Hexocinase-2 e o Efeito Warburg no Câncer

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Hexocinase-2 ligada às mitocôndrias: ligação estigiana do câncer ao "efeito Warburg" e um alvo essencial para uma terapia eficaz
A característica metabólica mais comum dos tumores malignos, ou seja, o "efeito Warburg" é a propensão a metabolizar glicose em ácido lático a uma taxa alta, mesmo na presença de oxigênio. O ator principal nesse fenótipo frequente de câncer é a hexoquinase ligada às mitocôndrias [Bustamante E, Pedersen PL. Glicólise aeróbica alta de células de hepatoma de rato em cultura: papel da hexoquinase mitocondrial. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74 (9): 3735-9; Bustamante E, Morris HP, Pedersen PL. Metabolismo energético das células tumorais. Requisito para uma forma de hexoquinase com propensão para ligação mitocondrial. J. Biol Chem 1981; 256 (16): 8699-704]. Agora, nas clínicas em todo o mundo, esse fenótipo proeminente forma a base de um dos sistemas de detecção mais comuns de câncer, a tomografia por emissão de pósitrons (PET). Significativamente, HK-2 é a principal isoforma da hexoquinase ligada expressa em cânceres que exibem um "efeito Warburg". Isso inclui a maioria dos cânceres que metastatizam e matam seu hospedeiro humano. Ao se posicionar na membrana mitocondrial externa, o HK-2 também ajuda a imortalizar as células cancerígenas, foge da inibição do produto e obtém acesso preferencial ao ATP recém-sintetizado para a fosforilação da glicose. O último evento aprisiona esse nutriente essencial dentro das células tumorais como glicose-6-P, algumas das quais são canalizadas para servir como precursores de carbono para ajudar a promover a produção de novas células cancerígenas enquanto muito é convertido em ácido lático que sai das células. A acidez resultante provavelmente evita uma resposta imune enquanto prepara os tecidos circundantes para invasão. Com o ressurgimento e a aceitação do “efeito Warburg” como um fenótipo proeminente da maioria dos cânceres clínicos e do “direcionamento metabólico” como uma estratégia terapêutica racional, vários laboratórios estão se concentrando nas etapas de entrada ou saída de metabólitos. Uma notável história de sucesso [Ko YH, Smith BL, Wang Y, Pomper MG, Rini DA, Torbenson MS, et al. Cânceres avançados: erradicação em todos os casos usando terapia com 3-bromopiruvatos para esgotar o ATP. Biochem Biophys Res Commun 2004; 324 (1): 269-75] é o uso da pequena molécula 3-bromopiruvato (3-BP) que entra e destrói seletivamente as células de grandes tumores em animais, visando tanto a HK-2 quanto a ATP mitocondrial sintase. Isso leva ao esgotamento muito rápido do ATP e à destruição de tumores sem causar danos aos animais.
Palavras-chave: Warburg, Câncer, Hexocinase-2, análise PET, 3-Bromopiruvato, Terapia para câncer
2. Descoberta da importância excepcional do HK-2 no metabolismo do câncer, isto é, no "efeito Warburg"
A glicose é um metabólito essencial, tanto como fonte principal de moeda de energia celular quanto fonte precursora de carbono para a biossíntese (anabolismo) nos tecidos de mamíferos. A maioria dos tecidos normais metaboliza glicose de 6 carbonos em piruvato de 3 carbonos ("glicólise") e, em seguida, aproveita a energia dessa molécula na forma de ATP por meio de "fosforilação oxidativa" nas mitocôndrias. Isto é, eles oxidar o piruvato em CO 2 e H 2 O utilizando o ciclo de ácido tricarboxilico e a cadeia de transporte electrónico mitocondrial, e, em seguida, utilizar a energia livre resultante de conduzir o synthasome ATP (ATP sintase / Pi Transportador / Adenina Nucleotide portador complexo) para fazer de ATP a partir de ADP ligado e P i na presença de Mg ++. Em nítido contraste, numerosos tumores ao utilizar suas mitocôndrias dependem muito mais (às vezes de 50 a 70%) da conversão glicolítica muito menos eficiente da glicose 6-carbono em ácido lático 3-carbono [ 8 ]. Significativamente, esta ocorre mesmo na presença de tecido amplo (de tumor) de oxigénio, isto é, sob condições em que se poderia esperar de piruvato de introduzir as mitocôndrias com subsequente oxidação em CO 2 e H 2 O. Este fenótipo único, isto é, metabolismo aumentado de glicose O ácido lático, mesmo na presença de oxigênio, foi descrito pela primeira vez por Otto Warburg há mais de 8 décadas [ 9 ] e é comumente chamado de "efeito Warburg" [ 8 - 11 ] ( Fig. 1 ).
Figura 1
Canalização metabólica da glicose dentro de uma célula tumoral altamente glicolítica. A glicose trazida através da membrana plasmática pelos transportadores de glicose é rapidamente fosforilada pelo HK-2 ligado ao VDAC localizado na membrana mitocondrial externa. O VDAC canaliza o ATP gerado pelo complexo ATP-sintase (ATP-sintase; translocador de nucleotídeo de adenina, ANT; transportador de fosfato inorgânico, PiC) na membrana mitocondrial interna, facilitando o acesso direto do ATP ao HK-2 ligado ao VDAC. Para manter a alta taxa de metabolismo glicolítico nos tumores e sua capacidade de proliferação, o produto G-6-P distribui-se rapidamente principalmente através de duas principais vias metabólicas; (a) entrada de G-6-P no shunt de pentose-fosfato para biossíntese de precursores de ácidos nucléicos e (b) conversão do G-6-P através da via glicolítica em ácido pirúvico. A maior parte do ácido pirúvico é reduzida a ácido lático e transportada para fora da célula tumoral através de transportadores de lactato {B}. Isso promove um ambiente desfavorável para as células normais circundantes com regeneração concomitante de NAD+ dentro das células para manter a glicólise. Um pouco de piruvato é direcionado para mitocôndrias através do VDAC e por meio do transportador de piruvato "ainda não caracterizado" na membrana mitocondrial interna {A}. Isso fornece substratos para o ciclo do ácido tri-carboxílico (TCA) para geração de energia, bem como a biossíntese de lipídios e aminoácidos (não mostrada).
Os componentes proteicos fundamentais que persuadem os tumores malignos a vasculhar e metabolizar a glicose a uma taxa anormal foram descobertos mais de cinco décadas mais tarde em estudos bioquímicos rigorosos [ 12 , 13 ], o primeiro dos quais testou o “efeito Warburg” dos tumores na presença de glicose ou galactose. Significativamente, foi observada uma taxa muito mais baixa de conversão glicolítica em ácido lático com galactose. Como a única diferença entre o metabolismo dos dois substratos é que a glicose entra na glicólise através da hexoquinase enquanto a galactose ignora essa enzima, concluiu-se que a glicólise é aumentada nos tumores malignos por uma forma de hexoquinase. O mesmo estudo [ 12] também confirmaram que a hexocinase do tumor está ligada às mitocôndrias (membrana externa), permitindo que ela escape da inibição potente do produto G-6-P e obtenha acesso preferencial ao ATP recém-gerado. No segundo estudo [ 13 ], foi mostrado que quando mitocôndrias tumorais contendo hexocinase ligada são adicionadas ao citosol hepático sem mitocôndrias, essa é a única adição enzimática necessária para elevar a taxa glicolítica muito baixa (quase desprezível) desse tecido normal até o nível mais alto catalisada pelo citoplasma do tumor.
Significativamente, uma descoberta posterior no mesmo laboratório [ 14 ] revelaria que a HK-2, a isoforma predominante sobre-expressa em tumores malignos, está estrategicamente localizada na proteína da membrana mitocondrial externa "VDAC", canal de ânion dependente de tensão ( Fig. 1) Aqui, o HK-2 obtém acesso preferencial ao ATP gerado mitocondrial por meio do translocador de nucleotídeo de adenina mitocondrial (ANT) e proteção contra inibição pelo seu produto G-6-P. Assim, os tumores superproduziram HK-2 de maneira inteligente e neutralizaram sua capacidade de ser controlada, forçando a reação entre o ATP e a glicose recebida para produzir G-6-P a uma taxa alta. Por sua vez, isso força a glicólise e as vias metabólicas biossintéticas nos tumores a funcionarem com uma capacidade aprimorada, fornecendo suporte ideal para a proliferação descontrolada de tumores nos tecidos do hospedeiro [ 10 , 14 - 16] Além disso, o ácido secretado pelo tumor provavelmente ajudaa pavimentar o caminho para esse processo, suprimindo os ataques do sistema imunológico, preparando células normais para invasão ou ambas.
3. Principais eventos que levaram à descoberta de que a etapa metabólica da HK-2 pode ser usada para monitorar cânceres clínicos via análise PET
Após a descoberta em 1977 [ 12 ] de que uma forma ligada à mitocôndria de hexoquinase é o principal agente do "efeito Warburg" no câncer, uma tecnologia de rastreamento diagnóstico recém-desenvolvida capitalizou essa descoberta para detectar cânceres não invasivos em humanos. Assim, em 1982 e 1983, um análogo "desoxi" da glicose (2-desoxi-dglucose) que pode ser fosforilado pelo HK-2, mas não metabolizado mais, e que foi rotulado com o emissor de pósitron 18 F ( 18 FDG), foi usado com sucesso para a imagem de câncer pela primeira vez em pacientes humanos [ 17 , 18 ]. Esta tecnologia de imagem agora é amplamente conhecida como p ositron e missão t omography ( 18O FDG-PET) é utilizado mundialmente em seres humanos para detectar todos os tipos de tumores malignos e monitorar seu tratamento. Esses "resultados finais" não apenas confirmam a universalidade do fenótipo glicolítico alto ("efeito Warburg") de tais tumores, mas também demonstram como uma descoberta simples, mas essencial, por cientistas biomédicos básicos [ 12 , 13 ] trabalhando independentemente dos médicos, pode levar a aplicações clínicas de profunda utilidade para o mundo inteiro.
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4. A justificativa metabólica para a propensão dos tumores a expressar seletivamente HK-2
Há três razões prováveis: (1) com base nas relações de ligação descritas no “Antecedentes”, é óbvio que a seleção de hexocinases sobre glucocinase (HK-4) será bastante favorável do ponto de vista metabólico, como isoformas de o primeiro pode aproveitar a glicose com afinidade 100 vezes maior que o último; (2) a seleção HK-2 em vez de HK-3 e HK-4 é provavelmente devida ao fato de que HK-2, em contraste com essas isoformas, possui um domínio hidrofóbico N-terminal que permite a ligação à membrana mitocondrial externa VDAC proteína (s). A ligação de HK-2 a VDAC (s) fornece vários "benefícios cinéticos" que facilitam a reação da hexoquinase. Assim, a afinidade de ligação do HK-2 ao ATP é aumentada (cerca de 5 vezes) [ 19 ]. Torna-se insensível à inibição do produto (G-6-P) [ 12 ,13 ] e obtém acesso preferencial ao ATP gerado mitocondrial que provavelmente permeia o (s) VDAC (s) em seu caminho para o citoplasma [ 20 ]. (3) Considerando HK-1 e HK-2, os quais abrigam dois domínios equivalentes à glucoquinase, é apenas o HK-2 que retém a atividade catalítica em ambos os domínios [ 3] Portanto, com base no exposto acima, é bastante evidente por que um tumor que deseja o fluxo glicolítico máximo selecionaria HK-2. Finalmente, como nota lateral, o HK-2 pode ser considerado também o mais "sênior" das hexocinases, pois ainda abriga dois locais catalíticos que surgiram de uma "glucocinase ancestral". Quando várias isoformas enzimáticas estão disponíveis para expressão específica do tumor, geralmente a forma mais ancestral é selecionada, pois elas tendem a abrigar uma especificidade mais ampla do substrato, inibição reduzida do produto, maior afinidade pelo substrato e / ou maior poder catalítico.
5. Descobertas que revelaram que o promotor do gene HK-2 do tumor é altamente "promíscuo" ao facilitar a regulação positiva da transcrição sob estados metabólicos adversos e favoráveis ​​do hospedeiro
Vários estímulos sistêmicos e celulares promovem a expressão específica e a regulação positiva da transcrição da HK-2 (e em menor extensão da HK-1) ​​em tumores malignos altamente glicolíticos. A primeira indicação para a transcrição aprimorada veio através de estudos de expressão de mRNA baseados em Northern Blot [ 21 - 24 ]. Eles revelaram um aumento de aproximadamente 100 vezes nos níveis de mRNA para HK-2, sugerindo fortemente a ativação e a regulação positiva da transcrição do gene HK-2. Com base nessas descobertas iniciais, tornou-se importante focar na caracterização dos elementos reguladores no promotor do gene HK-2, que até 1990 haviam sido relatados apenas para HK-4 (glucocinase) [ 25 ]. Significativamente, a primeira análise de clonagem e sequência do promotor proximal de HK-2 [ 23] revelaram elementos cis bem definidos para o início da transcrição (elementos TATA e CAAT), indicando que a transcrição é fortemente regulada por estímulos celulares (em oposição a um gene de “limpeza” que carece dos elementos de iniciação). Inesperadamente, os elementos cis para ativação pela proteína cinase-A (PKA) foram os elementos cis mais proximais próximos ao local de início da transcrição, subvertendo amplamente a “expectativa de livros didáticos” de que a hexoquinase é sub-regulada pelo hormônio glucagon (ou seja, sob condições de inanição ou baixos níveis de glicose no sangue no hospedeiro) ou por eventos de sinalização iniciados por glucagon (isto é, a via de PKA iniciada por cAMP) [ 23] Como esperado, as vias da proteína quinase-C (PKC / RAS) (ativadas pela insulina ou glicose alta) e, mais significativamente, os elementos de resposta para hipóxia (HIF-1) e p53 também foram localizados no promotor [ 23 , 26 , 27 ] . A análise funcional via análise do gene repórter revelou modulação do promotor do gene HK-2 por glicose, hipóxia, análogos cAMP e insulina, com os dois últimos implicando tacitamente o envolvimento das vias de PKA e PKC na regulação positiva dessa isoforma em tumores [ 23 , 28 ] Uma vez que os motivos da sequência de elemento cis para resposta à glicose e insulina ainda não foram caracterizados, suas localizações ou identidades precisas no promotor HK-2 ainda não foram identificadas.
Significativamente, as descobertas acima ajudaram a racionalizar a expressão seletiva de HK-2 por tumores malignos como parte de um mecanismo de sobrevivência inteligente que permitiu que o tumor continuasse metabolizando glicose, independentemente do estado nutricional do hospedeiro portador de tumor. De fato, agora pode-se inferir por que, mesmo nos estágios terminais da progressão do câncer em um paciente (isto é, caquexia induzida por tumor), o tumor continuará eliminando a glicose da corrente sanguínea do paciente e prosperando enquanto a fisiologia do paciente é progressivamente desligada.
A presença ou ausência de elementos cis específicos entre os promotores HK-2 e HK-1 ajuda a explicar a expressão predominante de HK-2 em tumores malignos que exibem o alto fenótipo glicolítico na presença de oxigênio, ou seja, o efeito Warburg. Este argumento também é suportado quando a região promotora proximal das duas hexoquinases está alinhada quanto à similaridade [ 29 ]. No geral, a presença de elementos cis "de suporte à glicólise" no promotor HK-2 é amplamente adequada para fornecer uma resposta maior na célula tumoral em resposta a estímulos fisiológicos externos, resultando em maior síntese de HK-2, o que, por sua vez, facilita e mantém um alto fluxo de glicose no tumor.
6. Fatores epigenéticos e genéticos envolvidos na super-expressão acentuada de HK-2 em tumores - descobertas que revelaram que nas células cancerígenas do fígado que exibem um efeito Warburg pronunciado, o gene HK-2 está sujeito tanto à regulação epigenética quanto à regulação por amplificação
A análise da sequência e a comparação dos promotores de HK-2 do tecido normal (hepatócitos) e um tumor maligno (hepatoma AS-30D) que exibe um efeito robusto de Warburg falharam em identificar diferenças significativas de nucleotídeos. Menos de 1% das posições dos nucleotídeos foram alteradas e não estavam em regiões críticas que abrigam elementos cis [ 30 ]. Além disso, com base nos dados disponíveis ( www.ncbi.nlm.nih.gov), sabe-se que cada uma das quatro isozimas da hexoquinase é codificada por diferentes locos cromossômicos. Em humanos, os genes da hexoquinase HK-1-4 estão localizados nos braços do cromossomo 10q22, 2p13, 5q35 e 7p15, respectivamente. Portanto, nenhuma das hexoquinases surge como resultado de eventos alternativos de splicingde éxons de um único locus cromossômico ou ocorre devido a rearranjos ou deleções cromossômicos. Esse conhecimento implica eventos epigenéticos (por exemplo, desmetilação) e / ou amplificação de genes como desempenhando um papel significativo na regulação positiva da expressão do gene HK-2 durante a tumorigênese.
Recentemente, foi demonstrado que o promotor HK-2 sofre alterações epigenéticas durante a hepato-carcinogênese [ 30 ]. Aqui, a HK-4 (glucocinase), com baixa afinidade pela glicose, é expressa exclusivamente no tecido normal (fígado), enquanto a HK-2, com alta afinidade pela glicose, é marcadamente expressa durante a transformação maligna no hepatoma AS-30D altamente glicolítico [ 8 , 10] Significativamente, a análise de metilação do DNA cromossômico na região promotora do gene HK-2 de hepatócitos normais e células de hepatoma AS-30D revelou padrões diferentes. Essa evidência foi apoiada pela análise da pegada por metilação mediada por bissulfito, que revelou 18 locos CpG metilados em uma ilha CpG (-350 a +781 bp) no gene expresso por hepatócitos, enquanto nenhum deles foi encontrado no hepatoma. Embora esses resultados indiquem que um dos eventos epigenéticos envolvidos na superexpressão do gene HK-2 durante a tumorigênese é a desmetilação, os estudos atualmente em andamento deverão ser concluídos para identificar completamente todos os eventos epigenéticos envolvidos.
Outro fator que pode regular positivamente a expressão de HK-2 durante a tumorigênese é a amplificação gênica. Aqui a história é muito clara com os dados disponíveis, mostrando que este último desempenha um papel muito significativo na expressão aprimorada de HK-2 no hepatoma AS-30D altamente glicolítico. Isso foi demonstrado tanto pela análise de Southern blot quanto pela hibridação in situ por fluorescência (análise FISH) de hepatócitos e DNA cromossômico do hepatoma. Significativamente, o gene HK-2 é amplificado em pelo menos cinco vezes em relação ao dos hepatócitos normais [ 31] Esta amplificação genética estava localizada no mesmo braço cromossômico, com a ausência de rearranjos genéticos. Esses achados acrescentam outra faceta aos múltiplos eventos celulares e genéticos que facilitam a ativação e a superexpressão de HK-2 em tumores altamente malignos em apoio ao efeito Warburg, ou seja, alta glicólise para lactar, mesmo na presença de oxigênio. Faltam evidências de eventos semelhantes que apóiem ​​a expressão menos proeminente de HK-1 em tumores.
Em contraste com tumores como o hepatoma AS-30D, deve-se notar que a maioria dos tecidos normais de mamíferos, como o fígado, expressa muito pouco HK-2, com os de músculo, adipócitos e pulmão, expressando níveis baixos, mas significativos [ 1 , 3 ]
7. HK-2 como um possível regulador de fluxo metabólico e bioenergético de tecidos normais que é disfuncional nos tumores
Com seu acoplamento metabólico íntimo à produção de ATP mitocondrial (e a entrada de ADP nas mitocôndrias através de "porinas", por exemplo, VDACs), a HK pode ser considerada um regulador metabólico que equilibra de perto os fluxos entre a glicólise e a respiração mitocondrial, conforme discutido em uma revisão recente de Wilson [ 3] Em essência, em tecidos normais em que a HK-2 é silenciosa ou expressa em níveis baixos, a taxa de fosforilação da glicose recebida via HK-1 pode ser coordenada com a taxa de fosforilação oxidativa mitocondrial, de modo que nem a glicólise (neste caso, glicose para o fluxo metabólico do piruvato) nem a fosforilação oxidativa (fluxo do piruvato para o ATP) fica "fora de sintonia" com o outro. No entanto, uma taxa excessiva de glicólise resultante da superexpressão de HK-2 resultaria na geração de ácido lático (via desidrogenase lática) causando acidose láctica nos tecidos. Este parece ser o caso no tecido tumoral,32 - 34 ]. Embora não seja completamente claro como a transformação de uma célula normal em uma célula tumoral atinge esse desacoplamento calculado entre o fluxo glicolítico e a respiração mitocondrial, parece que fatores ambientais e / ou dietéticos que afetam a regulação epigenética da HK-2 podem estar intimamente envolvido.
8. A descoberta de que o HK-2, além de seus papéis relacionados ao crescimento no câncer, também ajuda a imortalizar as células cancerígenas
Como observado acima, o HK-2 está localizado predominantemente na membrana mitocondrial externa, onde está ligado a uma ou mais proteínas VDAC. Vários estímulos metabólicos e relacionados à transdução de sinal foram implicados na regulação da ligação da hexocinase-VDAC, incluindo lactato intracelular, pH, ATP / ADP, casais de metabólitos glicose / glicose-6-fosfato e proteína quinase-B (PKB / Akt) [ 35 - 37 ], entre outros. Além de ser crítica para o metabolismo único de muitos cânceres, acredita-se que as interações hexoquinase-mitocondrial são cruciais também para promover a sobrevivência ao câncer por meio da modulação de eventos de sinalização relacionados à apoptose [ 38 - 41] Entre as moléculas de sinalização celular, a serina / treonina-quinase Akt (proteína-quinase B; PKB) é um importante efetor intermediário da sobrevivência celular mediada por fator de crescimento. É também um mediador chave da via metabólica glicolítica [ 38 , 42 , 43 ]. Estudos de Hay e colaboradores [ 38 ] mostraram que o Akt ativado funciona como um potente fator anti-apoptótico na presença de glicólise robusta, com o casal hexocinase-VDAC funcionando como um efetor a jusante do Akt [ 38 ]. Membros da família de proteínas BCL2, que são anti-apoptóticas (por exemplo, Bcl, Bcl-X L) ou proapoptóticos (por exemplo, Bax, Bak, Bad), regulam o processo acima por suas interações com os oligômeros de proteínas / canais de proteínas que controlam a transição de permeabilidade da membrana mitocondrial (TMF) associada à indução de apoptose ( Fig. 2 ).
Figura 2
Estratégias de direcionamento metabólico contra tumores malignos que dependem de HK-2 facilitaram o fluxo glicolítico. O análogo de piruvato 3-Br-piruvato após a entrada nas células tumorais inibe a função da hexoquinase-2 {1} e do ATP-sintase (ATP-sintase / nucleotídeo de adenina transportadora de nucleotídeos / complexo transportador de fosfato) {2}. Os análogos peptídicos do terminal N HK-2 ou clotrimazol, bifanazol ou jasmonato de metila de pequenas moléculas podem desalojar o HK-2 do VDAC {1}, privando o HK-2 do acesso direto ao ATP gerado mitocondrial e negando a tolerância ao G- Inibição do produto mediada por 6-P. O efluxo de lactato pelos transportadores de monocarboxilato (MCTs) pode ser inibido por meio de derivados de ácido cinâmico de moléculas pequenas, isto é, ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico {3} ou silenciado por siRNA; as isoformas de lactato desidrogenase (LDH) específicas do tumor podem ser silenciadas via siRNA {4}; o dicloroacetato análogo de piruvato (DCA) pode ser administrado para inibir a piruvato desidrogenase quinase mitocondrial (PDHK) {5}, o que impede a "inativação" da piruvato desidrogenase mitocondrial (PDH). O PDH "ativo" facilita uma alta taxa de influxo de piruvato nas mitocôndrias, com regulação positiva concomitante do ciclo TCA, resultando em um status redox tumoral-mitocondrial alterado; a piruvato-quinase específica do tumor (PK) pode ser silenciada via siRNA para alterar o fluxo glicolítico, inibindo a formação de piruvato {6}. Cada uma das etapas acima, que tem como alvo HK-2, a primeira etapa da via glicolítica, ou força a reorientação do piruvato nas etapas finais da mesma, resulta em um status metabólico altamente perturbado nas mitocôndrias do tumor.c ao citoplasma, que por sua vez ativa cascatas apoptóticas nas células tumorais alvo (MPTP, poro de transição da permeabilidade mitocondrial).
O fenótipo anti-apoptótico é proposto para ser modulado por dois mecanismos; (1) aprimoramento da afinidade de ligação a HK-VDAC para aumentar a fração hexocinase ligada a mitocôndrias [ 38 ] e (2) mobilização do membro Bcl2 anti-apoptótico Bcl- XL para VDAC na membrana mitocondrial externa (OMM) [ 44 ] Significativamente, acredita-se que ométodo pelo qual Akt funciona como uma molécula de sinalização anti-apoptótica surge principalmente devido ao seu efeito positivo na ligação de HK-VDAC. De fato, a interrupção da interação HK-VDAC por caminhos não-Akt envolvidos, mesmo na ausência de ativação de fatores pró-apoptóticos, como Bax e Bak, induz apoptose [ 45] O mecanismo preciso permanece desconhecido. De fato, a literatura mais recente usando células “knockout para genes” sugere que o VDAC nem sempre pode estar envolvido na indução de apoptose, ou seja, pode haver outras maneiras de morrer [ 46 , 47 ].
9. Direcionar tumores para destruição silenciando o transcrito HK-2 ou via inibição da enzima mediada por pequenas moléculas
Com base nos fatores discutidos acima, é bastante evidente que o "knock down" ou o silenciamento da expressão de HK-2 devem ter um efeito deletério na proliferação tumoral. Isso foi avaliado primeiro por meio de abordagens de RNA anti-sentido contra HK-2, onde mensagens anti-sentido contra HK-2 foram expressas por transdução mediada por retroviral em células de hepatoma maligno (Mathupala e Pedersen, Proc Am Assoc Can Res 1999: 22 (resumo). # 145)). Neste estudo, embora tenha sido inicialmente observada uma redução drástica na proliferação tumoral, quando a mensagem HK-2 foi silenciada, após passagem contínua, os tumores alvo se recuperaram, provavelmente por regular ou estabilizar a mensagem HK-2. Assim, esses estudos preliminares indicaram a propensão dos tumores a compensar rapidamente quaisquer efeitos deletérios no nível transcricional;
Isso foi realizado posteriormente, alguns anos depois, utilizando um análogo de molécula pequena "não metabolizável" do piruvato, 3-bromopiruvato [ 48 ] para atingir simultaneamente o HK-2 ligado às mitocôndrias (entre outras hexocinases) e o próprio metabolismo mitocondrial. Tais estudos demonstraram claramente que essa estratégia de direcionamento HK-2 / mitocondrial baseada em moléculas pequenas é altamente eficaz em modelos animais implantados em tumores para melhorar o fenótipo "Warburg" para provocar a morte de células tumorais ( Fig. 3 ). De fato, os cânceres avançados em todos os 19 animais submetidos ao tratamento com 3-bromopiruvato foram erradicados [ 49 ]. Atualmente, estudos pré-clínicos utilizando 3-bromopiruvato contra uma infinidade de tumores estão sendo realizados em muitos laboratórios, por exemplo, [ 50, 51 ], indicando o interesse universal em aplicar essa estratégia de direcionamento metabólico para erradicar tumores malignos (que são freqüentemente refratários aos esquemas terapêuticos padrão).
Fig. 3
Potente efeito anticâncer do 3-bromopiruvato. Notavelmente, de todos os agentes anticâncer observados na legenda da Fig. 2 , o 3-bromopiruvato tem sido o mais eficaz na erradicação completa de tumores em animais imunocompetentes. Significativamente, esse minúsculo agente induz uma rápida perda de ATP celular nos tumores que exibem um forte efeito Warburg, e seu modo de ação se estende além dos efeitos apoptóticos em si e provavelmente envolve uma combinação de eventos apoptóticos e necróticos. Na figura 3-bromopiruvato erradica completamente um grande carcinoma hepatocelular de rato {A} que projetado em um humano {B} seria do tamanho de uma grande “toranja”. A erradicação completa foi obtida em 3 semanas sem recorrência {C}, o animal vivendo uma vida normal posteriormente. Histopatologia do tumor do animal não tratado {D}. No mesmo estudo, 18 outros animais foram libertados de câncer avançado. Todos os animais livres de câncer viveram uma vida normal sem retorno do câncer (permissão concedida pela Elsevier para reproduzir a Fig. 2 da referência [ 49 ]).
Vamos para:
10. Liberar HK-2 da âncora VDAC para interromper a glicólise tumoral
Com base nas inferências atuais sobre a interação HK-2 / VDAC na prevenção da apoptose tumoral, a interrupção da mesma deve facilitar a apoptose tumoral. Na verdade, isso foi testado com vários compostos que supostamente interrompem a interação VDAC-HK-2. Entre os compostos testados estão os compostos antifúngicos clotrimazol e bifanazol [ 52 ], jasmonato de metila [ 53 ] e seqüências peptídicas que correspondem ao terminal N HK-2 [ 45 , 46 ]. Em cada caso, foi observada indução de apoptose nos tumores alvo, indicando que essa estratégia de "liberação" também pode ser eficaz contra tumores altamente glicolíticos. No entanto, os últimos relatórios, pelo menos sobre o uso de clotrimazol [ 46] indicam que o efeito desses antifúngicos pode ser independente do envolvimento do VDAC. Assim, é necessária uma análise mais aprofundada da especificidade destes compostos no direcionamento da glicólise das células tumorais.
11. O penúltimo passo na glicólise - metabolismo mitocondrial do piruvato e efeito Warburg
Em contraste com as abordagens acima, outros examinaram a viabilidade de direcionar etapas alternativas da via glicolítica como um modo de interromper o metabolismo energético em tumores malignos [ 34 , 54 - 56 ] ( Fig. 2 ). Isso inclui (1) a inibição do efluxo de ácido lático de tumores, silenciando ou inibindo transportadores de lactato por meio de RNA interferente ou derivados de ácido cinâmico (ACCA) [ 34 , 55 , 56 ], (2) regulação positiva do influxo de piruvato para mitocôndrias inibindo a piruvato desidrogenase quinase (PDK) por meio do dicloracetato de 2-carbono "análogo de piruvato" (DCA) [ 54 , 57], (3) inibição de isoformas de lactato desidrogenase expressa em tumor (LDH) por interferência de RNA para inibir a conversão de piruvato em lactato, com aprimoramento concomitante do influxo mitocondrial de piruvato [ 58 , 59 ] e (4) alternar entre a isquemia por piruvato quinase expressa em tumor- formas, novamente através da interferência do RNA, para alterar a cinética da síntese do piruvato [ 60 ].
Baseando-se no HK-2 ligado às mitocôndrias para coagir a glicose nas etapas metabólicas em direção à respiração mitocondrial, a maioria desses estudos concentra-se no redirecionamento metabólico do piruvato para longe da formação de ácido láctico e de volta às mitocôndrias, a fim de perturbar os “aberrantes”. homeostase respiratória ”dos tumores. Das quatro estratégias acima, a estratégia de direcionamento de tumores mediada por DCA (regulando positivamente a entrada de piruvato mitocondrial) está atualmente em estudos clínicos de Fase I / II.
12. Comentários finais e perspectivas para o futuro
O trabalho de um punhado de grupos dedicados, se não teimosos, de metabolismo de tumores nas últimas sete décadas desvendou sistematicamente a coreografia bioquímica que existe entre as cascatas de transdução de sinal e as vias metabólicas nos tumores para promover malignidade (ou seja, proliferação). Um primeiro benefício para pacientes com câncer tem sido a utilização do alto influxo de glicose de tumores malignos via hexocinase ligada à mitocôndria (HK-2 e até certo ponto HK-1) ​​como uma ferramenta para desenvolver análogos de glicose radiomarcados para in vivoimagem de tumores via PET, que agora se tornou um modo universal de detecção e estadiamento de tumores. Com a constatação de que as interações hexocinase-mitocondrial são cruciais para a imortalidade do tumor e que os análogos do metabolito de pequenas moléculas podem perturbar os tumores por meio de vários "pontos-alvo" metabólicos, uma nova classe de potenciais terapias anticâncer apareceu no horizonte. Eles são capazes de usurpar o mecanismo metabólico aberrante dos tumores para redirecionar os metabólitos e causar autodestruição do tumor. A enzima sentinela que provavelmente facilitará o sucesso ou o fracasso dessas novas abordagens será a hexoquinase ligada à mitocôndria (predominantemente HK-2), situada entre os espaços citosólico e mitocondrial nas células malignas enquanto conduz o primeiro e comprometido passo da glicólise.
Notas de rodapé
☆ O SPM é suportado pela concessão NIH R01CA116257 e o PLP pela NIH concede R01CA08018 e R01CA010951. Além disso, YHK e PLP foram apoiados em parte por Grant BCTR0402523 da Susan Komen Breast Cancer Foundation, enquantoparte do trabalho discutido aqui foi realizado.