Relatório Microbiologia - ISOLAMENTO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA, PREPARO DE DILUIÇÃO, OBSERVAÇÕES E PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS

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CAMPINA GRANDE 
2018 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA – UEPB 
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA – CCT 
CURSO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL 
 
COMPONENTE CURRICULAR: Técnicas Experimentais de Microbiologia Experimental 
PROFESSORA: Weruska Brasileiro Ferreira 
 
 
 
 
ATIVIDADES PRÁTICAS 
 
AULAS III, IV E V – ISOLAMENTO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA, 
PREPARO DE DILUIÇÃO, OBSERVAÇÕES E PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS 
 
 
 
 
 
AMANDA MYRNA DE MENESES E COSTA 
Matrícula: 162010010 
 
NATHALIA DUTRA RIBEIRO LEITE 
Matrícula: 162010125
 
 
 
SUMÁRIO 
 
AULA III – ISOLAMENTO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA 
 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 5 
2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 6 
3. MATERIAIS UTILIZADOS ............................................................................................ 7 
3.1. Demonstração da técnica de isolamento de culturas ............................................... 7 
3.2. Inoculação de microrganismos em meio sólido ........................................................ 7 
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL .......................................................................... 8 
4.1. Demonstração da técnica de isolamento de culturas ............................................... 8 
4.2. Inoculação de microrganismos em meio sólido ........................................................ 8 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 9 
5.1. Demonstração da técnica de isolamento de culturas ............................................... 9 
5.1.1. Microalgas e biocombustíveis ........................................................................ 9 
5.2. Inoculação de microrganismos em meio sólido ...................................................... 13 
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................... 14 
 
AULA IV – PREPARO DE DILUIÇÃO 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16 
2. OBJETIVO ...................................................................................................................... 17 
3. MATERIAIS UTILIZADOS .......................................................................................... 18 
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................ 19 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 20 
5.1. Importância de se utilizar líquido de diluição ....................................................... 20 
6. CONSIDERÇÕES FINAIS............................................................................................. 22 
 
AULA V - OBSERVAÇÕES E PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 24 
 
 
 
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 27 
3. MATERIAIS UTILIZADOS .......................................................................................... 28 
3.1. Observações no microscópio ótico .......................................................................... 28 
3.2. Observações no microscópio invertido ................................................................... 28 
3.3. Preparação microscópica a fresco ........................................................................... 28 
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................ 29 
4.1. Observações no microscópio ótico .......................................................................... 29 
4.2. Observações no microscópio invertido ................................................................... 29 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 30 
5.1. Observações no microscópio ótico .......................................................................... 30 
5.2. Observações no microscópio invertido ................................................................... 30 
5.3. Preparação microscópica a fresco ........................................................................... 31 
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................... 32 
EXERCÍCIOS ......................................................................................................................... 33 
Referências .............................................................................................................................. 34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAMPINA GRANDE 
2018 
AMANDA MYRNA DE MENESES E COSTA 
NATHALIA DUTRA RIBEIRO LEITE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADES PRÁTICAS 
 
AULA III – ISOLAMENTO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA
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1. INTRODUÇÃO 
No meio em geral, a grande maioria dos microrganismos são encontrados vivendo em 
comunidades, ou seja, diversas populações interagindo umas com as outras, de modo que uma 
amostra é composta por uma grande diversidade de microrganismos. O estudo dos 
microrganismos muitas vezes dependente da possibilidade de cultivar e manter microrganismos 
viáveis no laboratório, sob a forma de culturas puras. 
Cultura pura de um microrganismo é uma cultura de células morfologicamente e 
geneticamente idênticas uma das outras sem a interferência de nenhuma outra. A obtenção de 
culturas puras, também denominadas isolamento, é um dos primeiros procedimentos para que 
se possam realizar estudos sobre microrganismos. 
Quando em uma amostra há um grande número de diversos microrganismos e precisa-
se apenas obter culturas puras, sendo assim, são feitos diversos processos para que isso seja 
possível, fazendo a imobilização das células num meio sólido tornando possível a visualização 
do crescimento em massas celulares isoladas denominadas colônias. 
Para obter culturas puras, podem ser realizadas por meio da técnica de estrias por 
esgotamento, onde a amostra é distribuída na superfície do meio de cultura com auxílio de uma 
alça de inoculação, para obter culturas isoladas. Por meio da técnica de semeadura em superfície 
onde uma gota de uma amostra diluída é colocada em um meio de cultura também com auxílio 
de uma alça de inoculação. E por fim, por meio da técnica de pour-plate ou de diluição onde é 
feita uma diluição em sequência da amostra e os inóculos são distribuídos em placas de Petri 
contendo meios de cultura. 
Então, observando que todos esses processos favorecem o crescimento e isolamento dos 
microrganismos estudados, podendo então obter a cultura pura e fazer diversos estudos assim 
esperados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. OBJETIVOS 
 Demonstrar técnicas de assepsia e outros procedimentos necessários às atividades de 
isolamento; 
 Demonstrar os principais métodos de obtenção de culturas axênicas; 
 Observar diferenças entre as colônias de microrganismos, correlacionando essas 
diferenças com isolamento de culturas puras. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. MATERIAIS UTILIZADOS 
3.1. Demonstração da técnica de isolamento de culturas 
Vidrarias e equipamentos: 
– Placas de Petri; 
– Alça de platina; 
– Bico de Bunsen; 
– Tubo contendo a cultura a ser isolada; 
– Estante para tubos de ensaio; e 
– Álcool 70. 
 
 Meios de cultura utilizados: 
– Ágar nutriente. 
 
3.2. Inoculação de microrganismos em meio sólido 
 Vidrarias e equipamentos: 
– Placas de Petri; 
– Fonte de microrganismos (mão suja, tela de celular, etc.); 
– Bico de Bunsen; e 
– Álcool 70. 
 
 Meios de culturas utilizados: 
 – Ágar nutriente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
4.1. Demonstração da técnica de isolamento de culturas 
 Esterilizar a bancada com álcool 70; 
 Ligar o bico de Bunsen para evitar possíveis contaminações; 
 Com uma mão, segurar a alça de platina sobre a chama do bico de Bunsen até a 
mesma apresentar a cor rubra, a fim de esterilizá-la. Esperar a alça esfriar próximo 
a chama ou dentro do tubo em que a cultura se encontra; 
 Pegar o tubo de ensaio da cultura com a mão oposta à que segura a alça de platina 
e retirar a tampa do tubo com o dedo mínimo da mão em que está a alça; 
 Flambar a boca do tubo na chama e inserir a alça de platina na cultura. Novamente 
flambar a boca do tubo e fechá-lo; 
 Com a alça de platina, inocular uma placa de Petri previamente esterilizada e já com 
o meio de cultura solidificado utilizando a técnica de estriamento; 
 Incubar a placa a 30°C na posição invertida. 
 
4.2. Inoculação de microrganismos em meio sólido 
Observação: Assim como no tópico anterior, a bancada deve ser esterilizada, o bico de 
Bunsen ligado e as placas de Petri também devem ser previamente esterilizadas. 
 Inocular placas de Petri (com o meio de cultura já solidificado) com culturas de 
microrganismos existentes ao nosso redor utilizando fatores do cotidiano (mãos 
sujas, tela de celular, sopro de alguém, entre outros); 
 Incubar a 30°C na posição invertida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
5.1. Demonstração da técnica de isolamento de culturas 
 Inicialmente, os procedimentos para evitar a contaminação da cultura utilizada foram 
realizados, deixando o local devidamente esterilizado. Feito isso, foi escolhido um dos tubos 
com cultivo de microalgas mistas já existentes no laboratório e a professora demonstrou todo o 
processo que foi realizado. 
 Com o bico de Bunsen ligado, a alça de platina foi posicionada diretamente sobre a 
chama até alcançar a cor rubra – indicador que garante a esterilização do equipamento. Pegando 
o tubo de ensaio com o cultivo das microalgas, o submetemos à agitação a fim de distribuir os 
microrganismos ali existentes de forma uniforme pelo meio. 
 O tubo foi aberto e teve sua boca flambada na chama para então ter a alça e platina 
inserida em seu interior, mas sem entrar em contato com o meio, pois ela ainda se encontrava 
quente. Esperou-se o seu resfriamento ocorrer dentro do próprio tubo para então ser coletado 
uma amostra das colônias formadas. A boca do tubo foi novamente flambada para o mesmo ser 
fechado e recolocado na estante. 
 O inóculo coletado foi transferido para uma das placas com ágar nutriente previamente 
preparadas para a aula. O ágar nutriente é indicado em muitos procedimentos de métodos 
padrões para a análise de alimentos, produtos lácteos, água e outros materiais (NEOGEN, 
2009). É utilizado para cultivarmos uma ampla variedade de microrganismos, entre eles 
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, 
Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyogenes. 
 O método utilizado para o cultivo dos microrganismos foi o de superfície, onde 
semeamos uma pequena amostra da cultura mista com auxílio de alça de platina, fazendo estrias 
na superfície do meio. A placa foi incubada na estufa a 30°C e depois do período de 48hrs foi 
observado o crescimento de colônias de microrganismos (os quais não foram diferenciados). 
 
5.1.1. Microalgas e biocombustíveis 
Os biocombustíveis são definidos como uma fonte energética derivada de materiais 
biológicos, como matéria orgânica morta não fossilizada, e de produtos metabólicos de 
organismos vivos como a utilização do óleo vegetal para a produção de biodiesel. 
Nos últimos anos, a demanda por biocombustíveis tem aumentado, principalmente pela 
busca de segurança energética através de novas fontes de energia e pelas mudanças climáticas 
que acontecem no mundo, além da ameaça constante de uma “crise” petrolífera. 
Entre as alternativas disponíveis, as microalgas se apresentam com o maior potencial de 
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produção para combustíveis renováveis, uma vez que demonstram várias vantagens quando 
comparadas às outras fontes, como, por exemplo, o óleo de soja. 
As microalgas são organismos unicelulares e habitam quase todos os ambientes 
existentes. Uma das vantagens de seu cultivo é que ele pode ser realizado em áreas de baixa 
aptidão agrícola, portanto, não compete com lavouras voltadas a alimentação, que é uma das 
principais questões atuais contra a expansão da produção de biocombustíveis. Além disso, o 
cultivo de microalgas pode exercer um importante papel na redução das emissões de gases de 
efeito estufa de fontes estacionárias (que geram cargas pontuais e concentradas de poluentes), 
pois sequestram eficientemente o dióxido de carbono. 
O processo de produção de biodiesel a partir de microalgas é realizado através do 
isolamento e identificação das espécies, após o isolamento, são tomadas providencias para que 
ocorra o crescimento desejado. As melhores serão as que se reproduzirem mais rapidamente e 
tiverem maior teor de óleo. Após quatro dias, vão à secagem. Depois de secas, são embaladas 
para evitar seu contato com a luz e o oxigênio do ar. Na última etapa do processo, as microalgas 
secas são colocadas em um reator, que realiza dois processos: a extração do óleo que será 
utilizado na fabricação do biocombustível e a transformação deste óleo em biodiesel, por meio 
de reações químicas. 
O grande destaque destes organismos microscópicos é a sua enorme capacidade de 
produzir biomassa por unidade de área e tempo. Além disso, algumas espécies armazenam 
grandes quantidades de óleo, um alto teor de lipídeos acarreta em um elevado rendimento na 
extração de seu óleo. A biomassa, depois de produzida e coletada, segue para um sistema de 
secagem para a redução da umidade do material, tornando-o mais adequado para o 
processamento industrial, seja de produção de biocombustíveis ou outros produtos. 
Além das já citadas, podemos listar as principais vantagens das microalgas para a 
produção de biodiesel em relação às culturas tradicionais: 
 Áreas desérticas, semiáridas e degradadas podem ser utilizadas para o seu cultivo; 
 Não ocasionaria um aumento no desmatamento, outro ponto importante contra as 
culturas tradicionais; 
 As microalgas apresentam rendimentos muito superiores aos das principais culturas 
para a produção de biodiesel, por exemplo. O limite inferior de rendimento de óleo 
das microalgas é cerca de 65% maior do que a cultura terrestre com maior 
rendimento, que é a palma; 
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 Pode empregar o uso águas impróprias para a agricultura, como marinha, salobra e 
residual, uma vez que removem fosfatos e nitratos da água residual durante seu 
crescimento, contribuindo para o tratamento desta água (POJÔ, 2016). 
 O filo das algas, ao qual pertence as microalgas, pode variar entre 4 a 13 divisões, tendo 
entre 25 e 40 mil espécies descritas. Atualmente, algumas classes são predominantemente 
cultivadas, seja para fins comerciais ou para produção de biocombustíveis. São elas: 
 – ClasseCyanophyceae, também conhecidos como cianobactérias, pois suas 
características celulares são mais parecidas com as células procarióticas das bactérias do que 
com as células eucarióticas das microalgas e organismos superiores. São encontrados nos mais 
diversos habitats do planeta: ocorrem em oceanos com diferentes graus de salinidade, em 
sistemas de água doce, de rochas úmidas e em diversos tipos de solos. As cianobactérias 
contribuem em grande parte com a produtividade primária dos ecossistemas em que se 
encontram. 
 – Classe Bacillariophyceae: organismos unicelulares de vida livre podendo existir em 
colônias. Umas das características marcantes deste grupo é a presença de uma parede celular 
dividida em duas metades, conhecida como frústula. Atualmente, existem mais de 100.000 
espécies conhecidas de diatomáceas. No tocante a ecologia, as diatomáceas são encontradas em 
quase todos os ambientes aquáticos seja de água doce ou salgada, de clima tropical, temperado 
ou polar. 
 – Na Classe Chrysophyceaes, as algas apresentam flagelos perpendiculares uns aos 
outros. A maioria das espécies ocorre em água doce e em águas com baixa concentração de 
cálcio (Lee 2008) mas também podem ocorrer em ambientes marinhos. Algumas espécies desta 
Classe apresentam alto conteúdo de ácidos graxos poli-insaturados, por este fato, organismos 
pertencentes a esta classe são bons candidatos ao uso na produção de biocombustíveis. 
 – Classe Chlorophyceae: neste grupo encontram-se as algas verdes. A grande maioria 
das espécies dessa Classe, pertencente ao Filo Chlorophyta, habita ambientes de água doce e 
poucas espécies são marinhas ou terrestres. Os organismos deste grupo apresentam as mais 
variadas formas de vida, podendo ser unicelulares flageladas e não-flageladas, colonias móveis 
e não-móveis, algas filamentosas e algas formando lâminas celulares (RAVEN et al. 1999). As 
microalgas observadas no laboratório fazem parte dessa classe, sendo elas dos Gêneros 
Dunaliella, Scenedesmus e Chlorella. 
 Como possuem grande variedade de espécies e crescem em vários ambientes diferentes, 
é necessário realizar uma caracterização e separação das espécies que atendam às exigências 
para a produção de biocombustíveis. É importante determinar o potencial máximo de taxa de 
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crescimento, produção de lipídios e também avaliar quais fatores ambientais influenciam o 
aumento ou a diminuição destes parâmetros. 
 Segundo Zemke et al. (2010), a taxa pela qual as microalgas convertem a luz do sol em 
biomassa é um dos fatores que influenciam a produtividade desses seres, e o valor máximo de 
irradiação global ocorre no norte do estado da Bahia, próximo à fronteira com o estado do Piauí 
(PEREIRA et al., 2006). Sendo assim, o semiárido da região Nordeste está entre uma das áreas 
mais propícias para o desenvolvimento de projetos relacionados ao cultivo de microalgas 
visando à produção de biocombustíveis, uma vez que recebe grande irradiação solar. 
 A produção, composição e armazenamento de lipídios também são fatores 
determinantes na produção de biocombustíveis a partir de microalgas. Nos organismos vivos, 
as funções dos lipídios são bastante diversas, mas para a produção de biodiesel, os lipídios que 
mais interessam são os de armazenamento, como, por exemplo, os triacilgliceróis (compostos 
por ácidos graxos que podem ser saturados e insaturados). 
 Sabendo que a produção desses lipídeos é, geralmente, inversamente proporcional à 
atividade fotossintética, o aumento máximo da produção de triacilgliceróis pode ser alcançado 
com um crescimento exponencial das microalgas em condições ótimas, seguido de imposições 
de estresses que limitam a fotossíntese, como a limitação da disponibilidade de alguns 
nutrientes importantes como o nitrogênio (BECKER, 1994). Por outro lado, esse método acaba 
por gerar uma queda na produtividade de biomassa, que é compensada pelo aumento do 
conteúdo lipídico. A solução seria encontrar espécies que apresentem um acúmulo natural de 
lipídios maior do que o normal ou criar cepas capazes de acumular lipídios constitutivamente. 
 Um estudo realizado no Havaí indicou que outro fator que exerceu grande influência na 
produtividade desses seres foi a diluição da cultura, que foram diluídas entre dois e quatro dias. 
Observou-se que a maior produtividade e maior eficiência da fotossíntese foram alcançada ao 
se diluir a cultura a cada três dias. O que faz sentido, já que com uma densidade relevante de 
biomassa, aumenta-se o efeito de sombra entre as microalgas presentes no cultivo, reduzindo, 
assim, a disponibilidade de luz prejudicando a fotossíntese que por sua vez se refletiria na 
diminuição da produtividade (na fotossíntese ocorre a transformação da energia luminosa em 
biomassa). Além disso, poderia estar ocorrendo um aumento da disputa pelos nutrientes 
disponíveis. 
Outros fatores como temperatura, salinidade e pH também são importantes e 
influenciam na produtividade das culturas, porém são parâmetros específicos de cada espécie, 
portanto, com relação a estes parâmetros, a produtividade da cultura irá variar dependendo da 
espécie a ser utilizada. 
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 Apesar do grande potencial e das vantagens apontadas para seu uso, ainda existem 
entraves científicos e tecnológicos que inviabilizam a produção de biodiesel de microalgas em 
larga escala. Segundo Derner et al. (2006), é estratégico o desenvolvimento de estudos 
considerando a diversidade biológica das microalgas; os tipos de cultivo (autotrófico, 
heterotrófico e mixotrófico); os sistemas de produção (abertos e fechados); os fatores que 
influenciam a biossíntese de lipídios de interesse; os métodos de separação da biomassa; as 
técnicas de extração do óleo e síntese do biodiesel; e a utilização da biomassa resultante do 
processo para distintas finalidades, gerando coprodutos, tais como ração animal, pigmentos 
bioativos, fármacos, entre outros. 
 
 
5.2. Inoculação de microrganismos em meio sólido 
 Com a bancada já esterilizada e as devidas precauções tomadas, como descrito no tópico 
5.1., realizamos a inoculação de culturas de microrganismos nas placas de Petri que já haviam 
sido preparadas para a aula. 
 As placas se encontravam com o meio ágar nutriente já colocado e solidificado, e 
realizamos a semeadura por superfície de microrganismos presentes em coisas cotidianas. 
Primeiro foi pedido para alguém que estivesse com dinheiro colocasse a mão em contato com 
a cédula e depois passasse a mesma pelo meio em uma das placas. Assim foi feito, Nathalia 
passou sua mão em uma cédula de dois reais e logo após passou os dedos pela superfície do 
meio presente na placa. Identificamos e reservamos. 
 Outra placa foi inoculada com microrganismos presentes na tela do celular também de 
Nathalia. Foi passado um algodão pela tela e depois, suavemente, passamos esse mesmo 
algodão na placa, a fim de distribuirmos a amostra pela superfície do meio. 
 Por fim, para inocularmos a última placa, foi solicitado a outra aluna, Áurea, que 
soprasse na placa, depositando os microrganismo na mesma. Assim foi feito e as três placas, 
devidamente identificadas, foram para a estufa, onde permaneceram por um período de 48hrs 
e, nas três, podemos perceber o crescimento de unidades formadoras de colônias. 
 Foi possível notar a presença de mais de um tipo de microrganismo presente nas 
amostras, o que é normal, dado as fontes utilizadas para amostragem. 
 
 
 
 
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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Isolar um cultivo e obter uma cultura pura se faz importante para diversos estudos, seja para 
conhecer o comportamento e características de um microrganismo desejado, como é o caso das 
microalgas estudadas no Laboratório deReferência em Tecnologia de Águas (LARTECA) pela 
professora Weruska Brasileiro. 
 Através do isolamento desses microrganismos, é possível realizar a produção de 
biocombustível através dos produtos de suas reações, como a produção de lipídeos e de 
biomassa, embora isso envolva vários processos e fatores que contribuem para a produtividade 
máxima das mesmas, sendo necessário todo um cuidado específico em seu cultivo. 
 Nessa aula prática foram observadas as técnicas para esterilização dos materiais e do 
ambiente em que se realiza a análise, assim como para o cultivo e isolamento de culturas de 
microrganismos. Também podemos entender melhor como se dá o processo de inoculação e 
crescimento dos microrganismos. 
 A aplicação de microalgas para produção de biocombustível é uma aplicação prática da 
importância de se isolar uma cultura e conhecer seu comportamento nas mais diversas 
condições na área de Engenharia Sanitária e Ambiental, método que traz inovação e abre um 
leque de possibilidades para um desenvolvimento mais ecológico da energia na nossa 
conjuntura atual.
 
CAMPINA GRANDE 
2018 
AMANDA MYRNA DE MENESES E COSTA 
NATHALIA DUTRA RIBEIRO LEITE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADES PRÁTICAS 
 
AULA IV – PREPARO DE DILUIÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
Em química, a diluição ocorre quando acrescentamos solvente a alguma solução, assim, 
reduzindo a concentração de uma substancia em solução, com isso o volume da solução 
aumenta e sua concentração diminui, porém, a massa do soluto permanece inalterada. 
Quando feita em série, ela é uma diluição repetida de uma solução que amplia 
rapidamente o fator de diluição. Geralmente, ela é realizada em experiências que requerem 
soluções altamente diluídas com grande precisão, como aquelas que envolvem as curvas de 
concentração em uma escala logarítmica ou para determinar a densidade de bactérias. 
Na microbiologia, a diluição seriada é a técnica que permite a contagem do número de 
microrganismos de amostras com concentrações muito elevadas. Considerando-se que cada 
colônia de bactérias formada sobre um meio de cultivo se origine de uma unidade formadora 
de colônia, quando a concentração de microrganismos inoculados é muito grande, haverá o 
crescimento de colônias de maneira sobreposta impossibilitando a contagem. A amostra deve 
então ser diluída em série para que a concentração de microrganismos diminua, dando origem 
a colônias suficientemente separadas, possibilitando assim a contagem. Para a determinação do 
número de microrganismos da amostra original, multiplica-se o número de colônias encontradas 
na placa pelo o fator de diluição. 
Diluição seriada é o número de diluições feitas a partir da concentração inicial, assim 
sendo a que contém a maior concentração. Pegando um pouco da solução resultante e diluindo 
em certa quantidade de solvente, diluindo um pouco da primeira para fazer a segunda, diluindo 
a segunda para fazer a terceira e assim por diante. Assim, quando a concentração de 
microrganismos estiver menor, pode-se começar a contagem das culturas de bactérias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. OBJETIVO 
Familiarizar o estudante com a técnica de diluição, para utilizar nas técnicas de contagem 
de microrganismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. MATERIAIS UTILIZADOS 
 Tubos de ensaio; 
 Estante para os tubos de ensaio; 
 Pipetas; 
 Líquido de diluição 
Observação: O material utilizado deve ser previamente esterilizado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 Preparar uma série de tubos estéreis contendo 9 mL de líquido de diluição; 
 Com uma pipeta estéril, transferir 1 mL da amostra para um dos tubos contendo 9 mL 
de líquido de diluição (diluição 1/10 ou 10-1); 
 Identificar a diluição e agitar o tubo para obter uma boa distribuição dos 
microrganismos; 
 Descartar a pipeta utilizada e, utilizando nova pipeta estéril, transferir 1 mL da diluição 
1/10 para outro tubo contendo 9 mL de líquido de diluição. Identificar o tubo como 
sendo a diluição 1/100 ou 10-2; 
 Agitar o tubo, descartar a pipeta e repetir o processo até a diluição desejada. 
Observação: todo o material deve ser previamente esterilizado e não devemos esquecer de 
sempre flambar a boca dos tubos diretamente na chama tanto ao abrirmos quanto ao 
fecharmos os mesmos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
O processo de diluição nos foi mostrado sem a utilização de uma amostra com culturas de 
microrganismos, observamos o desenvolvimento dessa técnica ser realizado com o próprio 
líquido de diluição, porém, iremos descrever os procedimentos realizados considerando a 
utilização do tubo contendo as colônias de microalgas que utilizamos para demonstrar a técnica 
de isolamento das culturas. 
Assim como na aula anterior, todos as medidas para a esterilização do local foram tomadas, 
buscando evitar possíveis contaminações. Inicialmente foram preparados dois tubos contendo 
9 mL de líquido de diluição cada. Em seguida, pegou-se a amostra, agitou-a, e, com uma pipeta 
estéril, retirou-se uma alíquota de 1 mL que foi transferida para um dos tubos com o líquido de 
diluição. Esta foi classificada como a diluição 1/10. 
Em seguida, com nova pipeta estéril, retirou-se mais 1 mL da diluição 1/10 já realizada e 
transferiu-se para um outro tubo contendo 9 mL de líquido de diluição, sendo esta a diluição 
1/100. 
O processo aqui descrito nos permite diluir uma amostra em estado líquido, mas a mesma 
coisa também pode ser realizada para amostras sólidas. A diferença que iremos encontrar será 
na preparação da diluição 1/10 ou 10-1, que será preparada pesando se 10 g da amostra (deve-
se parti-la em pequenos pedaços) e misturando com 90 mL de líquido de diluição – ou 25 g da 
amostra para 225 mL de líquido de diluição. Isso nos deixa com uma parte da amostra em dez 
partes do líquido de diluição, a mesma coisa feita ao se realizar a diluição 1/10 em amostras 
líquidas. A partir daí as outras diluições seguem sendo feitas normalmente. 
Em análises microbiológicas, essas diluições são realizadas com o propósito de facilitar a 
contagem e verificação da presença dos microrganismos existentes em uma amostra, seja ela 
de água, de alimentos ou até mesmo clínica. 
Para realizarmos a contagem dos microrganismos em uma diluição não podemos esquecer 
de multiplicar o úmero de colônias obtidas pelo fator de diluição, sendo assim, caso a contagem 
fosse realizada em uma diluição 1/1000 deveríamos multiplicar o número alcançado por 1000, 
pois, em uma fração, vamos considerar o denominador para realizar a multiplicação. Fazendo 
isso nós conseguimos determinar, aproximadamente, o número de Unidades Formadoras de 
Colônias por mililitro da amostra (UFC/mL), ou por grama, quando esta for sólida (UFC/g). 
 
5.1. Importância de se utilizar líquido de diluição 
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 O líquido de diluição que utilizamos para realizar esse processo é especialmente preparado 
a fim de evitar que ocorra um desequilíbrio osmótico nos microrganismos presentes na amostra 
a ser analisada e o meio no qual se encontram. 
 Sabemos que, por se tratar de uma solução, um soluto imerso em um solvente, a tendência 
é que ocorra a passagem de solvente parao meio mais concentrado a fim de alcançar o equilíbrio 
osmótico daquela solução. Isso ocorre se utilizarmos água comum ou somente a água destilada 
para, no caso, diluirmos nossas amostras. 
 Ao prepararmos o líquido de diluição tomamos medidas para evitar a passagem de solvente 
para o meio mais concentrado, pois ocorrendo isso, pode haver rompimento nas células dos 
microrganismos presentes na amostra, o que afetaria na contagem final para determinação das 
unidades formadoras de colônia ou para a verificação da existência desses microrganismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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6. CONSIDERÇÕES FINAIS 
Realizar diluições é fundamental para análises microbiológicas, uma vez que elas nos 
permitem visualizar mais claramente o que não poderia ser visto ou que teríamos grande 
dificuldade observar caso a amostra fosse analisada em seu estado “concentrado”. 
É a partir das diluições que serão realizadas as análises desejadas para que se possam contar 
e calcular a quantidade de unidades formadoras de colônias presentes na amostra, lembrando 
sempre de multiplicar o resultado pelo fator de diluição que foi utilizado. 
Podemos observar todo esse processo realizado em laboratório nessa aula prática. 
 
 
 
 
 
 
CAMPINA GRANDE 
2018 
AMANDA MYRNA DE MENESES E COSTA 
NATHALIA DUTRA RIBEIRO LEITE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADES PRÁTICAS 
 
AULA V – OBSERVAÇÕES E PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
O objetivo da microscopia é visualizar organismos que não são vistos a olho humano, 
possibilitando o estudo de seres tão pequenos e obtendo imagens ampliadas dos estudos em 
questão. A forma mais comum de uso para ver objetos menores é a utilização da lupa ou 
microscópio estereoscópico, seguida do microscópio optico que ilumina o objeto com luz 
visível ou com luz ultravioleta. O limite máximo da resolução do microscópio optico vai 
depender da difração da luz dos raios incidentes que se faz presente. O poder de resolução dos 
microscópios atuais é de 0,2 µm, cerca de mil vezes mais que o olho humano. 
Um microscópio de luz (óptico) pode ser simples ou composto, sendo que o microscópio 
simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto 
que se está estudando, e o microscópio composto consiste de um conjunto de lentes capaz de 
fornecer um aumento muito maior. O espécime a ser observado será analisado graças à 
iluminação que o atravessará. 
O microscópio rotineiramente utilizado no laboratório é o microscópio óptico composto. 
Seu princípio de funcionamento baseia-se no aumento da imagem por um conjunto de lentes 
convergentes: a objetiva (que é um conjunto de lentes que apresenta pequena distância focal e 
que fornece uma imagem real e aumentada do objeto que é observado) e a ocular (que é formada 
por lentes convergentes, funciona como uma lupa, que nos dá uma imagem virtual e aumentada 
da imagem real que se formou em pela objetiva). São associados a uma forte iluminação do 
campo de observação, fornecendo uma imagem translúcida dos microrganismos. 
Os tipos de objetivas são: 
 Acromáticas – são a mais simples. São aquelas sem nenhuma sofisticação, que os 
microscópios comuns possuem; 
 Semi-apocromática – são também chamadas de fluorita, porque este material entra 
na sua constituição, dando alguma correção para as aberrações; 
 Apocromáticas – possuem correção ampla. Abrangem todo o espectro; 
 Planapocromática – possui imersão, com aumento de 63 X e abertura numérica de 
1,4. Com ela se consegue o máximo de resolução de um microscópio óptico; 
As lentes, os filtros e a iluminação do microscópio podem ser manipulados para ampliar, 
resolver e intensificar uma variedade de imagens. Ao longo dos anos, algumas modificações 
foram introduzidas no microscópio com a finalidade de aumentar ou melhorar a visibilidade, 
sendo assim, o tipo de amostra usada e a documentação que necessita fazer determinam qual o 
método a ser escolhido, que são eles: 
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 A microscopia de campo Claro - Essa é a técnica mais comumente usada, quando a 
luz passa através da amostra, fazendo com que a área observada seja bem iluminada; 
 A microscopia de campo Escuro - Alguns raios luminosos incidem na amostra e são 
captados pela lente objetiva, o que gera imagens luminosas em um fundo escuro; 
 A microscopia de contraste de Fases - é também uma adaptação do óptico e utiliza 
um sistema de lentes que transforma diferenças de fase em diferenças de 
intensidade; 
 A microscopia de contraste interferencial - possibilita quantificar a massa de tecido, 
e o microscópio diferencial de interferência, que é especialmente útil para avaliar 
as propriedades de superfície das células e de outros materiais biológicos; 
 A microscopia de polarização - é uma modificação simples do microscópio óptico, 
no qual um filtro polarizante está localizado entre a fonte de luz e o espécime, e um 
segundo polarizador está localizado entre a lente objetiva e a ocular. Esses filtros 
modificam a luz e são eficientes na análise de materiais biorrefringentes; 
 A microscopia de fluorescência - usa a capacidade de algumas moléculas em 
fluorescer sob luz ultravioleta, visualizando moléculas auto fluorescentes; 
 Microscopia eletrônica - usa-se feixe de elétrons no lugar dos feixes de luz, o que 
permite conseguir aumento de até 250.000 vezes. Isso permite a visualização de 
partículas virais e avaliação da ultraestrutura das células; 
 Microscopia invertida - permite a observação de material muito espesso, impossível 
de visualizar nos demais microscópios. Permite que observe células dentro dos 
tubos e garrafas, sem, contudo, precisar abri-las evitando-se assim problemas de 
contaminação; 
 Microscópio estereoscópico - possuem as oculares que ampliam o material 
permitindo observações de espécimes para dissecções. 
O microscópio óptico é constituído de um sistema de lentes e de um suporte mecânico 
e os nomes das principais partes de um microscópio óptico e suas funções são: 
 Oculares - Dois sistemas de lentes. As oculares geralmente têm poder de aumento 
de 10X e é por meio delas que observamos a imagem ampliada; 
 Canhão ou tubo - Suporte das oculares; 
 Revólver - Peça giratória que comporta as objetivas. Para trocar de objetiva, sempre 
manuseie o revólver, nunca force as objetivas; 
 Objetivas - Geralmente três ou quatro, são lentes de maior poder de ampliação; 
26 
 
 
 Platina - Também chamada de mesa, é o suporte onde será colocada a lâmina. A 
platina pode ser levantada ou baixada para regular o foco, utilizando-se os parafusos 
macro e micrométrico; 
 Condensador - Concentra os raios luminosos que incidem sobre a lâmina; 
 Fonte de luz - Nos microscópios modernos é uma lâmpada, mas em microscópios 
mais antigos era um espelho que refletia a luz; 
 Liga/desliga - Botão para ligar e desligar a lâmpada; 
 Macrométrico - Parafuso que permite regular a altura da platina. Faz movimentos 
amplos para um ajuste grosso; 
 Micrométrico - Parafuso que permite regular a altura da platina. Permite um ajuste 
fino do foco; 
 Braço - Também chamado de coluna, é fixo na base do microscópio e serve de 
suporte para as demais partes; 
 Charriot - Peça que permite movimentar a lâmina sobre a platina. Não aparece na 
figura pois geralmente localiza-se na lateral direita. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. OBJETIVOS 
 Identificar as diferentespartes do microscópio e manuseá-lo adequadamente; 
 Aprender a focalizar preparados no microscópio; 
 Compreender o princípio de funcionamento dos microscópios óptico e invertido; 
 Aprender a utilizar a técnica de preparação microscópica a fresco entre lâmina e 
lamínula. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. MATERIAIS UTILIZADOS 
3.1. Observações no microscópio ótico 
 Microscópio óptico; e 
 Lâminas para observação já preparadas. 
 
3.2. Observações no microscópio invertido 
 Microscópio invertido; e 
 Câmaras de sedimentação especiais para observação que devem ser preparadas 
com o material horas antes da observação; 
 Meio contendo microrganismos. 
 
3.3. Preparação microscópica a fresco 
 Cultura de microrganismos em meio líquido e meio sólido; 
 Lâmina e lamínula; 
 Alça de platina; 
 Bico de Bunsen; e 
 Água esterilizada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
4.1. Observações no microscópio ótico 
 Escolher a lâmina a ser observada, posicioná-la na platina, focalizar o 
microscópio, observar a cultura de microrganismo e classificá-la. 
 
4.2. Observações no microscópio invertido 
 Observar a câmara de sedimentação previamente preparada, posicionando-a na 
platina e ajustando-a para focalizar as culturas de microrganismos existentes. 
 Classificar os microrganismos observados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 5.1. Observações no microscópio ótico 
 Ao chegarmos no laboratório já estavam nos esperando nove lâminas preparadas com 
culturas de microalgas prontas para serem analisadas, eram três lâminas para cada tipo de 
gênero observado, portanto tínhamos três lâminas com Dunaliella, mais três com Scenedesmus 
e, por fim, três lâminas com Chlorella. 
 Foi nos explicada toda a parte teórica dos componentes de um microscópio e como o 
mesmo funciona para, só então, utilizarmos o mesmo. As lâminas foram posicionadas na platina 
e inicialmente focadas pelo técnico do LARTECA, para que pudéssemos visualizar as 
microalgas. Em um dos microscópios disponíveis, visualizamos microalgas do gênero 
Chlorella, caracterizadas pela sua coloração verde e formado circular que apresenta; no segundo 
microscópio foram focalizadas culturas do gênero Dunaliella, também de coloração 
esverdeada, mas de formato ovalado. As lâminas com microalgas do gênero Scenedesmus não 
foram observadas. 
 Depois do primeiro contato com os microscópios, eles foram desfocados com o objetivo 
de que nós, os alunos, focássemos e encontrássemos as colônias de microalgas. Como nenhum 
de nós apresentava familiaridade com o equipamento, demorou um pouco até que 
conseguíssemos encontrar e focar as colônias, o que só ocorreu após mais uma demonstração 
da professora de como deveríamos fazer para encontra-las, só então o objetivo foi alcançado. 
 Existe uma lâmina especial utilizada para contagem de microrganismos – a câmara de 
Neubauer, ou câmara de contagem. Ela é uma lâmina grossa de vidro, composta por duas 
câmaras (independentes), uma superior e uma inferior. Cada uma possui uma grade no centro, 
onde a contagem celular é realizada. A grade de contagem tem 3 mm X 3 mm de tamanho e é 
subdividida em nove quadrantes de 1 mm x 1mm (CÂMARA, 2015). Para utilizar essa câmara, 
é necessário realizar diluições na amostra, logo, o número de células contados não é o resultado 
final. É necessário realizar a multiplicação do número de células pelo fator de diluição ao qual 
a amostra foi submetida. 
 
5.2. Observações no microscópio invertido 
 Logo após entendermos o funcionamento do microscópio óptico, fomos direcionados à 
sala com o microscópio invertido, o qual possui a estrutura invertida, como o próprio nome 
sugere. Para esse tipo de microscópio é necessário a preparação de uma câmara de sedimentação 
para a observação, que é realizada em profundidade, o que facilita a caracterização e contagem 
dos microrganismos. 
31 
 
 
 Foram preparadas câmaras com água bruta do Açude Epitácio Pessoa (Boqueirão) – PB 
e conseguimos visualizar e identificar dois tipos de cianobactérias presentes na água, as 
pertencentes aos gêneros Dolichospermum e Cylindrospermopsis. 
 As do primeiro gênero se caracterizam por suas colônias crescerem em aglomerados 
filamentosos de cadeias multicelulares. As células são cilíndricas ou em forma de barril, sendo 
facilmente percebidas em contraste com as do gênero Cylindrospermopsis, que possuem suas 
células organizadas em forma de filamentos cilíndricos. 
 
5.3. Preparação microscópica a fresco 
 Na preparação a fresco utilizamos tanto culturas em meios sólidos quanto em meios 
líquidos. No último caso a preparação é feita coletando-se uma pequena alíquota da amostra 
(uma a duas gotas) e colocando-a no centro da lâmina e recobrindo-a com a lamínula. O cultivo 
utilizado foi um cultivo de microalgas. 
 Também utilizando culturas de microalgas realizamos a preparação a fresco a partir de 
um meio sólido. Nesse método coletamos, com auxílio da alça de platina devidamente 
esterilizada, uma partícula visível da cultura é retirada e depositada na lâmina, na qual já tinha 
sido depositada uma gotícula de água esterilizada. Então espalhamos cuidadosamente a 
partícula na água, para finalmente colocar a lamínula por cima do material a ser observado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 Os microscópios são ferramentas muito úteis dentro de um laboratório, em especial, um 
de microbiologia, onde se faz necessário identificar, contar e classificar seres microscópicos. 
Existem várias técnicas microscópicas utilizadas para estes fins, portanto cabe a nós 
escolhermos a mais adequada de acordo com a finalidade da pesquisa. 
 Nessa aula prática aprendemos como manusear corretamente um microscópio, além de 
como fazer para visualizarmos colônias de microrganismos utilizando a preparação a fresco em 
um microscópio óptico. Também observamos o processo de observação em um microscópio 
invertido, que permitem a observação de células vivas sob condições mais naturais do que numa 
lâmina de vidro, como é o caso com um microscópio convencional. 
 Como esperado, também conseguimos entender o processo de preparação microscópica 
a fresco, que nos permite observar, com auxílio do microscópio óptico, colônias cultivadas em 
meios líquidos ou sólidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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EXERCÍCIOS 
 
1. Descreva o procedimento de focalizar com o óleo de imersão. 
R.: Ao se preparar a lâmina devidamente, seja por preparação a fresco ou por fixação 
do esfregaço, acima da lamínula deve ser colocado um pouco do óleo de imersão, 
utilizado quando vamos observar as culturas com a lente objetiva de 100x (ou objetiva 
de imersão). Deve-se fazer uso do óleo para fazer com que o índice de refração seja o 
mesmo para a lâmina de vidro e o óleo, evitando que os raios luminosos lançados pela 
fonte de luz se dispersem, permitindo a entrada de um grande cone de luz na objetiva, 
permitindo uma melhor resolução. 
 
2. Como se calcula o aumento final do objeto após a focalização? 
R.: O aumento total é dado pelo produto entre o valor de aumento da lente objetiva e o 
valor de aumento da lente ocular. 
 
3. O que é poder resolvente de uma objetiva? 
R.: O poder resolvente,ou de resolução, de uma objetiva é a capacidade de ver 
nitidamente o menor espaço existente entre dois pontos. 
 
4. Qual é a finalidade do condensador e do diafragma? 
R.: O condensador é formando por um conjunto de lentes logo abaixo da platina, 
concentra e torna paralelo o feixe de luz que atinge as lentes objetivas, fornecendo a 
iluminação necessária para a observação. E o diafragma se encontra acima do filtro e 
controla a intensidade do feixe de luz que chega na platina. 
 
5. Esquematize as lâminas observadas. 
R.: 
LÂMINAS OBSERVADAS 
 Lâmina 1 Lâmina 2 
GÊNERO Dunaliella Chlorella 
COR Esverdeada Verde 
FORMA/ARRANJO Ovalada Circular 
 
 
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Referências 
 
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