2007). 
Em crustáceos, os mecanismos de evasão viral não são ainda conhecidos, mas 
provavelmente devem incluir a inibição/modulação de várias respostas imunológicas 
como, a ativação do sistema proPO, a expressão de citocinas implicadas na resposta 
antiviral (ainda desconhecidas), a expressão de moléculas antivirais como a PmAV e 
ALF, a expressão de PRPs ou outros receptores celulares utilizados na interiorização 
dos vírus e a interferência com a via RNAi. 
Dentre os mecanismos de evasão viral em camarões, os mais salientados 
atualmente são o retardo/supressão do processo apoptótico na célula infectada, e o 
silenciamento dos produtos gênicos virais, via-RNAi, como explicado anteriormente. O 
conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes a estes dois processos, que 
estão atualmente em estudo, deverão fornecer num futuro próximo, ferramentas úteis 
para o controle de infecções virais em camarões. 
 
 
2. IMUNOESTIMULANTES 
 
O grande interesse em compostos imunoestimulantes surgiu da necessidade de se 
tratar câncer em humanos, buscando compostos capazes de ativar as células do sistema 
imunológico (macrófagos, células NK, linfócitos B e T), para aumentar sua capacidade 
de destruir os tumores. Por outro lado, além de conferir uma maior proteção contra 
tumores, a ativação das células imunológicas leva ainda a uma maior resistência a 
infecções por diferentes microrganismos, como vírus, bactérias, fungos e parasitas. 
Substâncias imunoestimulantes vêm sendo obtidas a partir de várias fontes 
naturais e também por síntese química, com base na estrutura molecular dos próprios 
produtos naturais. Dentre estes compostos, muitos são derivados de microrganismos ou 
de algas, destacando-se os componentes da parede celular de diferentes bactérias, 
fungos, micro e macroalgas. Os principais princípios ativos destes componentes, 
capazes de gerar uma imunoestimulação são: fragmentos de peptidoglicanas (PGs), 
 50 
lipopolissacarídeos (LPS), lipopeptídeos, polissacarídeos sulfatados, �-glicanas, acil-
oligopeptídeos e peptídeos bacterianos específicos (vide revisão de Song e Huang, 
2000). 
Com relação a camarões, muitas substâncias ditas imunoestimulantes têm sido 
utilizadas com o propósito de aumentar sua resistência natural, haja vista a 
impossibilidade de vacinação destes animais. No entanto, existe uma falta quase 
completa de informação sobre o mecanismo de ação destes compostos em nível de 
sistema imune de camarões, além de não haver consenso sobre sua real eficácia e sobre 
a reproduzibilidade dos resultados. 
Já é muito bem estabelecido que a melhor forma de se prevenir infecções nos 
cultivos de camarões está ligada essencialmente às boas práticas de manejo, que 
incluem boa qualidade da água, densidade populacional adequada, boa nutrição e 
redução de fatores ambientais potencialmente estressantes (principalmente variações 
bruscas de salinidade, temperatura e oxigênio). O uso de substâncias capazes de 
aumentar a imunocompetência dos camarões, em paralelo a um bom manejo do cultivo, 
desponta certamente como uma ferramenta promissora na busca de uma maior proteção 
imunológica contra a instalação de infecções. 
Existe uma real necessidade de se maximizar a imunocompetência de camarões 
cultivados, minimizando o uso de agentes terapêuticos químicos, como antibióticos, que 
contaminam a carne do animal e o ambiente e ainda induzem o aparecimento de 
microrganismos resistentes. 
Muitas substâncias consideradas imunoestimulantes têm sido utilizadas nos 
cultivos de camarões, para aumentar sua resistência imunológica e seria impossível 
cobrir, neste capítulo, a infinidade de relatos que existem a este respeito. Dentre os 
compostos mais utilizados nos cultivos destacam-se as �-1,3/1,6-glicanas de fungos ou 
algas, PGs de bactérias Gram-positivas, LPS de bactérias Gram-negativas, 
polissacarídeos sulfatados de algas e algumas proteínas virais (para referências vide 
Song e Huang, 2000 e Smith et al., 2003). Dentre estes imunoestimulantes, as �-
glicanas são talvez as mais amplamente utilizadas para camarões e as presumivelmente 
mais imunoefetivas (vide revisão de Smith et al., 2003). 
Além destes componentes da superfície de microrganismose de algas, outros 
produtos também se mostraram aparentemente imunoefetivos para camarões, como 
extratos de diferentes ervas (Citarasu et al., 2006), bacterinas (bactérias inativadas por 
calor, formol, ou liofilizadas, principalmente vibrios), probióticos e suplementos 
 51 
nutricionais (astaxantina e ácido ascórbico polifosfatado) (para referências vide Song e 
Huang, 2000). Vários destes compostos são atualmente vendidos comercialmente, 
outros estão em fase experimental e outros ainda aguardam financiamento para uma 
eventual produção comercial (Smith et al., 2003). 
Os imunoestimulantes são usualmente utilizados nos cultivos de camarões sob 
forma de banho (imersão dos animais), ou como suplemento na dieta, ou mais 
raramente sob forma de injeção (aparentemente mais eficaz). Torna-se evidente, que 
dentre estes métodos, a adição do imunoestimulante na ração, adequa-se melhor à 
viabilidade de utilização nas fazendas de cultivos. Já as duas outras formas de 
ministração são muito pouco viáveis, mas podem ser úteis para uso em reprodutores 
(injeção) e larvas (banhos) e para ensaios experimentais em laboratório, cujo principal 
objetivo é a compreensão do mecanismo de ação destes compostos. 
Cabe contudo salientar, que o real efeito imunoestimulante destes produtos é ainda 
bastante controverso e pouco fundamentado, uma vez que vários trabalhos relatam 
resultados opostos sobre o efeito de um mesmo imunoestimulante. Além do mais, os 
bons resultados obtidos em alguns casos não são muitas vezes reproduzíveis. Como 
exemplo entre muitos, podemos citar o uso das �-glicanas, que em alguns casos confere 
efeitos benéficos para os camarões tratados (aumento da performance e 
imunoestimulação) (Sung et al, 1996) e em outros não afeta ou mesmo prejudica os 
animais (Schlolz et al., 1999; Sritunyalucksana et al., 1999a). A compreensão do 
mecanismo de ação destes produtos é, portanto, de crucial importância para que seu uso 
possa ser validado. 
Outro ponto importante a considerar, diz respeito à ministração dos 
imunoestimulantes na dieta dos camarões. Como explicar a resistência destes compostos 
à digestão pelas enzimas do sistema digestivo ou a sua penetração aparentemente intacta 
pelo epitélio/cutícula do intestino para atingir a hemolinfa a fim de ativar o sistema 
imunológico do camarão? Alternativamente, existiriam moléculas sinalizadoras 
presentes no intestino/cutícula capazes de reconhecer especificamente padrões 
moleculares nestes imunoestimulantes e transmitir a sinalização para a hemolinfa? 
Deve ainda ser claramente observado, que a busca de uma ativação das respostas 
imunológicas no camarão tratado com imunoestimulantes não é desejável, como forma 
de prevenir infecções. Qual seria o propósito de ativar o sistema imune do camarão, 
induzindo uma lise e/ou degranulação de seus hemócitos, com liberação de todo seu 
arsenal imunológico em momento inoportuno, na ausência de patógenos? A presença de 
 52 
tantas moléculas tóxicas potentes, como quinonas/hemiquinonas e radicais livres (ROIs 
e RNIs), na ausência de um processo infeccioso, levaria certamente a uma sobrecarga 
energética dispendiosa e inútil para os animais, além de provocar danos sérios aos seus 
próprios tecidos. Assim sendo, os vários relatos que reportam a ativação destes 
parâmetros hemato-imunológicos em camarões tratados com diferentes 
imunoestimulantes devem ser olhados com reserva. 
O que se busca de fato no cultivo de camarões não é um sistema imunológico 
continuamente ativado como parece querer ser demonstrado em vários relatos, e sim um 
estado de maior imunocompetência dos animais, que lhes proporcione uma maior 
capacidade e rapidez de resposta imunológica por ocasião de uma invasão por 
patógenos. 
Outro ponto crucial e questionável refere-se ao momento e ao tempo de 
ministração dos imunoestimulantes, bem como ao período de proteção imunológica 
(“memória”) conferido. O que seria mais apropriado: ministrar os imunoestimulantes 
desde fases muito precoces do desenvolvimento de camarões e/ou imediatamente antes 
de um desafio ou ainda após iniciado o desafio? Aqui também, muitos dos relatos 
existentes são contraditórios e pouco convincentes (para referências vide revisão de 
Smith et al., 2003). Alguns trabalhos mostram que a ministração de imunoestimulantes 
por períodos prolongados levam a um aumento da performance dos camarões e a uma 
maior imunocompetência por um certo período de dias (Sung et al., 1994; Takahashi et 
al., 2000), enquanto outros referem o contrário (Scholz et al., 1999; Chang et al., 2000). 
Em nossa opinião, o que seria desejável numa imunoestimulação seria poder 
potencializar as defesas naturais do camarão sem custo fisiológico importante, elevando, 
por exemplo, o número de células imunológicas (hemócitos) e modulando os níveis das 
moléculas imunoefetoras e imunoreguladoras, de tal forma a deixar os animais numa 
condição ótima de imunocompetência para reagir com eficiência a uma eventual 
invasão por patógenos. Neste sentido, a possibilidade atual de se quantificar, com 
precisão, os níveis de expressão de diferentes imunomarcadores por PCR em tempo 
real, deverá trazer certamente uma importante contribuição na avaliação do estado de 
imunocompetência dos animais, mediante tratamento com imunoestimulantes. 
 
 
3. PARÂMETROS HEMATO-IMUNOLÓGICOS COMO INDICADORES DE 
SAÚDE 
 53 
 
Uma prática comum, dentro da medicina humana e veterinária, é a utilização de 
parâmetros hematológicos e bioquímicos para avaliar as condições de saúde dos 
indivíduos e para auxiliar no diagnóstico de diferentes enfermidades. Na carcinicultura, 
a utilização destas ferramentas como indicadores da saúde vem sendo comumente 
utilizadas, apesar da grande variablilidade nos valores de referência destes parâmetros 
nestes animais, mesmo dentro de uma mesma população, sexo e estágio de 
desenvolvimento. 
Os parâmetros hemato-imunológicos mais comumente empregados em crustáceos 
são: (1) hemogramas (contagem total e diferencial de hemócitos), (2) coagulação da 
hemolinfa, (3) atividade da enzima PO, (4) índice fagocítico, (5) produção de ROIs, (6) 
atividade antimicrobiana, (7) título hemaglutinante do plasma e (8) concentração de 
proteínas totais da hemolinfa. Outros parâmetros, contudo, começam a ser 
implementados, como a atividade da lisozima hemolinfática, produção de RNIs e 
atividade do inibidor de protease �2M (Tab. 3). 
Dentre os parâmetros acima citados, as alterações mais evidentes em animais 
(principalmente camarões) infectados/estressados referem-se à modulação do número 
total de hemócitos ou THC (do inglês, total hemocyte count) e a diminuição da 
capacidade coagulante da hemolinfa (vide revisões de Lightner,1996 e Lee et al., 1999). 
É bem conhecido, na prática de cultivo, o aumento no tempo de coagulação da 
hemolinfa em crustáceos sob estresse fisiológico ou durante infecções (Jussila et al., 
2001; Song et al., 2003). A técnica clássica para avaliar este parâmetro, escoamento da 
hemolinfa em capilar de vidro (Sarathi et al., 2007) é simples e, se bem efetuada, pode 
gerar informações úteis sobre o estado de saúde dos animais. Como explicado 
anteriormente, o processo de coagulação envolve vários fatores: a proteína de 
coagulação, a enzima hemocitária TGase e a concentração plasmática de Ca2+. Não se 
sabe ainda ao certo qual destes fatores é o responsável pelo aumento no tempo de 
coagulação em animais estressados/infectados. Contudo, estudos recentes sugerem que 
haja uma interação destes fatores. Camarões L. vannamei infectados com TSV 
apresentam uma atividade significativamente diminuída de TGase nos hemócitos, além 
de uma queda de 16 a 20% na concentração de cálcio plasmático e têm uma capacidade 
diminuída de coagulação (Song et al., 2003). 
Tabela 3: Principais parâmetros hemato-imunológicos utilizados na avaliaçãodo estado de 
saúde de camarões e outros crustáceos. 
 54 
 
 
Parâmetro hemato-imunológico 
 
 
Utilidade 
 
Determinação em campo* 
Hemogramas Essencial 
(porém muito variáveis) 
Sim 
 
Índice fagocítico Boa Não 
Produção de ROI Essencial Não 
Produção de RNI Análises ainda iniciais Não 
Núcleos apoptóticos Boa (para vírus) Sim 
Tempo de coagulação Boa (para animais muito 
estressados/doentes) 
Sim 
Proteína total do plasma Razoável 
(para animais muito 
estressados/doentes) 
 
Possível 
Atividade da PO Essencial 
(porém muito variável) 
Possível 
Atividade de outras enzimas/proteínas 
(SOD, lisozima, �2M, etc.) 
Razoável a boa 
(porém muito variável) 
 
Não 
Atividade antibacteriana Boa Não 
Atividade aglutinante do plasma Razoável 
(porém não varia muito) 
Possível 
Expressão de proteínas imunológicas 
(PCR-tempo real) 
Essencial Não 
* As análises viáveis mostradas nesta tabela podem ser realizadas por funcionários treinados, das próprias fazendas 
de cultivo, necessitando de infra-estrutura média (microscópios; espectrofotômetro, reagentes, entre outros). As 
análises que aparecem como não viáveis necessitam do apoio de laboratórios externos (equipamentos e reagentes 
especiais) com profissionais qualificados. 
 
 
A contagem total de hemócitos circulantes (THC), por sua vez é um dos 
imunoparâmetros mais utilizados para expressar as condições de saúde de crustáceos. A 
modulação da THC é utilizada em diferentes espécies sob condições de estresse 
ambiental e/ou fisiológico e durante infecções (vide revisão Rodriguez e Le Moullac, 
2000). A THC pode aumentar ou diminuir seus valores, dependendo do tipo e tempo de 
exposição ao agente estressor. É comum se observar uma diminuição da THC durante as 
primeiras horas de um processo infeccioso e um aumento do número de células em fases 
mais tardias (Rodriguez e Le Moullac, 2000). Esta diminuição inicial deve-se 
provavelmente a uma migração e infiltração dos hemócitos nos tecidos infectados, 
enquanto o aumento posterior é provavelmente fruto da liberação de novas células a 
partir dos órgãos hematopoiéticos (van de Braak et al., 2002b). A maioria dos autores 
concorda que um aumento na THC deve proporcionar uma maior proteção dos 
crustáceos contra infecções, uma vez que os hemócitos são os principais responsáveis 
pelas diferentes reações imune- celulares (vide revisão de Jiravanichpaisal et al., 2006) e 
são os sítios de expressão das diferentes moléculas imunológicas (Gross et al., 2001). 
 55 
Curiosamente, a alteração na proporção dos tipos de hemócitos em crustáceos não é 
muito usual durante situações de estresse ou durante infecções (Rodriguez e Le 
Moullac, 2000; Vogan e Rowley, 2002). 
A produção de ROIs pelos hemócitos de crustáceos, mensurada principalmente 
pela produção de ânions superóxido, tem se revelado um dos imunoparâmetros mais 
consistentes para avaliar o estado de imunocompetência dos camarões. A avaliação da 
produção intracelular de O2- pelos hemócitos fagocitários é usualmente determinada 
pelo método de redução do composto NBT, ou pela técnica da quimioluminescência, 
utilizando componentes da superfície de microorganismos como LPS e ß-1,3-glicanas 
(laminarina, zymosan, curdlan) para estimulação in vitro. Este imunoparâmetro é 
também muito utilizado para avaliar o efeito de substâncias imunoestimulantes em 
camarões (Song e Hsieh, 1994; Muñoz et al., 2000; Campa-Córdova et al., 2002a; b). 
O primeiro relato de produção de ROIs em camarões foi publicado por Song e 
Hsieh (1994) em P. monodon e, desde então, estudos com outras espécies foram 
relatados e as metodologias adaptadas. Existem, contudo, diferenças fundamentais entre 
os protocolos experimentais utilizados pelos diferentes grupos que estudam crustáceos, 
o que resulta freqüentemente em resultados díspares e pouco comparáveis. Como 
exemplo, podemos citar o trabalho de Muñoz et al. (2000) em L. vannamei, que relata 
uma porcentagem muito baixa de estimulação dos hemócitos pelo zymosan (30%), após 
2h de incubação, enquanto em nosso laboratório ocorre uma alta estimulação 
hemocitária (80%) na mesma espécie, em apenas 15 min de incubação com o mesmo 
indutor (Guertler, 2007). 
Em camarões P. monodon (Sung et al., 1996) e L. vannamei (Muñoz et al., 2000) 
infectados com bactérias do gênero Vibrio, observou-se um aumento da produção de 
ROIs. No entanto, apenas as espécies V. alginolyticus e V. anguillarum foram capazes 
de estimular a produção de ânion superóxido, enquanto Vibrio harveyi não causou 
nenhuma alteração na produção deste radical (Muñoz et al., 2000). Estes resultados 
poderiam explicar a patogenicidade desta bactéria para esta espécie de camarão. 
Em relação às infecções por vírus, foi mostrado que em L. vannamei infectados 
com WSSV, ocorre uma redução significativa da produção de ROIs, assim como de 
outros imunoparâmetros, como a THC, atividade fagocítica, atividade da PO e atividade 
da SOD (Chang et al., 2003). De maneira semelhante, infecções com TSV, também 
resultaram num declínio significativo dos valores da THC, atividade da PO, 
concentração de proteínas totais e de íons Ca2+ e Cu2+ no plasma de L. vannamei (Song 
 56 
et al., 2003). Estes resultados parecem indicar que alguns parâmetros hemato-
imunológicos podem efetivamente refletir o estado de saúde de camarões. 
A atividade antimicrobiana da hemolinfa de crustáceos vem também sendo 
utilizada como potencial imunoparâmetro durante infecções e outras situações de 
estresse (Sritunyalucksana et al., 1999a; Tsvetnenko et al., 2001; Vogan e Rowley, 
2002). Como mencionado anteriormente, a maioria dos AMPs não é constituída por 
moléculas prontamente induzíveis. Estas, se encontrame armazenadas nos grânulos dos 
hemócitos e podem ser utilizadas intracelularmente ou exocitadas mediante estímulo 
apropriado. Contudo, muitas famílias de AMPs podem ser induzidas em fases mais 
tardias de infecção, ou podem ainda ser inibidas em situações de estresse. Como 
exemplo pode ser citada a indução tardia das crustinas e peneidinas, após 48h de 
infecção, como discutido anteriormente. Assim sendo, a modulação dos níveis de AMPs 
pode representar um importante imunoparâmetro no monitoramento do estado de saúde 
de crustáceos. 
Em relação à capacidade aglutinante da hemolinfa, é conhecido o fato de que 
infecções e outras situações de estresse podem resultar na alteração dos títulos 
aglutinantes da hemolinfa de crustáceos. Como exemplo, podemos citar, que em P. 
monodon infectados por Vibrio vulnificus ocorre um aumento da atividade aglutinante 
de seu plasma (Ratanapo e Chulavatnatol, 1992). Já, em fêmeas adultas de L. vannamei, 
submetidas ao processo de ablação unilateral para maturação ovariana, ocorre uma 
redução significativa do título aglutinante de sua hemolinfa, provavelmente em resposta 
a esta prática mutilatória (Maggioni et al., 2004). É importante salientar que os níveis da 
atividade aglutinante nem sempre sofrem uma variação significativa em resposta a 
infecções ou situações de estresse. Em F. paulensis, por exemplo, não houve alteração 
dos títulos aglutinantes em animais mantidos em baixas salinidades ou após ablação 
(Perazzolo et al., 2002). 
Por outro lado, estudos recentes sobre a expressão gênica de uma lectina tipo-C de 
F. chinensis (Fclectin) mostraram uma super-expressão desta molécula após 3 e 12 h de 
infecção com o WSSV e bactérias Gram-negativas, respectivamente, sugerindo que esta 
lectina seja expressa de maneira diferenciada segundo o agente infeccioso (Liu et al., 
2007). 
A concentração de proteínas totais do plasma de crustáceos é também um 
parâmetro muito utilizado para avaliar o estado de saúde dos camarões. Apesar deste 
parâmetro ser afetado por fatores ambientais e fisiológicos (Chen e Cheng, 1995; Rosas 
 57 
et al.,2000; Sánchez et al., 2001) ou durante infecções e injúrias (Hennig et al., 1998; 
Perazzolo et al., 2002; Vogan e Rowley, 2002), o significado desta variação necessita 
ainda ser melhor compreendida. 
Devemos considerar que o pigmento respiratório hemocianina representa cerca de 
90-95% das proteínas totais do plasma de crustáceos (Rochu e Fine, 1978) e flutuações 
na sua concentração reflete-se diretamente neste tipo de parâmetro hematológico. 
Apesar de a hemocianina estar envolvida com a imunologia de crustáceos, uma vez que 
sua clivagem pode gerar fragmentos com função de PO ou de peptídeo antimicrobiano, 
como mencionado anteriormente, a utilização dos níveis desta proteína como 
imunoparâmetro deve ainda ser melhor investigada. 
A modulação da atividade da PO constitui um dos principais imunoparâmetros 
utilizados para avaliar o estado de saúde de crustáceos. Contudo, a atividade desta 
enzima nem sempre é alterada em situações de estresse ou infecções. Alguns relatos 
mostram a modulação da atividade da PO durante um estresse ambiental e/ou 
fisiológico (Le Moullac e Haffner, 2000; Hsu et al., 2007), ou durante infecções e 
injúrias (Vogan e Rowley, 2002; Chang et al., 2003; Song et al., 2003; Sarathi et al., 
2007). 
Por outro lado, existem também relatos mostrando que a atividade da PO não se 
altera durante infecções, como no caranguejo Cancer pagurus afetado pela síndrome do 
escurecimento da cutícula (Vogan e Rowley, 2002) e em P. monodon injetados com 
componentes da superfície de bactérias e fungos (Sritunyalucksana et al., 1999a). De 
forma semelhante, a atividade da PO não mostrou diferença significativa quando F. 
paulensis foram submetidos a um estresse osmótico ou após ablação (Perazzolo et al., 
2002). O mesmo foi verificado em fêmeas de L. vannamei submetidas à ablação 
(Maggioni et al., 2004). 
Recentemente, a utilização de técnicas de biologia molecular tem auxiliado de 
forma crucial a entender as respostas imunológicas desencadeadas em crustáceos e os 
mecanismos envolvidos na interação patógeno-hospedeiro, ainda tão pouco conhecidos. 
Estas técnicas envolvem basicamente a identificação e quantificação da expressão 
gênica de diferentes moléculas imunológicas e incluem em especial: (1) a técnica da 
reação em cadeia da polimerase em tempo real, (2) a SSH (do inglês, suppression 
subtractive hybridization), (3) a DD-PCR (do inglês, differential display PCR), e (4) 
análises de cDNA por microarrays. 
 58 
A infecção por WSSV, por exemplo, parece modular a expressão de vários genes 
em camarões, incluindo proteínas antimicrobianas e antivirais, transdutores de sinal 
intracelulares, componentes do sistema RNAi, fatores de transcrição, reguladores de 
apoptose, proteases e inibidores de proteases, proteínas de estresse oxidativo e 
moléculas de adesão celular (Leu et al., 2007; Robalino et al., 2007b; Zhao et al., 2007). 
Em um estudo com L. vannamei, verificou-se a ocorrência de indução da 
expressão de duas proteínas antibacterianas, a lisozima e o ALF, após infecção com 
WSSV (Robalino et al., 2007b). Já, em P. monodon infectado com o mesmo vírus, 
constatou-se o aumento da expressão de uma proteína que se liga à quitina, uma 
peritrofina de matriz (Leu et al. 2007), que parece formar uma barreira preventiva 
contra a invasão por bactérias, vírus e parasitas (Lehane, 1997). 
Um trabalho interessante analisou muito recentemente a expressão diferencial de 
genes em camarões L. vannamei selecionados geneticamente, quanto à sua 
susceptibilidade e resistência à infecção pelo WSSV (Zhao et al., 2007). Vários genes 
foram expressos diferencialmente no hepatopâncreas de camarões resistentes. Houve 
uma maior expressão constitutiva de: hemocianina, lectinas do tipo C, lisozima, 
proteínas apoptóticas, enzimas oxidativas, proteínas regulatórias da ecdise, quitinase, 
lacase, catepsina L e zinco-proteinase, nestes animais em relação a camarões 
suscetíveis. É interessante notar que a infecção experimental de animais resistentes com 
WSSV, aumenta ainda mais a expressão de alguns destes genes, relacionados direta ou 
indiretamente a respostas imunes, como a hemocianina, catepsina, lacase, lectinas e 
lisozimas. 
Infecções bacterianas também parecem modular a expressão gênica de algumas 
moléculas imunológicas. Camarões da espécie P. monodon infectados com V. harveyi 
apresentaram um aumento na expressão de lisozima e ALF e uma diminuição da 
expressão de serpinas (Somboonwiwat et al., 2006). Já, em juvenis de L. vannamei 
injetados com LPS, ocorre uma diminuição dos níveis de RNAm para vários AMPs 
(PEN2, PEN3, PEN4 e crustina), sendo esta diminuição dose-dependente (Okumura, 
2007). Contrariamente, a expressão da proPO não é alterada (Okumura, 2007). 
Fatores ambientais estressantes também podem modular a expressão de certos 
genes imunológicos em camarões. A hipertermia parece inibir da expressão de proPO e 
lisozima em juvenis P. monodon, o que poderia implicar numa menor resistência à 
infecções em águas mais quentes (de-la-Vega et al., 2007). A expressão da lisozima 
nesta espécie também é inibida quando submetidos a estresse osmótico. Por outro lado, 
 59 
a hemocianina é super-expressa nestes animais sob estresse osmótico e diminuída em 
condições de hipertermia e hipóxia (de-la-Vega et al., 2007). 
Em suma, o estabelecimento de parâmetros hemato-imunológicos como 
indicadores de saúde em crustáceos e as análises moleculares da expressão gênica de 
moléculas imunológicas podem fornecer, em conjunto, informações valiosas do estado 
de saúde dos crustáceos cultivados, bem como dos mecanismos envolvidos na interação 
patógeno-hospedeiro. Apesar de representar ainda um campo novo, esta área merece ser 
desenvolvida e melhor utilizada dentro da carcinicultura. 
Nestes últimos anos houve um considerável progresso no estudo do sistema imune 
de crustáceos, embora não se tenha ainda podido selecionar um painel de parâmetros 
hemato-imunológicos realmente sensíveis e de resposta inequívoca, capazes de 
expressar com precisão as condições de saúde destes animais. Estudos deste tipo 
deveriam ser fortemente estimulados, em especial para crustáceos de interesse 
econômico, que não podem ser vacinados. 
Contudo, convém ressaltar, que vários fatores limitam ainda uma interpretação 
segura e inequívoca das análises dos parâmetros hemato-imunológicos em crustáceos. 
Um dos principais fatores refere-se às enormes diferenças nos valores fisiológicos 
considerados “normais” ou de referência para uma determinada espécie. Estas 
diferenças estão possivelmente relacionadas ao tipo de ambiente em que o animal se 
encontra, a salinidade, temperatura, estado nutricional, idade e estágio de muda (vide 
revisão de Noga, 2000). Por outro lado, não existe ainda uma efetiva padronização das 
técnicas utilizadas para avaliar estes parâmetros em crustáceos, o que também leva a 
resultados muitas vezes discrepantes e impossibilita análises comparativas dentro da 
mesma espécie ou entre espécies. Seria, portanto, de fundamental importância buscar-se 
uma padronização destas técnicas entre os diferentes grupos de pesquisa que estudam 
crustáceos. 
Em suma, de um ponto de vista aplicado, o conhecimento do sistema imune de 
crustáceos poderia trazer importantes subsídios e abrir novas perspectivas para: (1) 
desenvolver técnicas de diagnóstico para diferentes patologias; (2) estabelecer 
marcadores imunológicos que indiquem precocemente a presença de infecções ou 
contaminantes ambientais; (3) desenvolver compostos imuno-estimulantes, e (4) 
auxiliar programas de seleção genética de reprodutores, na obtenção de animais mais 
resistentes a infecções. 
 
 60 
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 
 
Como mencionado várias vezes nesta exposição, o principal fator limitante a 
ameaçar a sustentabilidade da carcinicultura a nível mundial refere-se às enfermidades,principalmente as de origem viral. Muito progresso tem sido feito ultimamente na 
compreensão dos mecanismos imunológicos de crustáceos, destacando-se a 
identificação de várias proteínas de reconhecimento padrão (PRPs), a produção de 
várias famílias de antibióticos naturais (AMPs) e os mecanismos de defesa antiviral, 
como a via RNAi. Falta porém esclarecer ainda, muitos outros aspectos importantes, 
como as bases moleculares da sinalização celular e da transdução de sinal, mecanismos 
estes já razoavelmente esclarecidos em alguns artrópodes como Drosophila e 
limulídeos, mas praticamente desconhecidos em crustáceos. 
As respostas imunológicas contra infecções bacterianas e fúngicas, já estão 
relativamente bem elucidadas em crustáceos, como a ativação do sistema proPO, 
sistema de coagulação e a produção de ROIs. Por outro lado, a recente identificação em 
crustáceos de diferentes AMPs de amplo espectro antimicrobiano, está abrindo novas 
perspectivas em relação a programas de seleção genética (ou transgênese) de 
reprodutores que expressem preferencialmente determinados tipos de AMPs assim 
como no desenvolvimento de novos antibióticos para carcinicultura, capazes de evitar a 
indução de resistência em microrganismos e eliminar o risco de contaminação 
ambiental. 
No que se refere às respostas antivirais, a detecção recente de um sistema RNAi e 
de citocinas semelhantes a interferons em camarões, deverá num futuro próximo nortear 
novas estratégias de terapia antiviral (baseadas em dsDNA, por exemplo) e um controle 
mais eficiente de infecções. Paralelamente, uma maior compreensão dos mecanismos de 
indução de apoptose celular, como resposta a infecções virais, permitirá verificar se o 
conceito de acomodação viral resulta efetivamente da redução do processo apoptótico 
em animais com infecção viral persistente, sem sinais da doença, ou se este fenômeno se 
deve a outros mecanismos genéticos/moleculares ainda não conhecidos, que poderão 
ainda ser explorados. 
Cabe, no entanto, ressaltar que a ausência de linhagens celulares em cultura de 
crustáceos limita enormemente muitos estudos biológicos importantes, em especial os 
ensaios in vitro de infecção e atividade antiviral. Infelizmente, os esforços para o 
desenvolvimento destas linhagens em crustáceos não alcançaram ainda o sucesso 
 61 
esperado. Espera-se que num futuro próximo esta limitação possa ser superada e que 
linhagens celulares de crustáceos possam vir a substituir definitivamente as de peixes 
marinhos, atualmente empregadas em ensaios biológicos de crustáceos, mesmo sendo 
inapropriadas. 
A utilização de substâncias imunoestimulantes, para atingir um estado de maior 
imunocompetência em crustáceos de interesse econômico, desponta como uma 
ferramenta valiosa, uma vez que estes animais não podem ser vacinados. Contudo, o 
mecanismo de ação destes compostos é ainda pobremente compreendido, e seu efeito 
não é sempre reproduzível. Espera-se que num futuro próximo a ação imunológica 
destes compostos seja melhor compreendida e que e a carcinicultura possa contar com 
uma variedade de substâncias imunoestimulantes realmente eficazes e desprovidas de 
efeitos colaterais. 
Como mencionada nesta exposição, a avaliação do estado de saúde dos crustáceos, 
através do exame de sua hemolinfa, não costuma oferecer resultados precisos e seguros, 
como ocorre com o exame de sangue de mamíferos. Nestes últimos, existe um padrão 
claro e confiável de normalidade (saúde), associado aos valores de referência para os 
diferentes parâmetros hemato-imunológicos. Contrariamente, em crustáceos, os valores 
de referência dos parâmetros hemolinfáticos são de um modo geral muito variáveis, 
mesmo dentro de uma mesma população, mesmo sexo ou mesmo estágio de 
desenvolvimento. Isto dificulta sobremaneira o estabelecimento de índices de referência 
ou de um padrão de normalidade em crustáceos, mesmo no caso de simples 
hemogramas, tão utilizados em mamíferos. Como conseqüência, a comparação dos 
índices hemato-imunológicos de crustáceos saudáveis e infectados e/ou estressados não 
apresenta muitas vezes significância estatística, o que é freqüentemente observado em 
várias publicações. A recente possibilidade de se quantificar a expressão gênica de 
moléculas imunomarcadoras em crustáceos através de PCR em tempo real, poderá 
oferecer, apesar de seu alto custo, um quadro mais claro e confiável do estado de saúde 
de camarões de interesse econômico durante surtos infecciosos ou situações de estresse. 
De um ponto de vista aplicado, o conhecimento do sistema imune de crustáceos 
poderia trazer importantes subsídios e abrir novas perspectivas para: (1) desenvolver 
técnicas de diagnóstico para diferentes patologias; (2) estabelecer marcadores 
imunológicos que indiquem precocemente a presença de infecções ou contaminantes 
ambientais; (3) desenvolver compostos imuno-estimulantes, e (4) auxiliar programas de 
 62 
seleção genética de reprodutores, através da identificação de animais mais resistentes a 
infecções. 
Por fim, vale ainda salientar, que não existe atualmente nenhum genoma completo 
disponível de invertebrado marinho. Seria deveras interessante que o camarão 
Litopenaeus vannamei pudesse ser selecionado como espécie modelo de invertebrado 
marinho para seqüenciamento genômico, haja vista sua importância econômica na 
carcinicultura mundial. 
 
 
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