Unidade 1_LABORATORIO AV1

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ANATOMIA VEGETAL: Microscopia
Microscópio		Ferramenta indispensável
Função: Tornar visível ao olho humano estruturas invisíveis à vista desarmada	 0,1mm = 100µm
				fotônicos
Tipos
				eletrônicos
Microscopia
Tipos de microscópios:
Ópticos	(equipamento usado na disciplina)
Aumentam até 1000 vezes
Ilumina o objeto de estudo com feixe de luz visível ou UV
Eletrônicos
Aumentam mais de 300.000 vezes
Iluminam o objeto de estudo com feixe de elétrons
Microscopia
O microscópio tem componentes que podem ser divididos em sistemas, de acordo com as suas funções
				Mecânico
Sistemas		Iluminação
				Magnificação
Microscopia
Sistema mecânico : Mantem os elementos óticos e a amostra em posição para observação. Constituintes do sistema mecânico: base ou pé; braço; tubo ou canhão; revólver; mesa ou platina; charriot, parafusos macro e micrométrico e parafuso de regulagem do condensador.
Sistema de iluminação: direciona o feixe de luz desde a fonte até a ocular; compreende as seguintes partes: fonte luminosa; diafragmas; condensador e filtros.
Sistema de magnificação: Amplifica a amostra; é composto por lentes oculares e objetivas.
Componentes de um microscópio óptico
Microscopia
Resolução: capacidade de formar imagens distintas (separadas) de dois pontos situados muito próximos um do outro. Olho humano =100 µm ou 0,1 mm
Limite de resolução: menor distância entre dois pontos, de modo que ainda apareçam individualizados na imagem formada pelo sistema óptico utilizado.
O aumento total conferido pelo MO é o produto do aumento conferido pela lente objetiva e pela lente ocular (objetiva x ocular).
Microscopia
Unidades de medida usadas em microscopia
UNIDADE DE MEDIDA
SÍMBOLO
VALOR
Micrômetro
µm
0,001mm (milésima parte do mm)
Nanômetro
nm
0,001 µm (milésima parte do µm)
Ângstrom
Å
0,0000001mm (10-7mm)
Microscopia
Cálculo do aumento das amostras observadas
OCULAR
OBJETIVA
AUMENTO
DIÂMETRO DO CAMPO
10x
10x (pequeno aumento)
100x
1.500 µm
10x
40x (grande aumento a seco)
400x
375 µm
10x
100x (imersão em óleo)
1000x
150µm
Microscopia
Procedimentos básicos para os cuidados com o microscópio devem ser seguidos, para que o equipamento tenha longa durabilidade e mantenha a maior precisão possível.
Manter o microscópio longe de umidade.
Evitar transportar de um local a outro; se for necessário, segurar firmemente pelo pé e braço.
Manter as lentes objetivas e oculares limpas e o aparelho coberto, quando não for usado.
Microscopia
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Conjunto de procedimentos técnicos para obtenção de material anatômico para análise por microscopia. 
Etapas:
coleta e preparo do material
Fixação e conservação
Técnica de diafanização (arquitetura)
Técnicas de dissociação
Técnicas de corte e coloração
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Material necessário no laboratório
Placas de petri, vidro de relógio
Pinça, pincel
Suporte (isopor ou medula)
Lâmina de barbear ou de bisturi
Lâmina, lamínula e placa de vidro
Vidro de relógio
Placas de petri
lâminas
pinça
Placa de vidro
lamínula
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Material necessário no laboratório e onde acondicioná-lo
Hipoclorito 20% – 50%
Ácido acético 1%
Água destilada
Corante			 ou 
Mistura de Jeffrey (dissociação ou maceração)
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Coleta e preparo do material
Todos os órgãos podem ser coletados
Preparo imediato após coleta
Amostras pequenas	 fixação direta
Amostras grandes		 fragmentação
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Coleta e preparo do material
1- Fixação
paralisa os processos vitais e de autólise; estabiliza os processos celulares. As amostras devem ser fixadas assim que coletadas.
Principais fixadores: FAA, CRAFT III, Navaschin, Álcool 70%
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Coleta e preparo do material
Fixadores 
FAA 50 (ou 70 ) 
formalina (formaldeido 37%) 5ml 
ácido acético glacial 5ml 
álcool etílico a 50% (ou 70%) 90ml
Álcool etílico a 70% 
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Coleta e preparo do material
Fixadores 
Nawaschin 
ácido crômico a 1% 75mL 
ácido acético glacial 5mL 
formalina 20mL
Craft III 
ácido crômico a 1% 30mL 
ácido acético a 10% 20mL 
formalina 10mL
água destilada 40mL
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Coleta e preparo do material
2- Conservação
Mantém as amostras preservadas no estado de fixação por tempo indeterminado
Principal conservante: Álcool etílico 70%
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Coleta e preparo do material
3- Amolecimento (apenas para partes duras: raízes, caules)
Degradação de substâncias que dão rigidez à amostra.
Principal amolecedor:
Glicerina: Álcool etílico 70% - 1:1 (v:v)
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
4- Cortes ou secções anatômicas
 
	Características:
Ultrafinos (3 a 10 µm) depende da técnica
Retos
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
4- Cortes ou secções anatômicas
 
	Técnicas de cortes:
À mão livre (menos preciso: 30-90 µm) 
Mais rápido, simples e barato
Material fresco ou fixado
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
4- Cortes ou secções anatômicas
 
	Técnicas de cortes:
Microtomia (ultrafino e preciso)
Demorado, complexo e caro
Material emblocado ou em suporte
Cortes de amostras vegetais: FOLHA
Tipos de cortes:
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Corte paradérmico
Cortes de amostras vegetais: FOLHA
Tipos de cortes:
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Corte transversal
Corte longitudinal
Cortes de amostras vegetais: FOLHA
Regiões a serem analisadas anatomicamente: pecíolo, base, ápice, bordo, nervura mediana e região intercostal ou internervuras.
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
ápice
Região intercostal
bordo
Nervura mediana
base
pecíolo
Cortes de amostras vegetais: amostras cilíndricas (caule e raiz)
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Cortes de amostras vegetais: amostras cilíndricas (caule e raiz)
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
5- Clarificação ou Diafanização
Retirada de pigmentos e conteúdos celulares
Torna a amostra transparente
Preparo para receber corante
 Hipoclorito de sódio (5 – 50%) até ficar transparente
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
6- Coloração
Evidencia forma e tamanho das células (paredes)
Identificação da natureza das paredes
Principais corantes
Safranina hidroalcoólica (0,5% ou 1,0%)
Fucsina
Azul de toluidina (0,03%)
Azul de astra (10%)
Corante duplo: safranina+azul de astra
		 safrablau
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
7-	Técnicas para obtenção de amostras anatômicas
Arquitetura foliar
Dissociação de epiderme
Cortes transversais e longitudinais
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
ARQUITETURA FOLIAR
Procedimentos:
 1) Clarificação ou Diafanização
 Técnica usual: Stritmatter (1973) Ebulição em álcool etílico absoluto, ebulição em álcool etílico absoluto + hipoclorito de sódio (1:1), após lavagem, hipoclorito de sódio até ficar transparente.
 Alternativa: Hipoclorito de sódio
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
ARQUITETURA FOLIAR
Procedimentos:
 2) Coloração
 Após ficar transparente, lavar abundantemente com água destilada.
Lavar em álcool 50%
Corar em safranina hidroalcoólica 0,5%
Retirar o excesso de corante em álcool 70%
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
ARQUITETURA FOLIAR
Procedimentos:
 3) Montagem da lâmina permanente
Desidratar em série alcoólica (70 – 100%)
Série álcool – xilol (3:1; 1:1; 1:3 – xilol puro)
Montagem em bálsamo do Canadá
Técnicas cito-histológicas:Microtécnica Vegetal
DISSOCIAÇÃO DE EPIDERME
Procedimentos:
 1) Obtenção da epiderme (fragmentos < 1 cm²)
Cortes paradérmicos
					Mistura de Jeffrey
Dissociação química 	
					Ácido nítrico 5% - 10%
			fita adesiva transparente (durex®)
Impressão
			cola transparente (superbonder®)
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
DISSOCIAÇÃO DE EPIDERME
 2) Clarificação e Coloração
Cortes paradérmicos – clarificar/diafanizar	
Dissociação química – material já clarificado
Lavar em álcool 50%
Coloração com safranina hidroalcoólica 0,5% por ±10 minutos
Lavar em álcool 70% até parar de sair corante
Impressão – fita ou cola diretamente na lâmina
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
DISSOCIAÇÃO DE EPIDERME
 3) Montagem da lâmina semi permanente
Depositar as amostras em lâmina
Pingar água glicerinada sobre as amostras
Depositar a lamínula
Lutar com esmalte transparente
Fotos: J.S. Jesus, 2012
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
DISSOCIAÇÃO DE EPIDERME
 4) Montagem da lâmina permanente
Desidratar amostra em série alcoólica (70 – 100%)
Série álcool – xilol (3:1; 1:1; 1:3 – xilol puro)
Montagem em bálsamo do Canadá
Fotos: J.S.Jesus, 2012
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
CORTES HISTOLÓGICOS
 1) Corte à mão livre (30 - 90 µm)
Inclusão no suporte (medula ou isopor)
Corte com navalha ou lâmina de barbear (afiada)
Manter os cortes em recipiente com água (placa de petri ou vidro de relógio)
Clarificação dos cortes mais finos (hipoclorito)
neutralização (ácido acético 1%) – 2 minutos
Enxágue em água - 1 minuto
Coloração – 15 a 60 segundos
Lavagem em água – 1 minuto
Montagem da lâmina e lutagem
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
CORTES HISTOLÓGICOS
 1) Corte à mão livre – preparação do suporte
Suportes usuais: medula do pecíolo de imbauba; medula do caule de girassol ou sabugueiro; cenoura ou isopor
Corte do suporte e colocação da amostra;
Posição para o corte
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
CORTES HISTOLÓGICOS
 2) Inclusão em parafina para microtomia
Desidratação das amostras em série alcoólica
Série álcool xilol
Infiltração em parafina histológica a 56°C
Inclusão em bloco de parafina histológica
Conservação dos blocos sob refrigeração
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
CORTES HISTOLÓGICOS
 2) Inclusão em parafina para microtomia
Cortes em micrótomo (3 – 8 µm)
Depósito dos cortes em lâmina
Desparafinização e re-hidratação em série xilol-álcool
Coloração
Montagem da lâmina em bálsamo do Canadá
Técnicas cito-histológicas: Microtécnica Vegetal
CORTES HISTOLÓGICOS
 
Comparação das técnicas de cortes histológicos:
TÉCNICA
VANTAGENS
DESVANTAGENS
Corte à
mão livre
simples
Cortes mais espessos
(30-90µm)
barato
rápido
não tóxico
inclusão em parafina e microtomia
cortes ultrafinos e perfeitos
(3-5µm)
complexo
caro
demorado
tóxico