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* * * * http://www.youtube.com/watch?v=ZXt4pDVb2W0&feature=related http://www.youtube.com/watch?annotation_id=annotation_715147&feature=iv&src_vid=XuEOXwW6K88&v=2n4wnjQqWYQ * * * * E. coli 700nm 10nm 2nm 30nm * * Empacotamento de nucleossomes octâmero de histonas: 2X H2A H3 H2B H4 H1 e H5 * * * * Diminuição das cargas positivas das histonas por modificação de Lys X * Papel estrutural: empacotamento do DNA no núcleo papel regulatório: controle do acesso da maquinaria de transcrição: Exemplo: histonas acetilases histonas desacetilases Ligação de fatores de transcrição e Acetilação de histonas desempacotamento da cromatina ativação da expressão gênica Histonas desacetiladas cromatina fechada expressão gênica inativa * * Papel estrutural e regulatório da cromatina + +/- + - + * * Estrutura dos peptídeos Ubiquitina e SUMO Ubiquitina SUMO * * Nível 1 – Modificação da Cromatina * * Estrutura do DNA * * * * Estrutura do DNA 5’ 5’ 3’ 3’ * * * * * * * * Replicação do DNA DNA polimerase III http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0 * * Replicação do DNA * * DNA Circular DNA Linear * * Em levedura: ARS - Autonomously Replicating Sequence 5'(A/T)TTTAYRGTTT(A/T)3' (R = A or G, Y = C or T) Elementos-B - pequenos trechos de A ou T Em eucariotos superiores: Várias e não há sequências consensos para origem Em procariotos: Única e precisa localização Origens de replicação do DNA * * Orígem de replicação do DNA procarioto * * * * Orígem de replicação do DNA procarioto HU * * Orígem de replicação do DNA procarioto * * DNA Circular DNA Linear * * Orígens de replicação do DNA eucarioto * * Forquilha de replicação do DNA http://bcs.whfreeman.com/pierce1e/pages/bcs-main.asp?v=chapter&s=12000&n=00020&i=12020.03&o=%7C00510%7C00520%7C00530%7C00540%7C00550%7C00560%7C00570%7C00010%7C00020%7C00030%7C00060%7C00070%7C01000%7C02000%7C03000%7C04000%7C05000%7C06000%7C07000%7C08000%7C09000%7C10000%7C11000%7C12000%7C13000%7C14000%7C15000%7C16000%7C17000%7C18000%7C19000%7C20000%7C21000%7C22000%7C23000%7C99000%7C&ns=0 * * Forquilha de replicação do DNA * * a right hand Estrutura da DNA polimerase * * Topoisomerases I e II * * DNA Circular DNA Linear * * Replicação do DNA – Telomerase * * Replicação do DNA – Telomerase * * * * Contribuição da seleção de nucleotídeo e proofreading atividade na fidelidade da replicação do DNA * * * * * * < 30 mutações durante a vida de um homem A mutação só é deletéria se: - ocorrer em DNA codificador (30%) - se ocorrer nas 2 primeiras bases de um códon - se for dominante ou ocorrer nos dois alelos Contribution * * Proteínas HU – proteínas de procariotos similares às histonas dos eucariotos. É um tipo das chamadas proteínas associadas ao nucleoide ( ou NAPs). Existem várias proteínas diferentes e HU juntamente com IHF são consideradas as mais importantes para o dobramento do DNA. Structure Small, basic protein heterotypic dimmer (2 subunits:HUa and HUb) Mass 18kDa (each subunit for 9kDa) Character Heat-stable DNA binding protein Architectural nuclear protein Non-sequence specific DNA binding protein Nucleoid-associated protein Function Restrain DNA supercoiling Condense the chromosome Introduce negative supercoiling into circular relaxed DNA template with topoisomerase I Assist the action of DnaA protein in the initiation of DNA replication Regulate DNA replication process OBS: As Arqueas (que se separaram evolutivamente primeiro das bactérias e depois dos ancestrais dos eucariotos) possuem uma estrutura de cromatina intermediária entre as bactérias e os eucariotos. Isto é conseguido com uma variedade enorme de NAPs, incluindo Hu e histonas. * Cada nucleossoma tem aproximadamente 10 nm de diâmetro. Os octâmeros de histonas são enrolados por duas voltas de DNA ( aproximadamente 140 pb) e sepearados um dos outros por cerca de 20 a 60 pb. Nucleossomes são usualmente empacotados juntos com a histone (H1 ou H5,) para formar a fibra de 30nm. As histonas H2A, H2B, H3 e H4 são chamadas histonas centrais pois ficam no cerne dos nucleossomos. As histonas H1 ou H5 são chamadas histonas de ligação pois se ligam ao DNA espaçador entre os nucleossomos. Além das histonas a cromatina eucariótica contém várias proteínas chamadas Não histônicas. Dentre as proteínas não histônicas mais relevantes estão as chamadas HMG (high mobility group) e SMC (strutural maintenance of chromosomes) também chamadas de coesinas ou condesinas. As histonas possuem caudas N terminais ricas em lisinas, que são importantes na regulação do nível de empacotamento e portanto da atividade da cromatina. Estas caudas podem ser modificadas por acetilação, metilação sumoilação e fosforilação. Elas também interagem entre si durante a formação das fibras de 30 nm. * * * Ativadores podem se ligar em sítios de ligação de ativadores e recrutar histonas acetilases. Histonas acetiladas são reconhecidas por proteínas com bronodomínio. Estas proteínas recrutam, por sua vez, histonas acetilases disseminando a acetilação em nucleossomos vizinhos . Por outro lado histonas metiladas em resíduos específicos (por exemplo lisina 9 cauda da H3) agem como repressores da ativação por serem reconhecidos por proteínas com cromodomínios que impedem o acesso da maquinaria de transcrição. * Artigo original de Watson e Crick sobre a dupla hélice do DNA (Nature April 25, 1953) * * Tirinhas da Mafalda, personagem criada por Quino em 1964 Mafalda: A personagem principal, uma menina de 6 anos de idade, que odeia sopa e adora os Beatles e o desenho Pica-Pau. Ela se comporta como uma típica menina na sua idade, mas tem uma visão aguda da vida e vive questionando o mundo à sua volta, principalmente o contexto dos anos 60 em que se encontra. Filipe: Um sonhador que odeia a escola, mas que frequentemente trava intensas batalhas com sua consciência e seu senso nato da responsabilidade. Foi inspirado pelo jornalista Jorge Timossi, um amigo de Quino. * Fita lider ou contínua Fita lag ou descontínua Principais enzimas e proteínas envolvidas DNA polimerases Primase Helicase Girase Topoisomerase Proteína de ligação a fita simples * Origem de replicação. Nas bactérias só existe uma destas sequências. A rigor, a replicação completa do cromossomo de uma bactéria depende da iniciação nesta sequência. Neste caso, é dito que as bactérias tem apenas um replicon. Replicon é a unidade de DNA no qual a replicação ocorre a partir de uma origem. Já os eucariotos, por terem genomas bem maiores que as bactérias e mais de um cromossomo, têm várias origens de replicação. Nas leveduras (ex: Saccharomyces cerevisiae) existem pelo menos umas 500 origens de replicação, denominadas de ARS (Autonomously Replicating Sequences); ou seja, 500 replicons. Eucariotos superiores tem 10 a 100 vezes mais replicons, mas não há consenso de sequências. * * Somente origens metiladas nas duas ftas podem ser replicadas. origens hemimetiladas que acabaram de ser replicadas precisam ser metiladas por Dam metilases para tornarem-se ativas e permitirem a ligação de DnaA , e então Dna B -Dna C * DnaA – Reconhece a região da repetição de 9 nucleotídeos na origem de replicação e ligam-se à ela (é uma ligação cooperativa onde várias moleculas de DnaA se ligam a várias sequências de 9 pb). Com a ajuda da HU (que estabiliza a curvatura do DNA) desnatura a região; requer ATP. Dna B – É uma helicase. Com a ajuda de DNA C reconhece a região da origem ligando se a ela; requer ATP * Procariotos têm 5 DNA polimerases (I,II, III, IV e V, também chamadas de pol A, B, C, D e E), na qual a DNA polimerase III (polC) é a mais importante em termos de processividade; DNA polimerase I (pol A) remove os iniciadores e preenche os gaps; DNA polimerase II (pol B) tem atividade revisora; demais são importantes para síntese translesão. Eucariotos têm mais de 15 polimerases. As mais importantes em termos de processividade são alfa (associada a primase, lenta e revisora mais associada a síntese da fita lag) e delta (alta processividade com atividade de profereading mais associada a síntese da fita lider), mas outras são importantes para assegurar a fidelidade ou realizarem a síntese em condições especiais (síntese translesão, por exemplo). * Sliding clamp – Clamp loader – * DNA polimerase funciona como um dímero, que sintetisa ao mesmo tempo as duas fitas de DNA, ambas no sentido 5’ – 3’, porém uma na direção da forquilha de replicação e outra na direção contrária. * Topoisomerases I e II. São enzimas que promovem o relaxamento de estruturas superesperilizadas de DNA. Topo I produz quebras em uma das fitas do DNA, permitindo o giro da fita quebrada sobre a fita intacta. Não há necessidade de ATP. Topo II envolve quebras nas duas fitas de um segmento denominado gatted (G) e a translocação de um outro segmento denominado transportado (T) através da fenda produzida. Há envolvimento de ATP no processo. * Durante a replicação podem ocorrer erros de incorporação de bases geradas pela falta de seletividade das DNA polimerases. Todavia as DNA polimerases apresentam atividade de proofreading que é uma atividade exonucleásica que corrige o erro de pareamento de base. Tipos de correção: Seletividade dos nucleotídeos Reconhecimento do pareamento correto a 3’ – proof reading Reparo de erros de pareamento * O domínio catalítico das DNA polimerases de alta processividade causam em média 1 erro a cada 1000 ou 100000 bases replicadas. A atividade exonucleásica 3’-5’ ou atividade de proofreading das DNA polimerases delta e epsilon, de alta fidelidade, que deletam as bases incorporadas erroneamente, aumentam em média 10 a 200 vezes a fidelidade da da replicação. * Além da correção de bases incorporadas erroneamente durante a replicação de DNA, também há a correção de mismatch após a replicação por um sistema adicional de reparo chamado DNA mismatch repair. Neste caso endonucleases cortam a fita simples próxima do erro de pareamento. Há a remoção de uma ou mais bases que são substituídas por bases corretas. * Assim estes dos sistemas atuando juntos fazem com que ocorra 1 erro a cada 10 elevado a 10 bases. Esta taxa corresponde a uma mutação a cada 3 divisões celulares. Isto é muito baixo considerando que: - Dependendo do tecido, as células se dividem de 0 a 100 vezes em um organismo - A mutação será deletéria se: 1 – ocorrer em DNA codificador 2 – nas duas primeiras bases do códon 3 - se for dominante ou ocorrer nos dois alelos *