Imunologia_de_Crustáceos_-_Margue

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Imunologia de crustáceos 
com ênfase em camarões 
 
 
 
Margherita Anna Barracco, Luciane Maria Perazzolo e 
Rafael Diego Rosa 
 
 
 
 
Laboratório de Imunologia Aplicada à Aqüicultura 
Departamento de Biologia Celular Embriologia e Genética 
Universidade Federal de Santa Catarina 
Florianópolis, Santa Catarina, Brasil 
 
 
 
 
 
2007 
 2 
SUMÁRIO 
 
 
RESUMO ................................................................................................................................ 03 
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 04 
1. SISTEMA IMUNE DE CRUSTÁCEOS ............................................................................ 05 
1.1 Células imunocompetentes ou hemócitos................................................................. 07 
1.2 Reações imune-celulares: fagocitose e formação de cápsulas e nódulos ................ 08 
1.3 Mecanismos líticos e degradativos .......................................................................... 11 
1.3.1 Enzimas lisossomais e espécies intermediárias reativas de oxigênio 
(ROIs) e de nitrogênio (RNIs) ................................................................................ 11 
1.3.2 Proteínas e peptídeos antimicrobianos (AMPs) ............................................. 15 
1.4 Proteínas de reconhecimento de padrão (PRPs) ...................................................... 21 
1.4.1 Proteínas que se ligam às �-1,3-glicanas: �GBP e GBP ................................ 22 
1.4.2 Proteínas que se ligam a ambos, LPS e às �-1,3-glicanas: LGBP ................. 26 
1.4.3 Proteínas mas-like (do inglês, masquerade-like proteins) ............................. 27 
1.4.4. Aglutininas e lectinas .................................................................................... 28 
1.4.5 Receptores Toll e TLR (do inglês, Toll-like receptor) ................................... 30 
1.5 Cascata proteolítica: sistema de ativação da pró-fenoloxidase (proPO) ................. 32 
1.6 Sistema de coagulação ............................................................................................. 37 
1.7 Defesas antivirais .................................................................................................... 39 
1.7.1 Sistema Interferon .......................................................................................... 40 
1.7.1.1 Vertebrados .......................................................................................... 40 
1.7.1.2 Camarões .............................................................................................. 42 
1.7.2 Sistema RNA de interferência (RNAi) .......................................................... 43 
1.7.3. Apoptose celular mecanismo antiviral ou pró-viral? .................................... 44 
1.7.4 Conceito de acomodação viral em camarões ................................................. 46 
1.7.5 Outros mecanismos antivirais ........................................................................ 48 
1.7.6 Mecanismos de evasão viral .......................................................................... 48 
2. IMUNOESTIMULANTES ................................................................................................. 49 
3. PARÂMETROS HEMATO-IMUNOLÓGICOS COMO INDICADORES DE SAÚDE .. 53 
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ...................................................................................... 60 
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 62 
 3 
RESUMO 
 
Dentre os crustáceos, os camarões assumem especial destaque em vista de sua grande 
importância comercial na aqüicultura mundial. O sucesso desta atividade vem contudo 
sofrendo graves limitações, devido aos constantes surtos de novas enfermidades, 
principalmente de origem viral, que causam mortalidades maciças e levam a prejuízos 
econômicos incalculáveis. O presente capítulo oferece uma visão geral e atualizada do 
sistema imune inato dos crustáceos, em especial de camarões, com base no recente 
progresso realizado, na elucidação dos diferentes mecanismos de defesa contra 
patógenos. No capítulo, são discutidos as reações celulares e humorais desencadeadas 
em resposta aos agentes infecciosos, os processos de reconhecimento e os diferentes 
mecanismos imunoefetores. Ênfase especial é dada às defesas antivirais, uma vez que os 
vírus constituem os principais agentes infecciosos a ameaçar seriamente a 
sustentabilidade da carcinicultura mundial. Finalmente, o capítulo discute ainda a 
utilização e eficácia de compostos imunoestimulantes. 
 4 
INTRODUÇÃO 
 
Os crustáceos pertencem a um grupo zoológico antigo e bem sucedido, constituído 
por mais de 40 mil espécies, incluindo inúmeras espécies muito apreciadas para 
consumo humano, como camarões, lagostas, lagostins, caranguejos e siris. 
O cultivo de crustáceos, principalmente de camarões, desponta neste contexto 
como uma importante alternativa para a produção rápida e em alta escala de espécies 
para alimentação humana, auxiliando ainda a proteger as populações naturais de uma 
extração excessiva. Atualmente, cerca de 30% dos camarões consumidos no mundo são 
provenientes de cultivo e as espécies marinhas mais cultivadas são os peneídeos 
Litopenaeus vannamei (40,66%), Penaeus monodon (37,41%) e Fenneropenaeus 
chinensis (10,97%) (FAO, 2007). A carcinicultura é responsável hoje por milhões de 
empregos em países tropicais emergentes e os principais produtores mundiais são a 
China e a Tailândia na Ásia e o Equador, México e Brasil na América Latina. 
O principal fator limitante para o sucesso da carcinicultura mundial consiste 
atualmente no controle das infecções, principalmente as de origem viral. As altas 
densidades populacionais, usualmente requeridas nos cultivos, propiciam a rápida 
propagação dos agentes infecciosos, resultando geralmente em mortalidades maciças e 
levando, por conseqüência, a prejuízos econômicos incalculáveis. No momento, a 
profilaxia e o controle de doenças nos cultivos restringem-se basicamente a práticas 
adequadas de manejo e à redução das condições de estresse, uma vez que os fatores que 
determinam o estado de saúde dos camarões são ainda muito pouco conhecidos. Neste 
contexto, o estudo do sistema imune de crustáceos desponta como uma estratégia 
recente e promissora, visto que permite conhecer as bases da susceptibilidade e 
resistência destes animais a microrganismos patogênicos e parasitas, além de fornecer 
subsídios valiosos para o estabelecimento de parâmetros de saúde e imunomarcadores 
para seleção genética de animais mais resistentes a infecções. 
 
 
 5 
1. SISTEMA IMUNE DE CRUSTÁCEOS 
 
Os invertebrados marinhos estão em constante contato, em seu ambiente natural, 
com uma grande diversidade de microrganismos, incluindo múltiplos vírus, que podem 
constituir uma séria ameaça à sua sobrevivência. Contudo, o evidente sucesso desse 
grupo zoológico ao longo dos mais de 500 milhões de anos de sua história evolutiva 
confirma a presença de um sistema imunológico eficiente e capaz de protegê-los contra 
a invasão por agentes causadores de doenças. 
A primeira linha de defesa desses animais é conferida pela presença de uma 
carapaça externa rígida ou exoesqueleto, que funciona como uma barreira físico-
química protetora. Além disso, todo o trato digestivo desses animais, que é a principal 
via de entrada de microrganismos, é também revestido por uma camada quitinosa e 
oferece um ambiente ácido e repleto de enzimas, capaz de inativar e digerir a maioria 
dos microrganismos que não faz parte de sua microbiota natural. Quando essas barreiras 
são transpostas, não sendo suficientes paraimpedir a penetração de patógenos, 
desencadeia-se no hospedeiro uma série de reações imunológicas complexas com o 
objetivo de neutralizar e eliminar os agentes invasores. 
A exemplo de outros invertebrados, os crustáceos apresentam apenas um sistema 
imune inato, diferentemente dos vertebrados que possuem, além desse, um sistema 
imune adaptativo. O sistema imune inato, filogeneticamente mais antigo, é encontrado 
em todos os organismos multicelulares, incluindo invertebrados e plantas, enquanto o 
sistema adaptativo ocorre apenas nos vertebrados. Este último caracteriza-se pela 
presença de uma infinidade de receptores e anticorpos altamente específicos e pela 
indução de células de memória, que garantem uma resposta de defesa altamente 
eficiente e específica para os mais diversos patógenos. Esta resposta decorre da 
presença de uma linhagem celular linfocítica, presente apenas nos vertebrados, e em 
quem se apóiam todos os mecanismos de especificidade e de memória imunológica. 
Desta forma, sua ausência nos invertebrados inviabiliza qualquer tentativa de 
desenvolvimento de vacinas, na concepção clássica da palavra, diminuindo assim de 
forma substancial, a possibilidade de se prevenir e controlar infecções em crustáceos. 
O sistema circulatório dos crustáceos é do tipo aberto ou semi-aberto, por onde 
transita um tecido fluido denominado hemolinfa, correspondente ao sangue dos 
vertebrados (Fig. 1). Na hemolinfa são transportados continuamente nutrientes, 
excretas, oxigênio, hormônios e outras moléculas importantes para os diferentes órgãos 
 6 
desses animais. Devido à sua fluidez e pela capacidade de atingir diretamente todos os 
tecidos dos crustáceos, a hemolinfa contém ainda todos os componentes do sistema 
imunológico. 
 
 
 
Figura 1: Sistema circulatório aberto/semi-aberto de camarão e órgãos associados. C: coração; 
HP: hepatopâncreas; OHA: órgão hematopoiético antenal; OHD: órgão hematopoiético dorsal; 
OHV: órgão hematopoiético ventral; OL: órgão linfóide; VD: vaso dorsal (adaptado de Bachère 
et al., 2004). 
 
 
A hemolinfa é composta por uma fração celular, representada pelas células 
circulantes ou hemócitos, e por uma fração líquida, constituída pelo plasma que contém 
diferentes fatores humorais. As respostas imune-celulares e humorais atuam de forma 
integrada nos crustáceos, protegendo-os contra a invasão de microrganismos e parasitas 
e garantindo assim sua integridade corpórea e homeostática. 
Os principais sistemas de defesa atualmente reconhecidos nos crustáceos são: (1) 
coagulação da hemolinfa; (2) melanização mediada pelo sistema pró-fenoloxidase; (3) 
reconhecimento e aglutinação celular mediada por lectinas; (4) sistemas antibacterianos, 
antifúngicos e antivirais mediados por peptídeos, RNA de interferência e por proteínas 
de reconhecimento padrão; (5) produção de espécies reativas de oxigênio e de 
nitrogênio; e (6) sistema fagocítico e de encapsulamento (vide revisão de Iwanaga e 
Lee, 2005). 
 7 
1.1 Células Imunocompetentes ou Hemócitos 
 
As respostas imune-celulares dos crustáceos estão basicamente relacionadas às 
células da hemolinfa ou hemócitos, e incluem a fagocitose de microrganismos, a 
formação de cápsulas e nódulos em torno de partículas estranhas e os mecanismos 
citotóxicos e/ou degradativos intracelulares utilizados para degradar e eliminar os 
agentes invasores. Muitas dessas moléculas microbicidas encontram-se armazenadas 
dentro de vesículas ou grânulos de certas populações de hemócitos, enquanto outras são 
constitutivamente secretadas para a hemolinfa, atuando em diferentes cascatas 
imunológicas. Além de atuarem nas respostas de defesa, os hemócitos ainda participam 
no reparo de ferimentos, esclerotização da cutícula e acredita-se ainda que estejam 
envolvidos no metabolismo e transporte de carboidratos (Jiravanichpaisal et al., 2006). 
A compreensão das reações imune-celulares dos crustáceos depende, de forma 
crucial, da identificação e caracterização de suas células imunocompetentes. Apesar de 
não haver ainda uma classificação uniforme e consensual para estas células, três tipos de 
hemócitos são usualmente reconhecidos e descritos nos crustáceos (Figs. 2A-F): 
hemócitos hialinos (HHs), hemócitos semi-granulares ou com grânulos pequenos 
(HGPs) e hemócitos granulares ou com grânulos grandes (HGGs) (vide revisões de 
Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Johansson et al., 2000). A falta de uniformidade na 
identificação dos hemócitos deriva principalmente do fato de estas células serem muito 
lábeis e reativas, alterando rapidamente suas características morfofisiológicas in vitro, o 
que torna seu estudo mais difícil do que aquele dos leucócitos dos vertebrados. 
A ativação dos hemócitos dos crustáceos resulta geralmente em seu espraiamento 
e degranulação, havendo a liberação de uma grande variedade de efetores imunológicos 
para o plasma. Nestes últimos anos houve um grande progresso no estudo destas 
células, devido ao desenvolvimento de várias soluções anticoagulantes específicas, além 
de meios capazes de estabilizar adequadamente os hemócitos in vitro. Além do mais, a 
separação das diferentes populações de hemócitos por gradientes de Percoll, a produção 
de anticorpos monoclonais, a clonagem e caracterização de genes que codificam para 
efetores imunológicos nos diferentes tipos celulares vêm contribuindo para uma maior 
compreensão do funcionamento das diferentes populações hemocíticas. 
De uma maneira geral, os HHs de crustáceos são usualmente descritos como os 
menores hemócitos, com uma alta relação núcleo-citoplasmática e contendo de nenhum 
a poucos grânulos (Figs. 2A,D). De acordo com alguns autores, esse tipo de hemócito 
 8 
pertence a uma linhagem celular distinta daquela dos hemócitos granulares e estão 
essencialmente relacionados aos mecanismos de coagulação (Hose et al., 1990). Outros 
autores acreditam, no entanto, que os HHs sejam as principais células fagocíticas 
(Johansson et al., 2000) e que este tipo celular seja uma forma intermediária da 
linhagem de hemócitos granulares (van de Braak et al., 2002a). Por sua vez, os 
hemócitos granulares (HGPs e HGGs) são descritos como células de citoplasma mais 
abundante e ricos em grânulos de diversos tamanhos e conteúdos (Figs. 2B,C,E,F). 
Alguns autores apontam os HGPs como formas intermediárias e que, após 
amadurecimento, transformam-se em HGGs (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; 
Söderhäll e Cerenius, 1992; Gargioni e Barracco, 1998). Quanto à função, os hemócitos 
granulares parecem estar envolvidos principalmente na fagocitose de microrganismos, 
na formação de cápsulas e nódulos e também na produção de moléculas tóxicas e 
microbicidas (Hose et al., 1990; Gargioni e Barracco, 1998; van de Braak et al., 2002b). 
Em caranguejos e lagostins sugere-se que os HGPs atuem nos processos de 
encapsulação, os HGGs no armazenamento de moléculas imunoefetoras e os HHs na 
fagocitose de microrganismos (Johansson et al., 2000). 
 
 
1.2 Reações Imune-celulares: Fagocitose e Formação de Cápsulas e Nódulos 
 
Após a invasão por microrganismos, os hemócitos migram para os sítios de 
infecção gerando uma resposta inflamatória clássica. Nos sítios de infecção ocorre então 
a fagocitose dos microrganismos e/ou a formação de agregados celulares densos em 
torno das partículas invasoras, podendo culminar na liberação de diferentes moléculas 
imunoefetoras, capazes de neutralizar e degradar os patógenos. 
No processo de fagocitose, o agente estranho é englobado e interiorizado dentro de 
um fagossomo, que posteriormente se funde com as vesículas/grânulos presentes no 
citoplasma (Fig. 2G). Uma vez fundidas essas duas estruturas, um arsenal de compostos 
degradativos e microbicidas são liberados nos vacúolos fagocíticos, levando à 
neutralização/degradação das partículas endocitadas (Martin et al., 1996). Afagocitose 
de microrganismos já foi bem demonstrada em diferentes espécies de crustáceos (Hose 
et al., 1990; Martin et al., 1996; Gargioni e Barracco, 1998; Muñoz et al., 2002). 
Embora exista ainda controvérsia na literatura no que se refere aos tipos de hemócitos 
envolvidos nos processos de fagocitose em crustáceos, sabe-se que esse mecanismo 
 9 
extremamente importante constitui a primeira linha de defesa celular contra a invasão de 
microrganismos. 
 
 
Figura 2: Tipos de hemócitos (A-F) e reações celulares de defesa em crustáceos (G-J). A, D: 
hemócitos hialinos (HHs) de camarões observados ao microscópio de contraste de fase e 
eletrônico de transmissão, respectivamente; B, E: hemócitos com grânulos pequenos (HGPs); C, 
F: hemócitos com grânulos grandes (HGGs). G: fagocitose de uma levedura por um hemócito 
de Litopenaeus vannamei; H: encapsulamento in vitro do nematóide Panagrellus redivirus por 
hemócitos de Macrobrachium rosenbergii; I: encapsulamento in vitro de hifas do fungo 
Ganoderma sp por hemócitos de Farfantepenaeus paulensis, com forte reação de melanização; 
J: nódulo hemocítico no hepatopancreas de L. vannamei com agregados bacterianos no centro 
(reproduzido de Covarrubias, 2004). 
 
 
Quando a cavidade corpórea dos crustáceos é invadida por uma quantidade maciça 
de microrganismos ou por partículas/patógenos de grande tamanho cuja fagocitose não 
é possível, desencadeia-se a formação de nódulos e cápsulas celulares, respectivamente. 
 10 
A formação de cápsulas caracteriza-se pela agregação de várias camadas de hemócitos 
em volta de patógenos de grande tamanho, como hifas de fungos, nematódeos e 
determinadas formas de protozoários, promovendo o seu aprisionamento dos tecidos do 
hospedeiro e levando a sua posterior destruição (Fig. 2H,I). A formação de nódulos, por 
outro lado, ocorre em torno de uma grande quantidade de microrganismos invasores que 
também são aprisionados em agregados celulares (Fig. 2J), semelhantes às cápsulas. 
Esta reação evita sua disseminação e produção de septicemia. 
Nas regiões mais centrais dos nódulos é comum observar a fagocitose de 
microrganismos pelos hemócitos que estão em contato mais próximo dos 
microrganismos (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Söderhäll e Cerenius, 1992). Ambas 
as reações de encapsulamento e formação de nódulos levam não apenas ao 
aprisionamento de patógenos, como também limitam as respostas imunológicas apenas 
à região agredida. Esta resposta localizada, durante as reações imunológicas, ajuda a 
proteger os tecidos do hospedeiro dos danos causados pelas moléculas tóxicas e 
degradativas produzidas durante o processo inflamatório. Nas regiões mais centrais 
desses agregados de hemócitos, ocorre também a presença de uma pigmentação escura, 
ou melanização, resultante da liberação de compostos imunoefetores presentes nas 
células hemocíticas (Fig. 2I) que serão discutidos adiante (Cerenius e Söderhäll, 2004). 
O número de hemócitos livres na hemolinfa pode diminuir drasticamente durante 
uma infecção, como resultado de sua infiltração nos tecidos infectados e sua utilização 
na formação de nódulos e cápsulas. Deste modo, novos hemócitos precisam ser 
produzidos e liberados para a circulação a partir dos tecidos hematopoiéticos (Johansson 
et al., 2000; van de Braak et al., 2002a; Söderhäll et al., 2003; Jiravanichpaisal et al., 
2006). Esses tecidos são geralmente constituídos por lóbulos densos, situados na região 
dorsal e dorso-lateral do estômago e do intestino anterior (região epigástrica), e também 
na base dos maxilípedes, no caso de camarões peneídeos (van de Braak et al., 2002a) 
(Fig. 1). Os tecidos hematopoiéticos apresentam uma alta taxa de proliferação celular e 
são os responsáveis pela diferenciação e a maturação dos hemócitos que serão liberados 
na hemolinfa (van de Braak et al., 2002a; Söderhäll et al., 2003). 
A identificação de um ou mais progenitores celulares, assim como a distinção das 
linhagens hemocíticas produzidas é ainda controversa (van de Braak et al., 2002a; 
Söderhäll et al., 2003; Bachère et al., 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). Apesar de os 
tecidos hematopoiéticos serem os principais responsáveis pela produção de hemócitos, 
evidências da divisão dessas células na hemolinfa já foram relatadas nos camarões 
 11 
peneídeos Marsupenaeus japonicus (Sequeira et al., 1996) e Farfantepenaeus paulensis 
(Gargioni e Barracco, 1998), apesar da freqüência de divisão ser muito baixa. 
Outro órgão bastante irrigado e importante nas reações celulares é o órgão linfóide 
(Fig. 1). Esse órgão, ausente em muitas espécies de crustáceos decápodos, está 
localizado na parte anterior do hepatopâncreas de camarões e parece participar nos 
processos eliminação e depuração de agentes patogênicos, havendo muitas vezes a 
formação de corpos esferoidais durante as infecções. Não está claro se o processo de 
fagocitose ocorre principalmente nesse órgão ou se os hemócitos contendo 
microrganismos já fagocitados migram para esse local para realizar sua depuração (van 
de Braak et al., 2002b). 
 
 
1.3 Mecanismos Líticos e Degradativos 
 
1.3.1 Enzimas lisossomais e espécies intermediárias reativas de oxigênio (ROIs) e 
de nitrogênio (RNIs) 
 
Como já mencionado anteriormente, após a fagocitose dos microrganismos, estes 
são aprisionados em vacúolos fagocíticos intracelulares que se fundem com os grânulos 
lisossomais. Estes se caracterizam pelo seu pH ácido e pela presença de uma ampla 
variedade de enzimas hidrolíticas, capazes de matar e degradar a grande maioria dos 
micróbios invasores (Fig. 3). Por ocasião da fagocitose pode ainda ocorrer a liberação 
do conteúdo enzimático dos lisossomos para o plasma, a partir da degranulação dos 
hemócitos granulares. Dentre as enzimas liberadas, destaca-se a lisozima, capaz de 
romper polissacarídeos complexos ou peptidoglicanas (PGs) das paredes bacterianas, 
reação que será melhor discutida na próxima secção. 
Além da destruição dos microrganismos invasores pelas enzimas lisossomais, 
observa-se ainda, durante as reações imune-celulares, em especial na fagocitose, a 
produção e liberação de moléculas altamente tóxicas, que auxiliam na morte e 
degradação do agente invasor. Neste momento, ocorre um importante aumento no 
consumo intracelular de oxigênio, chamado de burst respiratório, que resulta na 
produção de uma variedade de espécies intermediárias altamente reativas de oxigênio 
(do inglês, ROIs) e de nitrogênio (do inglês, RNIs) (vide revisões de Anderson, 1996; 
Roch, 1999; Bogdan et al., 2000). As ROIs são oxidoradicais que possuem elétrons 
 12 
livres ou não pareados em sua camada orbital mais externa, o que lhes confere uma 
elevada reatividade com estruturas e compostos próximos, tais como membranas 
celulares, proteínas e ácidos nucléicos (DNA). Sendo assim, funcionam como agentes 
microbicidas potentes, destruindo ou inibindo o crescimento dos microrganismos 
invasores (Anderson, 1996; Bogdan et al., 2000). 
 
 
Figura 3: Mecanismos degradativos e microbicidas associados aos hemócitos de crustáceos 
durante o processo de fagocitose. ROI: espécies reativas de oxigênio; RNI: espécies reativas de 
nitrogênio; AMPs: peptídeos antimicrobianos. 
 
 
A produção desses vários radicais está ligada à ativação de um complexo 
enzimático denominado NADPH oxidase, localizado na membrana celular e na 
superfície dos grânulos lisossomais (Fig. 4). Este complexo é ativado por componentes 
microbianos, tais como os lipopolissacarídeos (LPS) e lipoproteínas de bactérias e �-
glicanas de fungos (Bogdan et al., 2000). A ativação da NADPH resulta na redução do 
oxigênio molecular a ânion superóxido (O2-) que pode dismutar-se espontaneamente ou 
através da enzima intracelular superóxido dismutase (SOD), em peróxido de hidrogênio 
(H2O2). O H2O2 é um composto igualmente tóxicoe, se não for decomposto pela 
catalase do peroxissomo, pode difundir-se e atingir o meio extracelular (Warner, 1994). 
O O2- pode ainda ser convertido em outros componentes citotóxicos, como no radical 
hidroxila (-OH) e ânions hidroxila (OH-) pela reação de Haber-Weiss ou, após 
 13 
dismutação em H2O2, ácido hipocloroso (HOCl), oxigênio singlet (1O2) e em cloraminas 
pela ação da mieloperoxidase (MOP) (Bogdan et al., 2000) (Fig. 4). 
Além das ROIs, ocorre ainda a produção intracelular de espécies reativas de 
nitrogênio (RNIs), como o NO e o peroxinitrito (ONOO-), compostos altamente 
citotóxicos e microbicidas (Kröncke et al., 1997). O peroxinitrito é resultante da reação 
entre o óxido nítrico (do inglês, NO) com o ânion superóxido (Anderson, 1996; Murphy 
et al., 1998) (Fig. 4). 
 
 
Figura 4: Produção de espécies reativas de oxigênio (ROIs) e nitrogênio (RNIs) pelos 
hemócitos de crustáceos durante o processo fagocítico e outras reações celulares. CAT: catalase; 
iNOS: óxido nítrico sintase induzível; SOD: superóxido dismutase. As espécies reativas 
tóxicas/microbicidas estão representadas em vermelho. 
 
 
É importante salientar que a produção destas moléculas altamente tóxicas, 
importantes na destruição de patógenos invasores, pode também provocar danos sérios 
aos tecidos do hospedeiro. Para evitar esta auto-agressão, o hospedeiro conta 
basicamente com três mecanismos de proteção ou defesas antioxidantes. Os primeiros 
dois mecanismos são endógenos e envolvem a presença de enzimas intracelulares, como 
as enzimas antioxidantes SOD, catalase e glutationa peroxidase, capazes de 
degradar/neutralizar as ROIs, ou as enzimas de reparo, capazes de reparar os danos 
provocados pelas ROIs no DNA, membranas e proteínas do hospedeiro (Warner, 1994). 
 14 
O terceiro mecanismo envolve a ação de compostos antioxidantes de origem exógena, 
como o ácido ascórbico (vitamina C), a glutationa e o �-tocoferol (vitamina E), que 
podem interagir diretamente com os radicais livres neutralizando-os (Warner, 1994). 
Convém ressaltar que os antioxidantes de origem exógena, assumem especial 
importância nos cultivos de camarões, uma vez que podem ser adicionados às dietas em 
doses apropriadas. 
A produção de ROIs in vitro por hemócitos imunoestimulados por componentes 
microbianos já foi relatada no caranguejo Carcinus maenas (Bell e Smith, 1993) e em 
várias espécies de peneídeos, como em P. monodon (Song e Hsieh, 1994; Sung et al., 
1996), L. vannamei (Muñoz et al., 2000), Macrobrachium rosenbergii (Sierra et al., 
2005), e em espécies nativas brasileiras, F. paulensis e Litopenaeus schmitti (Guertler, 
2007). 
A quantificação in vitro da produção de ânion superóxido pelos fagócitos é 
usualmente realizada através do método de redução do NBT (do inglês, nitro-blue-
tetrazolium) ou pela técnica da quimioluminescência. Esta avaliação permite determinar 
o grau de estresse oxidativo dos animais, em conseqüência a diferentes fatores de 
estresse como infecções, destacando-se como um valioso imunoparâmetro na 
determinação do estado imunológico dos camarões (Song e Hsieh, 1994; Muñoz et al., 
2000; Campa-Córdova et al., 2002a; b; Chang et al., 2003; Guertler, 2007). 
A produção de ânion superóxido vem sendo muito utilizada em camarões, para 
avaliar o efeito de substâncias consideradas imunoestimulantes, como as �-glicanas de 
fungos e os polissacarídeos sulfatados de algas, que podem ser adicionados à dieta ou 
via banhos de imersão (Campa-Córdova et al., 2002a;b; Chang et al., 2003), e que será 
discutida posteriornente. 
Por outro lado, a produção de RNIs tem origem na enzima óxido nítrico sintase 
(do inglês, NOS) presente no citoplasma de vários tecidos animais, incluindo as células 
do sistema imunológico. Nestas últimas, a NOS é induzida por situações de estresse 
(iNOS) e produz NO e em seguida o peroxinitrito (ONOO-), ambos compostos 
altamente tóxicos (Fig. 4). Nos outros tecidos, a NOS é expressa de forma constitutiva. 
Em vertebrados, estão bem documentadas as atividades antiviral, antibacteriana e 
antiparasitária das RNIs, que assim como as ROIs causam danos ao DNA, a várias 
enzimas e às membranas dos patógenos, direta ou indiretamente (vide revisão Kröncke 
et al., 1997; Chakravortty e Hensel, 2003). Infelizmente, existem ainda pouquíssimos 
relatos sobre a participação do NO e seus derivados nas respostas de defesa de 
 15 
crustáceos. Dentre estes, destacam-se os trabalhos de Jiang et al. (2006) que mostraram 
uma atividade da NOS nos hemócitos dos camarões F. chinensis e M. japonicus e de 
Yeh et al. (2006) no lagostim Procambarus clarkii. A atividade da NOS nestes animais 
é particularmente estimulada por LPS bacterianos, sugerindo que nos crustáceos, as 
RNIs devam atuar como agentes microbicidas. 
Cabe ainda ressaltar que a utilização da produção de RNIs como imunoparâmetro 
para avaliar o estado imunológico de camarões de cultivo é ainda uma ferramenta muito 
pouco utilizada, apesar de seu potencial promissor. Espera-se num futuro próximo, que 
haja um maior progresso nas técnicas de detecção de RNIs em camarões, para permitir 
sua utilização como imunoparâmetro e/ou como indicador de imunoestimulação. 
 
 
1.3.2 Proteínas e peptídeos antimicrobianos (AMPs) 
 
Proteínas e/ou peptídeos antimicrobianos (do inglês, antimicrobial 
proteins/peptides ou AMPs) são componentes essenciais do sistema imune inato, 
podendo apresentar uma atividade microbicida rápida e potente contra um amplo 
espectro de microrganismos. Nos crustáceos, que são desprovidos do sistema imune 
adaptativo dos vertebrados, a presença de AMPs na hemolinfa reveste-se da maior 
importância para o controle e prevenção de infecções por microrganismos. Essas 
moléculas estão amplamente distribuídas entre os diferentes reinos de seres vivos, tendo 
sido encontradas desde bactérias até mamíferos, incluindo protozoários, invertebrados e 
plantas. 
Os AMPs foram inicialmente identificados por Steiner et al. (1981) na hemolinfa 
da mariposa Hyalophora cecropia e desde então, mais de mil diferentes peptídeos têm 
sido isolados e caracterizados (Bulet et al., 2004). São moléculas relativamente 
pequenas, contendo menos de 150-200 resíduos de aminoácidos. A grande maioria dos 
AMPs destaca-se por suas características anfipáticas, apresentando uma região 
altamente catiônica e uma região hidrofóbica, o que facilita a sua interação e inserção 
nos fosfolipídios aniônicos presentes na face externa das membranas de muitos 
microrganismos (Bulet et al., 2004). 
De acordo com a sua composição aminoacídica e estrutura tridimensional, os 
AMPs foram classificados em quatro grandes classes: (1) peptídeos �-hélice linear 
anfipáticos, (2) peptídeos cíclicos ou cíclicos com extremidades abertas com uma ou 
 16 
mais pontes de cisteína, (3) peptídeos ricos em um tipo particular de aminoácido e (4) 
peptídeos gerados a partir da hidrólise de uma proteína precursora (vide revisão de 
Bulet et al., 2004). O local de síntese dessas moléculas é variável entre os diferentes 
organismos. Em muitas espécies de insetos, os AMPs são sintetizados nos corpos 
gordurosos no momento de uma infecção e secretados para a hemolinfa onde atuam de 
forma sistêmica (Hoffmann et al., 1996). Em contrapartida, em outros invertebrados 
como limulídeos, aranhas, moluscos e camarões, os AMPs são sintetizados 
constitutivamente nos hemócitos e armazenados em seus grânulos (vide revisão de 
Bachère et al., 2004). 
Os diferentes AMPs, caracterizados até o momento, possuem uma atividade 
inibitória rápida e potente contra um amplo espectro de microrganismos, incluindo 
bactérias, fungos filamentosos, leveduras e, em alguns casos também contra vírus e 
protozoários (Bachère et al., 2004; Reddy et al., 2004). 
O mecanismo de ação dos AMPs manifesta-se geralmente a nível da membrana do 
microrganismo,provocando sua desestabilização. Apresentam geralmente uma 
atividade detergente, através da interação eletrostática com os fosfolipídeos aniônicos 
da membrana, o que leva a um desequilíbrio de suas funções. Podem ainda inserir-se na 
bicamada lipídica, formando grandes poros, o que leva ao influxo descontrolado de 
solutos e extravasamento dos conteúdos citoplasmáticos, resultando na morte do 
microrganismo. Outras classes de AMPs podem ainda ser interiorizadas e interferir com 
diferentes vias metabólicas essenciais ao ciclo de vida do microrganismo (Bulet et al., 
2004; Toke, 2005). É importante assinalar que a indução de mecanismos de resistência 
contra essas moléculas pelos microrganismos é muito rara, uma vez que os 
componentes afetados (membranas) são essenciais para a sobrevivência desses 
microrganismos e que mutações nessas estruturas, a fim de escapar dos efeitos danosos 
dos AMPs são praticamente inviáveis. 
Somente em meados da década de 90 foram identificados os primeiros peptídeos 
com atividade microbicida em crustáceos. O primeiro AMP isolado e parcialmente 
caracterizado de um crustáceo foi um peptídeo catiônico de 6,5 kDa no caranguejo C. 
maenas. Este peptídeo, rico em resíduos de prolina, mostrou um amplo espectro de 
atividade, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Schnapp et al., 1996). 
Estes mesmos autores identificaram ainda outro AMP de 11,5 kDa com atividade 
restrita a bactérias Gram-positivas marinhas, que mais tarde foi caracterizado como uma 
 17 
molécula hidrofóbica rica em resíduos de cisteína e denominado de crustina/carcinina 
(Relf et al., 1999; Bartlett et al., 2002; Brockton et al., 2007). 
Em camarões peneídeos, três famílias de AMPs foram descritas e caracterizadas a 
partir de seus hemócitos: penedinas (Destoumieux et al., 1997), crustinas (Gross et al., 
2001; Bartlett et al., 2002) e os fatores anti-lipopolissacarídeos (ALFs) (Gross et al., 
2001; Supungul et al., 2002) (Tab. 1). 
 
Tabela 1: Famílias de peptídeos antimicrobianos (AMPs) constitutivamente expressos nos 
hemócitos de camarões peneídeos. 
 
 
AMP 
 
Atividade Antimicrobiana 
 
Estrutura 
 
Referências 
 
 
 
 
ALF 
 
 
 
bactérias Gram+ e Gram- 
fungos filamentosos 
 
 
 
Gross et al., 2001 
Supungul et al., 2002 
Supungul et al., 2004 
Somboonwiwat et al., 2005 
 
 
Crustina 
 
 
bactérias Gram+ e Gram- 
 
 
 
nd 
 
Gross et al., 2001 
Bartlett et al., 2002 
Zhang et al., 2007 
Amparyup et al., 2007a 
 
 
 
 
Peneidina 
 
 
 
bactérias Gram+ 
fungos filamentosos 
 
 
 
 
 
 
Destoumieux et al., 1997 
Destoumieux et al., 1999 
Gueguen et al., 2006 
nd = não determinada. 
 
 
As peneidinas são peptídeos antimicrobianos de 5 a 8 kDa, inicialmente isolados e 
caracterizados a partir da hemolinfa do camarão L. vannamei. São moléculas altamente 
catiônicas, compostas por uma região N-terminal rica em resíduos de prolina e uma 
região C-terminal contendo seis resíduos de cisteína ligados por três pontes dissulfídicas 
(Destoumieux et al., 1997). As peneidinas estão subdivididas em vários subgrupos 
(peneidinas 2 a 5), sendo que cada um contém várias isoformas distintas (Gueguen et 
 18 
al., 2006). Algumas isoformas possuem um motivo molecular de ligação à quitina em 
sua região C-terminal, que também é encontrado em algumas lectinas de plantas e em 
vários peptídeos antifúngicos (Destoumieux et al., 2000). Essa família de AMP é 
expressa de forma constitutiva nos hemócitos e apresenta uma atividade potente contra 
bactérias Gram-positivas e fungos filamentosos (Destoumieux et al., 1999; 2000). 
Interessantemente, a presença de peneidinas parece estar restrita apenas a camarões 
peneídeos. Vários subgrupos e isoformas de peneidinas foram identificados e 
caracterizados em diferentes espécies de peneídeos de diferentes oceanos (Gueguen et 
al., 2006) A expressão de peneidinas inicia-se nas primeiras fases do desenvolvimento 
ontogenético dos camarões (náuplios IV e V) (Muñoz et al., 2003; Jiravanichpaisal et 
al., 2007a). As peneidinas são expressas em grande quantidade, em comparação a outros 
AMPs produzidos nos hemócitos de peneídeos (cerca de 36% dos AMPs de P. monodon 
e 75% de L. vannamei e Litopenaeus setiferus), em especial as isoformas do subgrupo 3 
(PEN3) (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002). 
As crustinas são AMPs homólogos aos peptídeos de 11,5 kDa inicialmente 
isolados dos hemócitos granulares do caranguejo C. maenas (Relf et al., 1999), que 
posteriormente foram denominados carcininas (Brockton et al., 2007). As crustinas de 
camarões peneídeos incluem várias isoformas e são moléculas compostas por uma 
região N-terminal rica em resíduos de glicinas e por uma porção C-terminal contendo 
doze resíduos conservados de cisteína, onde se encontra um domínio WAP (do inglês, 
whey acidic protein), com possível função de inibição de proteases (Bartlett et al., 
2002). A atividade antimicrobiana das crustinas abrange essencialmente bactérias 
Gram-positivas (Zhang et al., 2007), contudo, uma ação contra vibrios marinhos (Gram-
negativos) foi também relatada muito recentemente para algumas isoformas (Amparyup 
et al., 2007a). 
Essa família de AMPs (crustinas/carcininas) é constitutivamente expressa em 
hemócitos e parece estar distribuída em diferentes grupos de crustáceos, como camarões 
peneídeos (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002; Rattanachai et al., 2004a; Zhang et 
al., 2007; Rosa et al., 2007a) e também em caranguejos, lagostas e lagostins (Relf et al., 
1999; Hauton et al., 2006; Christie et al., 2007; Jiravanichpaisal et al., 2007b). No 
lagostim Pacifastacus leniusculus e nos peneídeos L. setiferus e L. vannamei, as 
crustinas representam cerca de 3, 4 e 9% dos AMPs transcritos em seus hemócitos, 
respectivamente (Gross et al. 2001; Jiravanichpaisal et al., 2007b), em contraposição ao 
camarão P. monodon, onde esse AMP pode alcançar cerca de 26% dos AMPs expressos 
 19 
(Supungul et al., 2004). A expressão de crustinas, assim como a das peneidinas, inicia-
se nas fases iniciais do desenvolvimento dos camarões (náuplios IV), (Jiravanichpaisal 
et al., 2007a). 
Os fatores anti-lipopolissacarídeos (ALFs: do inglês, anti-lipopolysaccharide 
factors) são moléculas de 10 a 14 kDa, inicialmente isoladas e caracterizadas nos 
hemócitos granulares do limulídeo Limulus polyphemus (Tanaka et al., 1982). Em 
camarões peneídeos, os ALFs foram primeiramente detectados nas espécies L. setiferus 
(Gross et al., 2001) e P. monodon (Supungul et al., 2002) e mostraram conter dois 
resíduos conservados de cisteína engajados na formação de uma estrutura terciária em 
forma de grampo (�-hairpin) como nos ALFs de limulídeos. Essa estrutura concentra 
uma região altamente hidrofóbica com um domínio de ligação a LPS. Os ALFs incluem 
várias isoformas e são moléculas constitutivamente expressas nos hemócitos (cerca de 
26% dos transcritos de AMPs de P. monodon) com atividade antimicrobiana potente e 
de amplo espectro, sendo ativas contra bactérias Gram-positivas e negativas e fungos 
filamentosos e tendo ainda a propriedade de se ligar e neutralizar LPS (Somboonwiwat 
et al., 2005; Nagoshi et al., 2006). Ainda não é conhecido quando se dá o início da 
produção de ALFs durante o desenvolvimento ontogenético de camarões. Seqüências 
codificadoras para esses peptídeos têm sido amplamente detectadas nos hemócitos de 
diferentes espécies de peneídeos e de outros crustáceos (Gross et al., 2001; Supungul et 
al., 2004; Liu et al., 2005; Liu et al., 2006a; Nagoshi et al., 2006; Towle e Smith, 2006; 
Imjongjirak et al., 2007). 
Além destas três principais famílias de AMPs, outros grupos de moléculas 
antimicrobianas foram recentemente caracterizadas em crustáceos, a calinectina de 
Callinectessapidus (Khoo et al., 1999), as astacidinas de P. leniusculus (Lee et al., 
2003; Jiravanichpaisal et al., 2007b), a armadilidina de Armadillidium vulgare 
(Herbinière et al., 2005) e a cigonadina de Scylla serrata (Wang et al., 2007). 
Outras importantes moléculas com potente atividade antimicrobiana são também 
encontradas nos hemócitos de crustáceos. Dentre estas, destaca-se a lisozima, enzima 
mencionada anteriormente, que representa aproximadamente 4% das proteínas totais 
dos hemócitos de camarão (Sotelo-Mundo et al., 2003). As lisozimas possuem uma 
atividade lítica potente contra um amplo espectro de bactérias Gram-positivas e 
negativas, incluindo espécies de vibrios marinhos, devido à clivagem das 
peptidoglicanas das paredes bacterianas (Hikima et al., 2003; de-la-Re-Vega et al., 
2006). 
 20 
Em adição às famílias de AMPs constitutivamente produzidas nos hemócitos, 
outros grupos de moléculas antimicrobianas, como os peptídeos originados a partir da 
hidrólise de proteínas precursoras, foram também encontradas em camarões. Entre 
estas, destaca-se o peptídeo derivado da porção C-terminal da proteína plasmática 
hemocianina. Este fragmento, de características aniônicas, apresenta atividade restrita a 
fungos filamentosos e pode ainda funcionar como molécula imunosinalizadora 
(Destoumieux-Garzón et al., 2001). Peptídeos antifúngicos originados a partir da 
hidrólise da hemocianina foram também relatados no lagostim P. leniusculus (Lee et al., 
2003). Ainda em camarões peneídeos, foi demonstrado que peptídeos gerados a partir 
da clivagem de proteínas histônicas apresentavam atividade antimicrobiana contra 
bactérias Gram-positivas (Patat et al., 2004). 
Durante infecções causadas por diferentes tipos de patógenos, ocorre a modulação 
da expressão de diferentes famílias de AMPs, assim como de outras moléculas 
microbicidas importantes como a lisozima (Supungul et al., 2004; de Lorgeril et al., 
2005; Somboonwiwat et al., 2006). Em camarões desafiados com LPS ou com bactérias 
Gram-negativas do gênero Vibrio ocorre uma diminuição significativa dos níveis de 
expressão de peneidinas e crustinas nas primeiras horas após a injeção (3 e 6 h). Esse 
decréscimo é seguido pelo retorno aos níveis basais dessas moléculas após 12 h e por 
um aumento significativo nos níveis de expressão após 72 h da injeção, sugerindo 
interessantemente uma indução tardia destas moléculas durante as infecções 
(Destoumieux et al., 2000; Bachère et al., 2004; Okumura, 2007). Foi ainda mostrado, 
que nas primeiras horas da infecção, quando o nível de expressão de peneidinas diminui 
drasticamente, ocorre simultaneamente um aumento nas suas concentrações plasmáticas 
(Destoumieux et al., 2000). Acredita-se que esse aumento seja proveniente da liberação 
deste AMP pelos hemócitos que se encontram próximos aos sítios de infecção (Bachère 
et al., 2004). 
Por outro lado, a expressão de ALFs parece mostrar uma cinética contrária às 
outras duas famílias de AMPs de camarões. Em P. monodon, os níveis de expressão de 
ALFs aumentam significativamente nas primeiras horas após desafio com bactérias 
Gram-negativas (3 e 6 h) e retornam aos seus níveis basais cerca de 48 h após o início 
do processo inflamatório (Supungul et al., 2004; Somboonwiwat et al., 2006). 
A presença de diferentes famílias de AMPs em crustáceos, aliada à ocorrência de 
inúmeras isoformas dentro de um mesmo subgrupo, provavelmente com atividades 
antimicrobianas distintas, sugere uma atuação sinérgica destas diferentes moléculas 
 21 
imunoefetoras, que podem assim eliminar um amplo espectro de agentes patogênicos 
simultaneamente. A modulação da expressão das diferentes famílias de AMPs de 
camarões durante uma infecção assinala a grande importância dessas moléculas no 
combate a agentes patogênicos. Dessa forma, a quantificação da expressão dos genes 
codificantes para esses peptídeos pode ser uma importe ferramenta para avaliar as 
condições de saúde dos animais em cultivo e ainda um interessante parâmetro para a 
seleção de reprodutores que estejam conseqüentemente mais protegidos contra 
infecções. Esses compostos podem, ainda, representar uma nova geração de agentes 
terapêuticos, podendo encontrar aplicações não apenas em aqüicultura, como também 
em saúde humana e veterinária, no sentido de constituir uma alternativa biotecnológica 
para o problema do crescente número de linhagens de microrganismos resistentes aos 
antibióticos atualmente utilizados. 
 
 
1.4 Proteínas de Reconhecimento de Padrão (PRPs) 
 
O mecanismo de reconhecimento do não-próprio é certamente um dos 
mecanismos centrais no desencadeamento de uma resposta imunológica. Como dito 
anteriormente, os invertebrados, incluindo crustáceos, não produzem moléculas de 
reconhecimento altamente específicas como os anticorpos, nem contêm as células 
antígeno-específicas como os linfócitos dos vertebrados. No entanto, eles possuem 
moléculas capazes de diferenciar eficientemente o próprio do não-próprio e, assim, 
desencadear mecanismos que resultem na neutralização e/ou destruição dos 
microrganismos e parasitas invasores. 
As respostas de defesa nos crustáceos são desencadeadas a partir do contato com o 
patógeno, através de seus componentes, ou ainda com antígenos ambientais. Essas 
reações são iniciadas pelo reconhecimento do agente invasor por proteínas de 
reconhecimento-padrão, presentes no hospedeiro. O termo “proteínas de 
reconhecimento padrão” (do inglês, pattern-recognition proteins) ou PRPs faz alusão ao 
fato de que o sistema imunológico reconhece primariamente padrões moleculares 
presentes especificamente nos microrganismos ou PAMPs (do inglês, pathogen-
associated molecular patterns) (Medzhitov e Janeway, 1997; Janeway e Medzhitov, 
2002). As PRPs são moléculas produzidas pelo hospedeiro, secretadas para o plasma ou 
 22 
localizadas na superfície das células, principalmente as do sistema imune, que 
reconhecem e se ligam aos PAMPs. 
Em invertebrados, os principais PAMPs reconhecidos por PRPs são os 
lipopolissacarídeos (LPS) da superfície das bactérias Gram-negativas e as 
peptidoglicanas (PGs) da parede das Gram-positivas, as �-1,3-glicanas da parede de 
fungos e o dsRNA (do inglês, double-stranded RNA) produzido durante a replicação de 
vários vírus (Lee e Söderhäll, 2002). Estes PAMPs, característicos de microrganismos e 
ausentes no hospedeiro, são essenciais para a sobrevivência dos microrganismos, o que 
significa que estes “alvos” da imunidade inata não podem ser evolutivamente 
descartados pelos micróbios para se evadirem do reconhecimento pelo hospedeiro. 
Uma vez dentro do hospedeiro, os padrões moleculares do patógeno são 
reconhecidos e ligados às suas respectivas PRPs e, no caso dos crustáceos, iniciam a 
ativação principalmente dos hemócitos, desencadeando uma resposta imune-celular ou à 
produção/liberação de uma série de moléculas imunoefetoras/imunoreguladoras por 
degranulação ou ainda modular a expressão de genes imunológicos específicos (Fig. 5). 
Várias PRPs foram identificadas e caracterizadas na hemolinfa dos crustáceos, tais 
como a proteína que se liga a LPS ou LBP (do inglês, LPS-binding protein), as 
proteínas que se ligam a �-1,3-glicanas ou �GBP e GBP (do inglês, �-glucan binding 
proteins), a proteína que se liga a ambos LPS e �-1,3-glicanas ou LGBP, a proteína 
mas-like (do inglês, masquerade-like protein) que reconhecem vários microrganismos, 
além de várias classes de lectinas (vide revisão de Lee e Söderhäll, 2002). As diferentes 
PRPs identificadas em crustáceos até o momento estão apresentadas na Tabela 2. 
 
1.4.1 Proteínas que se ligam às �-1,3-glicanas: �GBP e GBP 
 
Proteínas que reconhecem exclusivamente �-glicanas têm a capacidade de se ligar 
a componentes da parede celular de fungos e foram caracterizadas em muitas espécies 
animais, sendo genericamente denominadasde �GBP e GBP. 
Nos crustáceos, existem pelo menos duas diferentes classes de proteínas que 
reconhecem e se ligam às �-glicanas. A primeira é representada por uma lipoproteína de 
alta densidade, a �GBP (Hall et al., 1995; Yépiz-Plascencia et al., 1998), sintetizada no 
hepatopâncreas (Cerenius et al., 1994; Romo-Figueroa et al., 2004) e constitutivamente 
presente na hemolinfa destes animais. A segunda classe é composta por pequenas 
proteínas, a GBP (Sritunyalucksana et al., 2002) e a LGBP (Lee et al., 2000; Roux et al., 
 23 
2002; Cheng et al. 2005; Du et al., 2007), sintetizadas pelos hemócitos e/ou 
hepatopâncreas dos crustáceos. 
 
 
Figura 5: Respostas imunológicas induzidas nos hemócitos após reconhecimento de patógenos, 
via PRPs plasmáticas ou celulares, e subseqüente ativação: (1) degranulação, com liberação de 
diferentes imunoefetores e imunoreguladores; (2) indução e/ou repressão de genes 
imunológicos; (3) ativação de respostas celulares como fagocitose e formação de nódulos e 
cápsulas. 
 
 
A �GBP já foi isolada e caracterizada em vários crustáceos, como nos lagostins P. 
leniusculus (Duvic e Soderhäll, 1990; Cerenius et al., 1994), Astacus astacus e P. clarkii 
(Duvic e Soderhäll, 1993), no caranguejo C. maenas (Thörrnqvist et al., 1994), e nos 
camarões Farfantepenaeus californiensis (Vargas-Albores et al., 1996) e L. vannamei 
(Yépiz-Plascencia et al., 1998; Jiménez-Vega et al., 2002; Romo-Figueroa et al., 2004). 
Bioquimicamente, as �GBPs são glicolipoproteínas monoméricas (95 a 112 kDa), 
contendo na sua estrutura oligossacarídeos ricos em manose e uma alta porcentagem de 
lipídeos (aproximadamente 50%), sendo os fosfolipídeos a classe lipídica predominante 
(Ruiz-Verdugo et al., 1997). Estas proteínas apresentam domínios semelhantes às 
glucanases bacterianas, porém sem atividade catalítica, além de conterem um motivo de 
adesão celular RGD (arginina-glicina-asparagina) que, provavelmente, se ligue aos 
 24 
hemócitos através de uma proteína transmembrana semelhante à integrina (vide revisão 
de Sritunyalucksana e Söderhäll, 2000). 
 
Tabela 2: Identificação e caracterização das principais proteínas de reconhecimento padrão em 
crustáceos até o momento. 
 
 
PRPs (PAMPs) 
 
 
Ano 
 
Status 
 
Tamanho Referências 
 
BGBP (�-glicanas) 
 
P. leniusculus 
A. .astacus 
P. clarkii 
C. maenas 
F. californiensis 
L. stylirostris 
L. vannamei 
L. vannamei 
F. californiensis 
L. vannamei 
P. leniusculus 
L. vannamei 
 
GBP (�-glicanas) 
 
P. monodon 
 
LGBP (LPS e �-glicanas) 
 
P. leniusculus 
L. stylirostris 
L. vannamei 
F. chinensis 
 
Lectinas (Açúcares) 
 
Várias espécies 
 
LBP (LPS) 
F. californiensis 
P. leniusculus 
L. schmitti 
P. monodon 
 
Mas-like (LPS e �-glicanas) 
 
P. leniusculus 
P. leniusculus 
P. monodom 
 
 
 
 
1990 
1993 
1993 
1994 
1996 
1997 
1997 
1998 
1998 
2002 
1994 
2004 
 
 
 
2002 
 
 
 
2000 
2002 
2005 
2007 
 
 
 
-- 
 
 
1993 
1993 
2002 
2006 
 
 
 
2000 
2001 
2007 
 
 
 
 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Clonada 
Clonada 
 
 
 
Purificada/clonada 
 
 
 
Purificada/clonada 
Clonada 
Clonada 
Clonada 
 
 
 
Purificadas/clonadas 
 
 
Purificada 
Purificada 
Purificada 
Purificada/clonada 
 
 
 
Clonada 
Purificada 
Clonada 
 
 
 
 
100kDa 
95-105kDa 
100kDa 
110kDa 
100kDa 
100kDa 
100kDa 
112kDa 
112kDa 
100kDa 
4679pb 
6379pb 
 
 
 
31 kDa/1314pb 
 
 
 
40 kDa/1650pb 
1352pb 
1272pb 
1253pb 
 
 
 
várias 
 
 
175kDa 
65-80kDa 
31+34kDa 
18kDa/709pb 
 
 
 
3277pb 
134+129kDa 
1572pb 
 
 
 
 
Duvic e Söderhäll 
Duvic e Söderhäll 
Duvic e Söderhäll 
Thörnqvist et al. 
Vargas-Albores et al. 
Vargas-Albores et al. 
Vargas-Albores et al. 
Yépiz-Plascencia et al. 
Yépiz-Plascencia et al. 
Jiménez-Vega et al. 
Cerenius et al 
Romeo-Figueroa et al. 
 
 
 
Sritunyalucksana et al. 
 
 
 
Lee et al. 
Roux et al. 
Cheng et al. 
Du et al 
 
 
 
Marques e Barracco 
(2000) 
 
Lee et al. 
Kopacék et al. 
Cominetti et al. 
Luo et al. 
 
 
 
Huang et al 
Lee e Söderhäll 
Amparyup et al. 
 
 
 
 25 
Lubzens et al. (1997) demonstraram que a �GBP do lagostim era idêntica a uma 
lipoproteína de alta densidade (LP1), presente na hemolinfa de machos e fêmeas do 
camarão Penaeus semisulcatus, e que estava envolvida no transporte de lipídeos para o 
ovário, no caso das fêmeas. Em seguida, foi demonstrado em camarões que a �GBP e a 
HDL (do inglês, high density lipoprotein) eram de fato a mesma proteína (Yépiz-
Plascencia et al., 1998). Desta forma, considera-se atualmente, que a �GBP dos 
crustáceos tenha uma dupla função: transportando lipídeos, como uma HDL e 
participando no sistema imune, como uma PRP. 
A interação da �GBP com as �-1,3-glicanas leva à formação de um complexo que 
se liga a receptor(es) de membrana nos hemócitos (Duvic e Söderhäll, 1990; 1992). 
Após esta ligação ocorre uma ativação celular, que resulta no espraiamento e 
degranulação parcial dos hemócitos granulares (Barracco et al., 1991). A exocitose do 
material granular promove a liberação das moléculas do sistema proPO, entre outras 
moléculas, havendo uma posterior ativação deste sistema pelas próprias �-1,3-glicanas 
(Cerenius et al., 1994; Vargas-Albores et al., 1996; Perazzolo e Barracco, 1997). Foi 
ainda demonstrado que a �GBP pode atuar como uma opsonina, aumentando in vitro a 
fagocitose de leveduras pelos hemócitos de lagostim (Cerenius et al., 1994). 
O complexo �GBP-�-1,3-glicanas do lagostim P. leniusculus pode se ligar na 
superfície de hemócitos granulares através do motivo RGD, o que sugere que esta 
ligação seja mediada por uma proteína semelhante à integrina, presente na membrana do 
hemócito, como mencionado anteriormente. Efetivamente, uma proteína da família das 
�-integrinas foi isolada dos hemócitos do lagostim e é uma candidata a receptor da 
�GBP (Holmblad et al., 1997). 
No entanto, um receptor de membrana para �GBP foi isolado dos hemócitos do 
lagostim por Duvic e Söderhäll (1992), sendo caracterizado como um heterodímero 
protéico (de 230 e 90 kDa). A interação com o hemócito só ocorre se a �GBP estiver 
complexada com as �-1,3-glicanas. Curiosamente, este receptor é o mesmo que se liga à 
proteína de adesão celular peroxinectina (discutida adiante) e é uma superóxido 
dismutase (SOD) contendo CuZn (Johansson et al., 1999a), não pertencendo portanto à 
família das integrinas. 
Uma outra proteína que se liga às �-glicanas, a GBP, foi recentemente clonada dos 
hemócitos do camarão P. monodon (Sritunyalucksana et al., 2002). Esta proteína (39,5 
kDa) é constitutivamente expressa nos hemócitos e se liga a �-1,3-glicanas presentes em 
 26 
curdlan e zymosan, mas não se liga aos LPS bacterianos, demonstrando sua 
especificidade no reconhecimento de fungos. 
 
 
1.4.2 Proteínas que se ligam a ambos, LPS e às �-1,3-glicanas: LGBP 
 
PRPs que se ligam a ambos LPS e �-1,3-glicanas (LGBPs) foram identificadas em 
crustáceos e insetos e apresentam um importante papel nas respostas imune inatas. As 
LGBPs dos crustáceos são proteínas pequenas (36-46 kDa) produzidas nos hemócitos 
(Lee et al., 2000; Cheng et al., 2005; Du et al., 2007) e/ou no hepatopâncreas destes 
animais (Roux et al., 2002; Cheng et al., 2005). 
A primeira LGBP isolada e caracterizada em crustáceos foi no lagostim P. 
leniusculus (Lee et al., 2000). Esta LGBP (36 kDa) está presente nos hemócitos,porém 
ausente no plasma, e apresenta a propriedade de se ligar tanto a LPS como a �-1,3-
glicanas, mas não com peptidoglicanas, mostrando sua especificidade para bactérias 
Gram-negativas e fungos. Uma vez ligada aos seus respectivos PAMPs, a LGBP, assim 
como a �GBP, leva a ativação do sistema proPO do lagostim. Em camarões peneídeos, 
existem três relatos sobre a clonagem do gene da LGBP: em Litopenaeus stylirostris 
(Roux et al., 2002), L. vannamei (Cheng et al., 2005) e F. chinensis (Du et al., 2007), 
com massas moleculares deduzidas de 40, 46 e 44 kDa, respectivamente (Tab. 2). 
Análises das seqüências aminoacídicas das LBGPs e GBPs de crustáceos 
revelaram que estas proteínas, a exemplo das �GBPs, exibem domínios semelhantes ao 
das �-glucanases bacterianas e também o domínio de adesão celular RGD, embora não 
possuam atividade enzimática (Lee et al., 2000; Roux et al., 2002; Cheng et al., 2005; 
Du et al., 2007). Acredita-se que estas proteínas tenham evoluído a partir de proteínas 
semelhantes à glucanases bacterianas e que, durante a evolução, tenham perdido a 
atividade catalítica. No entanto a propriedade de se ligar ao padrão molecular foi 
conservada, garantindo assim a sua participação no sistema imune destes animais (Lee 
et al., 2000). Interessantemente, foi demonstrado recentemente em L. vannamei que a 
região da LGBP requerida para a ligação ao LPS e a �-1,3-glicanas é justamente o sítio 
�-1,3-glucanase (Cheng et al. 2005). 
Assim como as outras PRPs acima descritas, as LGBPs participam também da 
ativação do sistema proPO do lagostim (Lee et al., 2000) e de L. stylirostris (Roux et al., 
 27 
2002). No entanto, a proteína do lagostim deve estar simultaneamente ligada aos dois 
PAMPs para que ocorra a completa ativação do sistema proPO (Lee et al., 2000). 
Análises da expressão diferencial da LGBP de L. stylirostris infectados com o 
WSSV demonstraram que ocorre uma super-expressão do gene em resposta à infecção 
viral, sugerindo que a LGBP seja uma proteína induzível de fase aguda, importante não 
somente para infecções bacterianas, mas também nas virais (Roux et al., 2002). 
Apesar de todas as proteínas, LGBP, GBP e �GBP, possuírem domínios de adesão 
celular RGD e sítios semelhantes às glucanases bacterianas (Cerenius et al., 1994; Lee 
et al., 2000; Sritunyalucksana et al., 2002; Romo-Figueroa et al., 2004), as duas 
primeiras diferem da �GBP por não serem lipoproteínas e por apresentarem um menor 
tamanho. Apesar disto, todas estas PRPs ativam o sistema proPO dos crustáceos após se 
ligarem às �-1,3-glicanas. 
 
 
1.4.3 Proteínas mas-like (do inglês, masquerade-like proteins) 
 
A mas-like é uma proteína de reconhecimento padrão multifuncional descrita em 
insetos e crustáceos. No lagostim P. leniusculus a mas-like se liga a bactérias Gram-
negativas e leveduras, e conseqüentemente aos LPS e �-1,3-glicanas como a LGBP. 
Após reconhecimento, esta PRP promove a ativação do sistema proPO, a adesão celular 
e o aumento da fagocitose (Huang et al., 2000; Lee e Söderhäll, 2001). A mas-like de P. 
leniusculus foi assim denominada devido a sua similaridade com a masquerade de 
Drosophila, expressa durante sua embriogênese, desenvolvimento larval e estágio de 
pupa (Murugasu-Qei et al., 1995). 
A mas-like existe sob forma inativa nos hemócitos do lagostim, como um 
heterodímero (134 e 129 kDa) e apresenta homologia com serino-proteases, porém sem 
atividade catalítica. A mas-like é exocitada dos hemócitos ainda sob forma inativa e 
sofre clivagem através de uma protease desconhecida ao se ligar no microrganismo, 
produzindo vários fragmentos peptídicos. Um deles promove a adesão celular no 
lagostim (Lee e Söderhäll, 2001). Contudo, a mas-like in vitro funciona como uma 
opsonina, estimulando a fagocitose pelos hemócitos do lagostim. 
Uma outra classe de mas-like, homóloga à serino-proteases, foi mais recentemente 
identificada também no lagostim P. leniusculus (Sricharoen et al., 2005) e no camarão 
P. monodon (Amparyup et al., 2007b). Estas proteínas hemocitárias têm uma massa 
 28 
molecular inferior (42 e 52 kDa, respectivamente) e apresentam homologia com os 
fatores de ativação da proPO (do inglês, FAPPs) de insetos, diferentemente da mas-like 
descrita anteriormente, que parece ser uma PRP. 
Além destas PRPs existem outras em invertebrados, destacando-se as proteínas 
que se ligam às peptidoglicanas (do inglês, PGRPs) que foram bem descritas em insetos 
(Kang et al., 1998; Ochiai e Ashida, 1999), mas que não foram ainda encontradas em 
crustáceos. Todavia, já foi demonstrado em P. monodon que as PGs podem induzir à 
ativação do sistema proPO, o que sugere a presença de uma PGRP em camarões 
(Sritunyalucksana et al., 1999a). 
 
 
1.4.4 Aglutininas e lectinas 
 
Lectinas são proteínas, sem atividade catalítica, com capacidade de ser ligar 
especificamente a carboidratos da superfície de diferentes células, incluindo 
microrganismos, causando sua aglutinação. Essa propriedade deriva do fato de estas 
moléculas serem pelos menos bivalentes, apresentando dois ou mais sítios de ligação. 
Devido a essa característica, acreditava-se inicialmente que as lectinas dos 
invertebrados fossem análogas funcionais das imunoglobulinas dos vertebrados, mas 
hoje se sabe que são estrutural e funcionalmente distintas (Marques e Barracco, 2000). 
Devido ao fato de as lectinas, tanto de vertebrados como de invertebrados, serem 
capazes de reconhecer e se ligar a açúcares específicos da superfície patógenos, estas 
moléculas são também definidas como PRPs. 
Além de atuarem como PRPs em invertebrados, as lectinas estão ainda envolvidas 
em vários processos biológicos, devido a sua interação com carboidratos, como a adesão 
celular, opsonização e formação de nódulos (vide revisão de Lee e Söderhäll, 2002), 
Algumas lectinas de invertebrados parecem estar ainda implicadas na ativação do 
sistema proPO de insetos (Yu et al., 1999) e possuir atividade antibacteriana em 
tunicados e limulídeos (Suzuki et al., 1990; Kawabata e Iwanaga, 1999). 
A maioria das lectinas envolvidas no sistema imune pertence à superfamília das 
lectinas do tipo-C, cuja atividade biológica é Ca2+-dependente e apresentam dois 
domínios para reconhecimento de carboidratos (do inglês, CRD) (Drickamer e Taylor, 
1993). 
 29 
As lectinas de crustáceos são muito menos conhecidas e investigadas do que as de 
outros artrópodes, como insetos e limulídeos. Nestes dois últimos grupos zoológicos, já 
foi descrita a ocorrência de lectinas múltiplas na hemolinfa, com especificidade para 
diferentes tipos de microrganismos. Algumas destas lectinas apresentam um amplo 
espectro de reconhecimento, ligando-se tanto a bactérias Gram-positivas como Gram-
negativas, enquanto outras são altamente específicas, reconhecendo configurações 
químicas de açúcares da superfície de um determinado microrganismo (vide revisão de 
Marques e Barracco, 2000). 
Nos crustáceos, as lectinas são proteínas constitutivas, plasmáticas, sintetizadas 
geralmente pelo hepatopâncreas (Gross et al., 2001; Luo et al., 2006) e que reconhecem 
principalmente açúcares N-acetilados, em especial derivados do ácido siálico e 
sialoglicoconjugados (vide revisão de Marques e Barracco, 2000). 
A ocorrência de lectinas múltiplas foi descrita inicialmente na hemolinfa da 
lagosta Homarus americanus, há cerca de 30 anos (Hall e Rowlands, 1974) e desde 
então, várias outras lectinas foram identificadas e isoladas em diferentes crustáceos. No 
entanto, a maioria dos trabalhos restringe-se a caracterizar uma única lectina, havendo 
muito poucos relatos de lectinas múltiplas na hemolinfa de outros crustáceos (vide 
revisão de Marques e Barracco, 2000). 
Apesar de os esforços realizados no isolamento e caracterização de lectinas em 
diferentes crustáceos, pouco progresso tem sido feito quanto a seu papel imunológico.Dentre os poucos exemplo, podemos citar as lectinas de P. monodon (monodina e 
PmLec) (Ratanapo e Chulavatnanol, 1992; Luo et al., 2006), F. californiensis (Vargas-
Albores et al., 1993), Parapenaeus longirostris (Fragkiadakis e Stratakis, 1995) e M. 
rosenbergii (Vázquez et al., 1997), todas capazes de aglutinar diferentes espécies de 
bactérias, sendo algumas capazes de aglutinar espécies patogênicas do gênero Vibrio. 
No entanto, a maioria destes estudos restringe-se a analisar a capacidade destas 
moléculas em aglutinar diferentes tipos de bactérias, mas pouco se sabe sobre sua 
atuação como opsonina ou em outros aspectos das respostas imunológicas. 
Recentemente, uma lectina do tipo-C (31.8 kDa), denominada Fclectin, foi 
identificada nos hemócitos do camarão F. chinensis, (Liu et al., 2007), diferentemente 
da maioria das lectinas que é sintetizada no hepatopâncreas. Interessantemente, a 
Fclectin é super-expressa após 3 e 12 h de inoculação com WSSV ou bactérias Gram-
negativas, respectivamente, sugerindo uma cinética de expressão diferente segundo o 
agente infeccioso (Liu et al., 2007). 
 30 
Um grupo de aglutininas que se liga a LPS bacterianos do tipo LBP foi isolada e 
caracterizada no lagostim P. leniusculus (Kopácek et al., 1993a), nos camarões F. 
californiensis (Vargas-Albores et al., 1993), L. schmitti (Cominetti et al., 2002) e P. 
monodon (Luo et al., 2006) (Tab. 2). Todas elas se ligam a LPS, sugerindo que tenham 
um importante papel no controle de infecções causadas por bactérias Gram-negativas 
como as do gênero Vibrio, que podem ser patogênicas para camarões. É importante 
salientar que as LBPs se diferenciam funcionalmente de outras PRPs, como as LGBPs 
que também reconhecem LPS, porque não apenas atuam no reconhecimento de PAMPs, 
mas também causam a aglutinação das células portadoras de LPS, o que não ocorre com 
as LGBPs. 
A LBP de P. leniusculus é uma proteína plasmática formada por várias 
subunidades (de 65 a 80 kDa) e que aglutina fortemente várias cepas bacterianas Gram-
negativas (Escherichia coli, Salmonella spp, Serratia marcescens) e eritrócitos de 
vertebrados expondo ácido siálico (Kopácek et al., 1993a). Já a LBP do camarão F. 
californiensis é uma aglutinina plasmática de maior tamanho (175 kDa), que reconhece 
e aglutina diferentes cepas de Vibrio e também eritrócitos de vários vertebrados 
(Vargas-Albores et al., 1993). Para ambas LBPs a atividade hemaglutinante é 
especificamente inibida por LPS bacterianos. 
Muito recentemente, uma LBP foi purificada e caracterizada da hemolinfa de P. 
monodon e seu gene clonado (Luo et al., 2006). Esta proteína foi identificada como 
sendo uma lectina tipo-C (PmLec, 18 kDa), apresentando uma acentuada atividade 
aglutinante contra várias bactérias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, 
Aeromonas hydrophila e Vibrio alginolyticus), além de forte capacidade opsonizante 
durante a fagocitose de E. coli. Interessante observar que, a PmLec não apresenta 
atividade antibacteriana, nem capacidade de induzir o sistema proPO (Luo et al., 2006). 
 
 
1.4.5 Receptores Toll e TLR (do inglês Toll-like receptor) 
 
As proteínas ou receptores Toll foram inicialmente identificados na mosca da fruta 
Drosophila melanogaster e revelaram ter importante função na determinação do eixo 
dorso-ventral no desenvolvimento embrionário deste inseto (Anderson e 
Nussleinvolhard, 1984). Além de seu importante papel na embriogênese, os receptores 
Toll mostraram ainda estar crucialmente implicados nas respostas imunológicas de D. 
 31 
melanogaster (Lemaitre et al., 1996). Mais tarde, proteínas semelhantes aos receptores 
Toll de D. melanogaster foram também identificadas em vertebrados e foram 
denominadas de TLRs (do inglês, Toll-like receptors). Os TLRs estão implicados no 
sistema imune inato de vertebrados e atuam de forma essencial no reconhecimento de 
PAMPs. Os receptores Toll e TLRs são glicoproteínas transmembrana caracterizadas 
por apresentar um domínio extracelular rico em resíduos de leucina ou LRR (do inglês, 
leucine-rich repeat) e por um domínio de sinalização citoplasmático homólogo ao do 
receptor de interleucina 1, denominado de TIR (do inglês, Toll/interleucin-1 receptor 
domain). 
Os TLRs de mamíferos possuem regiões de ligação a PAMPs em seu domínio 
LRR, e após ativação, induzem a expressão de citocinas inflamatórias importantes como 
os interferons (vide secção 1.7.1) e outras moléculas ativadoras da resposta imune 
adaptativa (Akira et al., 2006). Em mamíferos, já foram identificados doze TLRs 
distintos, todos implicados no reconhecimento direto de PAMPs, como LPS (TLR4), 
lipoproteínas (TLR2), dsRNA (TLR3), flagelina (TLR5), DNA CpG (TLR9) e vários 
componentes virais (TLR7) (vide revisão de Akira et al., 2006). 
Em D. melanogaster, diferentes receptores Toll foram também identificados, 
como o dToll, o d18W e os dToll3 a dToll9. Entretanto, apenas dToll e dToll5 parecem 
estar relacionados com a ativação de respostas imunológicas (Tauszig et al., 2000). 
Diferentemente dos TLRs de mamíferos, os dToll e dToll5 não possuem regiões de 
ligação a PAMPs no domínio LRR como nos mamíferos, indicando que estas proteínas 
de D. melanogaster não funcionam diretamente como proteínas de reconhecimento 
padrão ou PRPs. No entanto, estes Tolls de D. melanogaster são ativados indiretamente, 
por proteínas PRPs, no caso as PGRPs circulantes na hemolinfa, que reconhecem PGs 
de bactérias Gram-positivas e componentes da superfície de fungos. Após reconhecerem 
seus PAMPs, as PGRPs da hemolinfa iniciam uma cascata proteolítica que culmina com 
a clivagem de uma proteína circulante denominada Spätzle. Uma vez clivada, a Spätzle 
liga-se diretamente ao receptor Toll, que inicia uma cascata de transdução de sinal, que 
culmina com a transcrição do peptídeo antimicrobiano drosomicina (Lemaitre et al., 
1996). Além de atuar nas respostas contra bactérias Gram-positivas e fungos, a via Toll 
parece ainda ser requerida para inibir a replicação e propagação do vírus DXV 
(Drosophila X Virus) (Zambon et al., 2005). 
No que diz respeito a camarões, apenas muito recentemente foram identificados 
receptores tipo Toll nas células dos peneídeos L. vannamei (lToll) (Yang et al., 2007) e 
 32 
P. monodon (PmToll) (Arts et al., 2007). Esses receptores presentes em peneídeos 
apresentam uma alta homologia com os Tolls de D. melanogaster (dToll e dToll5), do 
mosquito Anopheles gambiae (AeToll), da abelha Apis mellifera (AmToll) e do 
limulídeo Tachypleus tridentatus (tToll). Assim como as demais seqüências de Toll e 
TLRs, os Toll de camarões também possuem domínios LRR e TIR conservados. 
Contudo, os Tolls de camarões, identificados até o momento, não possuem regiões de 
ligação a PAMPs no domínio LRR, como os TLRs de vertebrados, assemelhando-se 
mais uma vez aos Toll conhecidos em outros artrópodes. 
As proteínas Toll de camarões parecem ser expressas constitutivamente em 
diferentes tecidos e sua expressão parece não ser afetada durante as infecções virais 
(Arts et al., 2007). A similaridade desses receptores de camarões com os Toll de insetos, 
que induzem a transcrição do AMP drosomicina (dToll e AeToll), leva a suposição que 
essas proteínas possam estar também implicadas na imunidade inata de camarões 
peneídeos, inclusive em suas respostas antivirais como em Drosophila. Contudo, nada 
ainda se conhece sobre a atividade funcional dos recém identificados Tolls de 
crustáceos. Num futuro próximo, espera-se melhor compreender seu envolvimento no 
sistema imune inato de camarões e seu potencial como imunomarcador por ocasião de 
infecções. 
 
 
1.5 Cascata Proteolítica: Sistema de Ativação da Pró-fenoloxidase (proPO) 
 
Como dito anteriormente, a formação de nódulos e cápsulas hemocíticas em 
crustáceos é freqüentemente acompanhada por uma reação de melanização na regiãomais central. A melanização é também observada durante a cicatrização de ferimentos, 
onde a coagulação da hemolinfa e a migração dos hemócitos ao local da injúria 
permitem a formação de um tampão celular até que uma nova cutícula seja reconstituída 
(Fig. 6). 
A biossíntese de melanina nos artrópodes é um processo complexo envolvendo 
uma série de reações químicas em cascata, denominadas de sistema de ativação da pró-
fenoloxidase ou sistema proPO. Este sistema é composto por vários zimógenos de 
proteases, pela pró-fenoloxidase, além de PRPs associadas (Lee e Söderhäll, 2002) (Fig. 
6). O sistema proPO é reconhecido como uma das principais respostas imunoefetoras de 
crustáceos, desencadeada por componentes da superfície de microrganismos, como os 
 33 
LPS de bactérias Gram-negativas e �-1,3-glicanas de fungos (vide revisão Cerenius e 
Söderhäll, 2004). 
 
 
Figura 6: Liberação de diferentes efetores imunológicos e moléculas imunoreguladoras, após 
ativação dos hemócitos por patógenos. Ainda não está confirmado se a TGase é liberada por 
hemócitos granulares ou hialinos. 
 
 
Durante as infecções, estes compostos se ligam a receptores dos hemócitos 
granulares diretamente ou através de PRPs plasmáticas e induzem uma degranulação ou 
exocitose regulada, com liberação de várias moléculas imunoefetoras, entre as quais as 
moléculas do sistema proPO. Uma vez liberadas, ocorre a ativação deste sistema pelos 
próprios componentes dos microrganismos presentes na hemocele . 
A presença do sistema proPO e de algumas moléculas associadas nos grânulos dos 
hemócitos granulares (HGPs e HGGs) foi especialmente estudada no lagostim P. 
leniusculus (vide revisão de Cerenius e Söderhäll, 2004) e também em vários camarões, 
como por exemplo em P. monodon (Kondo et al., 1992), F. californiensis (Hernández-
López et al., 1996), L. stylirostris (Le Moullac et al., 1997) e F. paulensis o (Perazzolo e 
Barracco, 1997). 
 34 
Análises moleculares e bioquímicas da proPO de crustáceos, revelaram que esta 
proteína (76-78 kDa) apresenta similaridade com a hemocianina, uma vez que também 
apresenta sítios de ligação para o cobre (vide revisão de Sritunyalucksana e Söderhäll, 
2000). Além disso, as proPOs de lagostim e camarão apresentam uma região tiol-éster 
(GCGWPRHM), como as proteínas C3 e C4 do sistema complemento de vertebrados e 
as �2-macroglobulinas (Aspán et al., 1995; Sritunyalucksana et al., 1999b; Lai et al., 
2005; Liu et al., 2006b). 
A ativação da forma inativa ou proPO para a enzima ativa ou PO ocorre pela ação 
de serino-proteases, denominadas enzimas ativadoras da proPO (do inglês, proPO-
activating enzymes ou PPAEs), iniciando uma cascata proteolítica cujo produto final é a 
melanina (Fig. 7). Em crustáceos, uma PPAE batizada por ppA foi purificada (Aspán e 
Söderhäll, 1991) e posteriormente clonada (Wang et al., 2001) dos hemócitos do 
lagostim P. leniusculus. A ppA é sintetizada e mantida como um zimógeno (pró-ppA) 
nos hemócitos, sendo ativada após sua exocitose, em decorrência de uma injúria ou 
infecção microbiana. Sua ativação se dá por clivagem proteolítica, por uma protease 
ainda desconhecida (vide revisão de Cerenius e Söderhäll, 2004). 
A forma PO é uma oxidoredutase que catalisa duas reações sucessivas: a primeira, 
de hidroxilação de um monofenol a �-difenol (atividade monofenoloxidásica) e, a 
segunda, de oxidação do �-difenol a �-quinona (atividade difenoloxidásica) (Fig.7). A 
produção de o-quinonas resulta na síntese de melanina através de uma cascata de 
reações químicas intermediárias, sendo a maioria espontânea, não mediada por enzimas 
(Fig.7). A produção de quinonas leva também à esclerotização da cutícula dos 
camarões, fenômeno essencial nos períodos de muda (Söderhäll e Cerenius, 1998). 
Em relação ao papel imunológico do sistema proPO, sabe-se que esta via gera 
transitoriamente moléculas altamente tóxicas, como as quinonas, hemiquinonas (Fig. 7) 
e radicais livres como as próprias ROIs, uma vez que ocorre consumo de oxigênio 
molecular e que leva a destruição dos patógenos invasores. O pigmento escuro e 
insolúvel melanina parece ter uma atividade fungistática (Cerenius e Söderhäll, 2004), 
podendo ainda funcionar como scavenger de radicais livres (Nappi e Vass, 1993; Nappi 
e Ottaviani, 2000), minimizando assim os efeitos deletérios destas moléculas altamente 
tóxicas para o organismo do hospedeiro. Contudo, deve ser salientado que a melanina, 
per se, não é a molécula imunoefetora mais importante durante a ativação do sistema 
proPO, sendo os compostos citotóxicos intermediários os mais efetivos (Nappi e Vass, 
 35 
1993). Assim sendo, a melanização representa, mais especificamente, o final de um 
potente processo imunoefetor. 
 
 
 
Figura 7: Reação de melanização em crustáceos. A: Ferimento melanizado (seta) no camarão 
Farfantepenaeus paulensis; B: Principais passos da biossíntese de melanina desencadeados pela 
enzima fenoloxidase (PO) em presença de substratos fenólicos (adaptado de Nappi e Vass, 
1993). 
 
 
Cabe ainda ressaltar que, concomitantemente à liberação dos componentes do 
sistema proPO, várias outras moléculas são também exocitadas pelos hemócitos 
imunoestimulados (Fig. 6). Uma delas é a peroxinectina (76 kDa) que é uma peroxidase, 
homóloga à mieloperoxidase humana, e que atua tanto na adesão celular, possuindo 
 36 
ainda atividade peroxidásica. Esta proteína ganha sua atividade biológica 
concomitantemente à ativação do sistema proPO no plasma e promove o 
encapsulamento de parasitas invasores de grande tamanho, após se ligar ao receptor 
SOD da membrana dos hemócitos, mencionado anteriormente (vide revisão de 
Johansson, 1999b). Por outro lado, a peroxinectina induz ainda uma forte degranulação 
dos hemócitos, levando à liberação de mais compostos imunoefetores e 
conseqüentemente a uma acentuada amplificação da resposta imunológica do 
hospedeiro. Outras moléculas são ainda exocitadas durante a ativação hemocítica, como 
a enzima transglutaminase (TGase) que induz o processo de coagulação, diferentes 
inibidores de proteases, PRPs como a mas-like, AMPs e outras moléculas 
imunoefetoras/imunorereguladoras (vide revisões de Lee e Söderhäll, 2002; Cerenius e 
Söderhäll, 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). 
A ativação do sistema proPO deve, portanto, ser estritamente regulada para evitar 
uma ativação indesejada ou generalizada no organismo do crustáceo. Para isso, os 
animais possuem inibidores de proteases no plasma e/ou hemócitos. Dentre eles, 
podemos destacar a pacifastina (Liang et al., 1997), os inibidores da família Kazal 
(Johansson et al., 1994; Jiménez-Vega e Vargas-Albores, 2005; Somprasong et al., 
2006), a serpina (Liang e Söderhäll, 1995) e a �2-macroglobulina (Hergenhahn et al., 
1988). 
O inibidor mais eficiente da ppA do lagostim é a pacifastina, uma proteína 
plasmática heterodimérica (155-kDa), formada por uma cadeia leve com nove 
subunidades (inibidoras de protease) e uma cadeia pesada contendo três transferrinas 
(Liang et al., 1997). Esta molécula deu origem a uma nova classe de inibidores de 
serino-proteases denominada “pacisfatina-like”, que foi recentemente identificada 
também regulando o sistema proPO de insetos (Simonet et al., 2002). 
Outro importante inibidor de proteases em crustáceos é a proteína plasmática �2-
macroglobulina (�2M), que é constitutivamente sintetizada pelos hemócitos destes 
animais (Gross et al., 2001; Rattanachai et al., 2004b). A α2M é um inibidor de 
proteases de amplo espectro (serino, aspartato, cisteína e metalo-proteases), que inibe 
tanto as proteases do próprio hospedeiro, como aquelas produzidas pelo patógeno 
durante o processo infeccioso (vide revisões de Armstrong e Quigley, 1999; Armstrong, 
2006). Uma característica fundamental destes inibidores é a presença na molécula de 
uma região tiol-éster,