Exercicio técnicas de PCR, extração de DNA RNA

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1-Explique quais são as técnicas em seqüência realizada em laboratório de biologia molecular, resultando os seus respectivos setores.
Extração das moléculas – setor A
Quantificação: espectrofotometria, espectrofluorimetria e eletroforese – Setor D
PCR: PCR convencional e PCR tempo real – Setor C
Eletroforese – Setor D 
2- Explique quais são os principais cuidados realizados para extração das moléculas. Justifique o porquê desses cuidados. 
Uso de luvas de látex (cirúrgica), máscara, microtubos e ponteiras, recomenda-se que sejam descartáveis, pipetas, precisam ser esterilizados. Utilizar as soluções em água pura. Para que não contamine as amostras.
3- Em relação a extração DNA genômico, explique:
Quais são as soluções e suas aplicações em cada uma das etapas da extração;
1 – Lise das membranas lipídicas – rompimento da membrana celular e dos compartimentos membranosos, provocada por uma solução detergente - SDS
2 – Purificação do DNA – remoção dos componentes celulares proteínas organelas e restos celulares. Proteínase K – desnaturação das proteínas; Fenol – remove proteínas e outros contaminantes da solução aquosa do DNA; Clorofórmio – ajuda a desnaturar proteínas e a remover o fenol residual; NaCl2 – impede que as proteínas desnaturadas interaja com o DNA; EDTA–ajuda na inativação das nucleases, retirando o Mg
3 – Preciptação do DNA – DNA é insolúvel em álcool ,usa-se o etanol gelado para precipitar o DNA após retira-se o álcool para a formação de pellet.
4 – Reidratação do DNA – solubilização do DNA em solvente, H2O ultra pura ou TE. O solvente de reidratação servirá para armazenamento do DNA extraído. Armazenar DNA a 4° C (em TE) ou -20°C (maior tempo); RNA manter sempre no gelo quando manipulado e a -70°C (maior tempo).
Explique como é feito o armazenamento após a extração dessa molécula;
Explique as técnicas de espectrofotometria, espectrofluorimetria para obtenção da quatificação do DNA genômico;
Em relação a espectrofotometria, explique como é quatificado a massa do DNA extraído e o grau de pureza do DNA extraído. 
A quantificação ocorre pela medida de D.O. (densidade óptica) dos picos de absorbância em nm, do tipo de molécula com 260nm do DNA, 280nm da proteína.
Grau de pureza é a relação entre a quantidade de DNA e de proteína é usada como parâmetro para avaliação da qualidade do DNA extraído – DO 260 eDO280– Razão= 1,7- 2,0.
4- Em relação ao DNA mitocondrial, explique de que forma essa molécula é obtida?
Em ambiente estério, usando luvas e máscaras para evitar contaminação ter cuidado principalmente com contaminação pelas DNAses. A molécula é obtida através da lise dasmenbranas peptídicas, usando tampão de lise ; SDS, EDTA, NACL, e Proteina K.
5- Em relação a extração de DNA plasmidial, Explique;
a) A importância da extração dessa molécula para biologia molécula
É de grande importância dentro da Genética Forense
b) Explique qual é a técnica empregada para a lise da bactéria
6- Em relação a extração do RNA:
Explique quais são as etapas, as soluções e suas aplicações na extração dessa molécula.
1- Tratamento do DNA em tampão de extração com fenol ácido + guanidina.
2- Adição de clorofórmio ao tampão que vai solubilizar os lipídios e removelolos.
3- Centrifugação da amostra para obter 3 fases que são; 
- uma fase rósea- formada pelo fenol
- uma interfase- formada pelo cloroformio e DNA 
- uma fase aguosa onde esta o RNA
4-Preciptação do RNA pelo álcool isopropanol
5- Purificação- com etanol gelado e DNAse
6- Resuspender o pellet em agua DEPEC
Cite 2 vantagens na extração de RNA para biologia molecular. 
Idendtificação Humana e Diagnostico Molecular
7- Sobre a técnica de PCR convencional responda:
Explique em que consiste essa técnica;
Consiste em amplificar uma sequência específica de DNA, com o objetivo de torna-la abundante e disponível para diveras técnicas de biologia molecular.
Explique cada etapa e ciclo;
Desnaturação – O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado. Ou seja, ocorre a separação da dupla fita de DNA.
Anelamento – os iniciadores ou primers se ligam a fita de DNA que se pretende amplificar. Um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. São eles que irão identificar/marcar qual trecho de interesse do DNA deverá ser copiado.
Elongação – com o ponto de partida já identificado, a Taq polimerase liga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a. Inicia-se então a extensão do novo fragmento de DNA, formando novamente uma fita dupla de DNA.
Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até atingir milhões de cópias. Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado.
Explique sobre cada componente presente na solução máster mix;
Tampão – manter o pH alcalino , para manter a estabilidade do DNA, para que não desnature;
KCl e MgCl2 – cofatores importantes na polimerização
Nucleotídeos – se pareiam para a duplicação do DNA
Taq. DNA Polimerase – enzima que fará a elongação.
Explicar sobre a importância da eletroforese para esse método:
Separar a amostra por peso molecular e carga elétrica.
Explicar a escolha do tampão e do gel de agarose para a realização da eletroforese:
TAE e TBE, são os mais usados. TAE ajusta o Ph da solução que atuam como eletrolíticos para manutenção da corrente.O TBE tem melhor capacidade tamponante, mas deve ser evitado para purificação de DNA em géis.
Gel de agarose ou poliacrilamida, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas e este geralmente é decorrente do grau de polimerização entre os manômeros.
8- Sobre a técnica de PCR em tempo real, explique:
Em que consiste a técnica:
Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises.
O uso dos fluorófos:
Os fluorófolos são moléculas que absorvem e imitem luz em um comprimento de onda especifica. O PCR em tempo real, utilizam essas moléculas que proporcionam o acompanhamento da reação ao longo dos ciclos.
As principais vantagens em relação ao PCR convencional:
Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado. E permitem que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente