Aula Pratica 1- Analise atividade desidrogenase solo

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1.ATIVIDADE DESIDROGENASE EM SOLOS 
 
1.1Visão Geral 
 
Objetivo: demonstrar a atividade desidrogenase em relação aos microrganismos do solo 
 Preparar duas condições de incubação para o solo: i) solo sem modificações, e ii) solo 
+ glucose. Adicionar um branco – sem solo. 
 Incubar todos as amostras de solo com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) durante 7 
dias. 
 Extrair o trifenilformazan (TPF) de todas das amostras de solo pelo uso de metanol (ou 
etanol). 
 Analisar as concentrações de trifenilformazan (TPF) por espectroscopia para estimar a 
atividade desidrogenase nas amostras testadas. 
 
1.2 Teoria 
O solo é um ambiente heterogêneo, composto por fase sólida, líquida e gasosa; constituído de frações 
orgânicas e inorgânicas e habitado por inúmeras espécies de organismos. Os micro-organismos que 
compõem a microbiota presente no solo são representados por arquéias, bactérias, fungos, microalgas 
e protozoários, que desempenham papel fundamental na formação, estrutura e qualidade do solo 
porque são responsáveis por inúmeras reações bioquímicas que ali ocorrem. Sabe-se que a microbiota 
do solo desempenha papel essencial nos ciclos biogeoquímicos e na estabilização da estrutura do solo. 
As reações bioquímicas da atividade microbiana incrementam o nível de fertilidade dos solos porque 
disponibilizam nutrientes essenciais às plantas. 
Como parte dessas de tais reações, a mineralização da matéria orgânica é realizada por grande 
parte da comunidade microbiana e envolve uma vasta gama de processos metabólicos. Os processos 
enzimáticos dos microorganismos são importantes não só na degradação da matéria orgânica, como 
também na ciclagem de compostos orgânicos aplicados nas camadas superficiais ou que caem sobre 
elas. Ao mesmo tempo, as características físico-químicas do solo e os impactos causados pela atividade 
humana (cultivo agrícola, disposição de resíduos no solo, acidentes com derramamento de compostos 
tóxicos, etc.) influenciam diretamente as condições do próprio solo, a manutenção da taxa de 
crescimento de diferentes espécies de microrganismos e seus processos metabólicos. 
A variação no número de indivíduos ou na comunidade de micro-organismos no solo pode ser medida 
pela biomassa microbiana, pela respiração do solo e por diferentes processos enzimáticos, entre outros. 
A aplicação dessas medidas serve como bioindicadores para se avaliar o efeito de compostos tóxicos 
ou potencialmente tóxicos no ambiente edáfico (pertencente ou relacionado ao solo). 
Desidrogenases são enzimas encontradas em todos os organismos vivos. Essas enzimas estão envolvidas 
em diversas reações de transferência de elétrons. Nas reações catabólicas (reações envolvendo a 
modificação de compostos complexos ou ricos em energia para compostos mais simples ou com menor 
energia) a desidrogenase catalisa a transferência de pares de elétrons do substrato para o NAD+ 
formando NADH. O NADH por sua vez transfere os elétrons para outro composto, servindo como um 
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intermediário na transferência de elétrons. Em reações anabólicas (inverso das catabólicas), o NADP+ 
está envolvido em vez disso. Dois átomos de hidrogênio acompanham os elétrons que estão sendo 
transferidos para manter a carga balanceada. As desidrogenases também participam da transferência 
de eletros em organismos aeróbios, cuja atividade é uma medida indireta da respiração relacionada 
a atividade metabólica. Um dos métodos mais utilizados para a medida da atividade desidrogenase 
foi proposta por Casida et al. (1977). Nessa metodologia uma amostra de solo é incubada com o 
cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC), um inibidor competitivo do NAD+. Assim, o TTC (de cor amarelo 
clara e com certa solubilidade em água) atua como um aceptor final dos elétrons liberados durante a 
respiração dos microrganismos do solo, sendo reduzido para um composto denominado trifenilformazan 
(TPF), um composto de cor vermelha insolúvel em água. O solo coletado para o ensaio deve ser fresco 
pois os resultados são afetados negativamente pelo armazenamento, mesmo a 4°C. A exclusão do 
oxigênio favorece a transferência de elétrons para o TTC. Exemplos da transferência de elétrons 
mediada pelas desidrogenases são mostrados abaixo: 
 
 
Reação normal. NAD+ é reduzido a NADH pela transferência de 2 elétrons e 2 íons hidrogênio pela 
desidrogenase a partir de uma diversidade de substratos (somente 1 dos 2 íons hidrogênio participa 
no exemplo mostrado acima). 
 
 
Reação normal. Aqui, o NAD+ é reduzido a NADH. O H+ recebido (em negrito) é reduzido na presença 
da enzima desidrogenase e o NADH é usado para reduzir outros compostos. 
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Análogo sintético da coenzima. O TCC aceita um íon H+ e 2 elétrons de maneira similar ao NAD+ 
(inibição competitiva). Consequentemente, o TCC é reduzido para trifenilformazan na presença da 
enzima desidrogenase. No entanto, diferente do NADH, o TPF não é metabolizado. Isso envenena o 
sistema, mas torna possível a medida da atividade metabólica pela visualização e medida da 
coloração vermelha. 
 
Após incubação, as amostras de solo são tratadas com um solvente (etanol ou metanol) para a extração 
do TPF. Seguindo a extração, a concentração de TPF no solo é determinada por espectrometria. O 
analito dissolvido (TPF) absorve luz na região de comprimento de onda de 485 nm. Sobre um certo 
limite de concentração, a absorbância a 485 nm é uma função linear da concentração de TPF extraído 
na solução do solvente (etanol ou metanol). 
 
1.3 Experimento 
 
P R I M E I R A E T A P A 
1. Para cada tipo de solo, pesar 6 g (peso seco) 
em cada um dos 4 tubos com tampa. 
2. Em 2 tubos (duplicata) adicione 0,5% de 
glucose (p/p solo). Nos outros 2 tubos não 
será colocada glucose. 
3. Faça um tubo branco no qual não será 
colocado solo. Isso resultará em: 4 tubos com 
solo para cada tipo de solo e 1 tubo para o 
branco. 
4. Adicione 1 mL de TCC 3% (p/v) e 2,5 mL de 
água deionizada em cada um dos tubos, 
incluindo o tubo do branco. 
5. Misture bem o solo com uma espátula ou 
bastão de vidro, e tampe os tubos (estes 
Materiais primeira etapa: 
 Amostras de solo fresco (6 g cada) 
 1 tubo plástico com tampa (para o branco) 
 4 tubos plásticos com tampa para as amostras 
de solo 
 Pratos de pesagem 
 Espátula ou bastão de vidro 
 Água deionizada 
 Glucose 
 1 mL de TTC 3% (p/v) para cada tubo 
plástico 
 Micropipeta de 1 mL 
 Pipetadores tipo pera 
 Pipetas de vidro (1, 2 e 5 mL), duas de cada 
 Balança semi-analítica (±0,01g) 
 
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devem preferencialmente ser selados para evitar a entrada de O2 do ar). Um pequeno excesso 
de água pode aparecer logo acima da superfície do solo no tubo. 
6. Incube os tubos durante 24h ou 1 semana (dependendo dos dias da aula prática). 
 
S E G U N D A E T A P A 
1. Colocar em cada tudo 10 mL de metanol ou 
etanol (caso seja metanol fazer procedimento 
em capela) 
2. Misturar bem com agitador, filtrar a mistura 
com papel filtro e coletar o filtrado em um 
frasco Erlenmeyer de 50 mL. 
3. Lavar o tubo e funil contendo o sedimento 
com mais 10 mL de etanol até o filtrado ficar 
sem a coloração vermelha. Adicione mais 
etanol até completar o volume para 50 mL. 
4. Utilize os dados mostrados na tabela abaixo 
para realizar uma curva padrão de TPF 
(µg/mL). Caso as leituras estejam com valores 
fora dos limitesde calibração da tabela, 
pode-se diluir uma alíquota do extrato com 
etanol em um frasco volumétrico. 
5. Transfira um volume adequado de cada amostra para uma cubeta. Faça a leitura da absorbância 
num espectrofotômetro a 485 nm utilizando o tubo branco com zero. Rinçar as cubetas entre a 
leitura das amostras com etanol 70%. 
6. Expressar os resultados como g TPF/g solo seco. Anote a média das duplicatas. Coloque os dados 
em uma tabela com os valores para cada solo pela alteração realizada. 
 
 
 
 
1.4 Potenciais riscos 
 
o Manipulação de etanol/etanol. Altamente inflamáveis. Cuidado principalmente com o metanol 
evitando contato com a pele e sua inspiração. 
o Evite contato da solução de TTC com a pele. 
 
 
 
[TPF] (ug/ml) Abs485
0 0
5 0,214
10 0,423
15 0,642
20 0,833
25 1,051
30 1,244
Materiais segunda etapa: 
 Solos incubados da primeira etapa 
 Metanol ou etanol 
 Proveta graduada de 10 mL 
 Funil de filtração 
 Papel filtro Whatman® #42 
 Provetas de 50 mL 
 Pipetas de 5 mL 
 Cubetas 
 Espectrofotômetro (comprimento de onda 485 
nm) 
 Papel para limpar cubetas 
 Frasco para descarte das soluções 
 Pissete com etanol 70% 
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1.5 Questões 
 
1. O que é a enzima desidrogenase? 
2. Qual a vantagem de se utilizar essa enzima com relação a celulase por exemplo? 
3. Reportar a atividade desidrogenase para cada solo explicando os resultados obtidos. 
4. Como a adição de glucose influencia os resultados? Qual sua função? 
5. Que outro composto poderia ser utilizado como estimulador? 
6. Se por exemplo amido fosse utilizado como estimulador, quais seriam os possíveis resultados? 
7. Qual a vantagem de se utilizar a glucose como estimulador nesse tipo de análise da atividade 
desidrogenase? Em que tipo de solos pode ser aplicada? 
8. Cite os possíveis erros que podem ter ocorrido durante a análise. 
 
1.6 Referências 
 
Casida, L.E., Jr. (1977) Microbial metabolic activity in soil as measured by dehydrogenase determinations. 
Applied and Environmental Microbiology 34, 630–636.