Clonagem de DNA: Conceitos e Técnicas

Prévia do material em texto

Clonagem de DNA 
CLONAGEM DE DNA 
• CLONAGEM: é multiplicar assexuadamente. 
 Na Biologia Molecular, significa mais especificamente crescer uma 
colônia de bactérias a partir de uma célula única. 
 
 Clonagem de genes é essencialmente o processo de amplificar 
seletivamente um gene particular, incorporando-o numa bactéria 
e clonando a bactéria. 
 
 Primeiros experimentos bem sucedidos de clonagem foram 
mostrados no início da década de 1970. 
Avanços conceituais e tecnológicos que contribuíram para a técnica de 
clonagem: 
 
• Na década de 60: identificação de pequenas moléculas de DNA circular 
denominadas plasmídeos, que carregam genes de resistência bacteriana a 
antibióticos. 
• No final da década de 60: descoberta e caracterização de endonucleases 
de restrição (Werner Arber, Hamilton Smith, Daniel Nathans; H. Smith e T. 
Kelly) 
• 1967: Gellert - purificação da enzima DNA ligase 
• 1972: Janet Mertz e Ronald Davis – usaram DNA ligase para juntar 
fragmentos digeridos com Eco RI. 
• 1972: o grupo de Paul Berg conseguiu inserir genes do bacteriofago l e 
genes de E. coli no genoma do virus SV40, construindo moléculas 
recombinantes 
Por que clonar? 
• Sequenciamento de DNA 
• Separar fragmentos de DNA em clones independentes 
• Estudar a transcrição e a tradução do gene 
• Fazer estudos de expressão funcional 
• Sintetizar proteínas para produção de anticorpos 
• Sintetizar proteínas para uso terapêutico 
• etc, etc 
Para clonar é necessário um VETOR 
Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA que tem 3 características 
fundamentais: 
 
• É capaz de replicar independentemente do cromossomo da célula hospedeira. 
• Organismos contendo o vetor devem poder se desenvolver preferencialmente 
em um dado meio, porque o vetor confere ao organismo alguma propriedade 
física ou química, ou ambas, que lhe permite este crescimento preferencial. 
• O vetor aceita a inserção de DNA adicional em sua molécula de DNA. 
Enzimas de restrição foram primeiramente identificadas pela sua 
capacidade de restringir o crescimento de certas viroses em 
algumas linhagens de E. Coli. Por isso, foram denominadas 
enzimas de restrição. 
 
Essas enzimas fazem parte do mecanismo natural de defesa das 
bactérias contra a invasão de DNA estranho. 
 
 
Enzimas de restrição 
Sítios de reconhecimento para enzimas de restrição são curtas sequências 
reconhecidas e clivadas por várias endonucleases 
Bactérias com endonucleases de restrição também têm as enzimas 
correspondentes que metilam as bases específicas no sítio de 
reconhecimento, assim o seu próprio DNA fica protegido de autodigestão. 
OH P 
OH P 
As enzimas de restrição catalizam a quebra da ligação fosfoéster 
(hidrólise) entre o oxigênio na posição 3’ de uma base, e o fosfato 
ligado ao oxigênio na posição 5’ da base seguinte. 
Enzimas de restrição 
Corte com extremidades rombas 
“blunt ends” 
Corte com extremidades coesivas “stick ends” 
5´ pendente 
ou 
3´ pendente 
A enzima se movimenta ao longo da “major groove” (difusão linear). 
Quando a seqüência específica é encontrada, há um notável rearranjo estrutural, tanto da 
enzima quanto do DNA. O DNA sofre uma dobra de cerca de 50o no centro do sítio de 
reconhecimento. 
Mg2+ é essencial para a hidrólise e entra no sítio catalítico apenas quando a seqüência alvo 
é encontrada. 
Eco RV endonuclease : 5’ G - A - T - A - T - C 3’ 
 3’ C - T - A - T - A - G 5’ 
Fragmentos produzidos pela clivagem dos ~36 kb do DNA genômico de 
adenovirus 2 com Eco RI e Hind III 
Exemplo de clivagem com enzima de restrição 
GAATTC 
CTTAAG 
AAGCTT 
TTCGAA 
Algumas endonucleases de restrição e seus sítios de reconhecimento 
As enzimas são nomeadas com as abreviações das linhagens de bactérias 
das quais foram isoladas 
As duas enzimas da técnica de clonagem de DNA: 
 
- Enzimas de restrição 
•1962 - Arber - ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
 
- DNA ligases 
•1967 – Gellert - DNA LIGASE 
 
Extremidades pendentes menores que 15 nucleotídeos não fornecem 
pareamentos estáveis na temperatura de 37oC. Para que os diferentes 
segmentos de DNA permaneçam juntos (o plasmídeo e o DNA que se quer 
clonar) é preciso restabelecer a ligação fosfoester com a LIGASE. 
Tipos de vetores usados para clonagem 
Os vetores de clonagem pertencem a duas classes gerais: 
 
 - Plasmídeos 
 
 - Fagos 
 
Clonagem de DNA usando plasmídeos 
como vetores 
Plasmídeos 
• Pequenas moléculas circulares de DNA dupla fita, não 
incorporadas ao genoma das bactéria 
• São formas autoreplicativas de DNA 
 
Todas as enzimas necessárias para a replicação de um 
Plasmídeo são produzidas pela bactéria hospedeira, 
embora proteínas codificadas pelo plasmídeo auxiliem na 
regulação de sua replicação. 
Plasmídeos utilizados para clonagem foram construídos a partir 
de fragmentos do plasmídeo pBR-322 de E. coli. 
• Todos os plasmídeos usados como vetor devem ter: 
• “REPLICATOR” ou origem de replicação 
• Marcador de seletividade 
• Sítio de clonagem 
Origem de replicação (replicator, replicon): é uma sequëncia específica do plasmídeo, com 
cerca de 1.000 pb, na qual tem início a replicação do DNA. Neste local há um conjunto de 
elementos regulatórios envolvidos no controle do número de cópias do plasmídeo que serão 
feitas numa única bactéria. 
 
No pBR322: replicon pMB1 - há produção de 15 a 20 cópias/célula 
No pBlue Script: forma mutada do mesmo replicon – há produção de 500 a 700 cópias/célula 
MARCADOR DE SELETIVIDADE 
O marcador de 
seletividade permite a 
identificação da 
bactéria que recebeu o 
plasmídeo. No vetor ao 
lado, são genes que 
codificam proteínas que 
degradam antibióticos. 
 
Amp: betalactamase 
que degrada ampicilina 
Seqüência “polylinker” ou “multiple-cloning-site” (MCS) que inclui uma cópia 
do sítio de reconhecimento para cada uma das 10 enzimas indicadas 
Plasmídeo UC19 
O sítio de clonagem consiste de uma seqüência de nucleotídeos que 
corresponde a sítios de interação com enzimas de restrição, e que é 
adicionada ao vetor por engenharia genética. 
Para clonar, escolhemos uma enzima que corte em um ou dois destes locais. 
SÍTIO DE CLONAGEM 
Ligação de fragmentos de restrição com 
extremidades coesivas 
As ligases usadas no laboratório: 
 
• T4 DNA ligase: 
 produzida pelo bacteriofago T4 
 liga tanto extremidades coesivas, 
 como extremidades cegas. 
 
• DNA ligase de E. Coli: 
 liga apenas extremidades coesivas 
 
Se a ligação no vetor é feita após a digestão com enzimas de restrição que 
produzem extremidades cegas (blunt ends), ou se o vetor foi linearizado com 
apenas uma endonuclease de restrição, é necessário desfosforilar a 
extremidade 5’-P do vetor, para evitar auto-ligação. 
 
 
Enzima: Fosfatases 
 
Removem grupos fosfato da extremidade 5’ das moleculas de DNA, 
substituindo-os por -OH. 
Digestão do vetor para clonagem 
Vetor cortado com uma única enzima que corta no ponto “a”: 
O vetor ficará com as extremidades (a) e (a’) que são compatíveis. Ao ser adicionada a 
ligase, o vetor será novamente fechado, sem inserto. 
Para que isso não ocorra, é preciso usar fosfatase, que remove o P da extremidade 5’ 
a b 
a b Se duas enzimas distintas forem usadas para 
abrir o vetor, as extremidades se tornam 
incompatíveis. Ele não é fechado pela ligase. 
O DNA a ser inserido deve ser cortado com as mesmas duas 
enzimas, para ter extremidades compatíveis com o vetor. 
Que tipo de fragmento de DNA podemos inserir em um vetor: 
 
• O DNA a ser inserido tem que ser dupla-fita. 
 Enzimasde restrição só cortam DNA dupla-fita. 
 
• O fragmento de DNA pode ser : 
• cDNAs sintetizados as partir de mRNAs 
• Produto de digestão de DNA genômico com endonucleases de restrição 
• Produto de PCR 
• DNA dupla fita de qualquer origem 
 
Os fragmentos de DNA a 
serem clonados são 
cortados com as 
mesmas enzimas 
utilizadas para linearizar 
(abrir) o vetor 
Após a obtenção do plasmídeo recombinante contendo a sequência de 
interesse, o próximo passo é colocá-lo na bactéria. 
Esse processo é denominado transformação. 
 
A transformação é um processo ineficiente, porém eficiente o bastante para 
nossos propósitos. 
 
Tipicamente, de 109 células em contato com 1 ug de plasmídeo (~ 1011 
moléculas), apenas aprox. 105 receberão o plasmídeo (1: 106) 
 
Como a probabilidade de uma célula captar um plasmídeo é baixa, a 
probabilidade de uma célula captar dois ou mais é extremamente baixa. 
Inserção do plasmídeo em bactérias: 
 
• Choque térmico (bactérias tornadas “competentes”) 
 
• Eletroporação (bactérias normais, em meio de baixa força iônica) 
 
Seleção das bactérias transformantes 
(marcador de seletividade) 
• resistência a antibiótico 
 
Seleção das bactérias transformadas com plasmídeos 
recombinantes: 
• alfa complementação do gene da betagalactosidase 
(colônias azuis ou brancas) 
Transformação das bactérias 
Ao transformar as bactérias, cada uma receberá um único plasmídeo. 
 
Cada clone de bactérias terá um único plasmídeo. 
Assim os fragmentos que antes estavam misturados, agora estão individualizados 
O fragmento  da betagalactosidase (LacZ’) 
é codificada pelo plasmídeo. 
 
A inserção do DNA a ser clonado interrompe 
a sequência do LacZ’. “pUC plasmid”- genérico 
Lac repressor Repressão removida 
por IPTG 
Fragmento Ω da 
betalactamase é produzido 
pela bactéria 
 
α-complementação 
 
lacZ´ inteiro  (α)  +  Ω: 
Betagalactosidase ativa 
Cliva X-gal 
Colônias azuis 
 
Laz´ segmentado 
Betagalactosidase Ω inativa 
Colônias brancas 
 Genomic 
Relaxed 
Supercoiled 
Purificação do plasmídeo 
Quando usar plasmídeos: 
São utilizados para clonagem de fragmentos relativamente pequenos (no máximo 20 kb) 
São de fácil manuseio 
Existem vários tipos de plasmídeos comercialmente disponíveis, cada um com vantagens 
e aplicações específicas: 
 vetores para síntese de RNA e proteínas (vetores de expressão) 
 vetores com genes repórteres 
 plasmídeos para produção de “proteínas de fusão” 
 etc 
Vetores plasmídeos para transfecção de células eucariotos: 
 
São vetores usados para expressar genes clonados em células animais ou vegetais. 
Estes vetores possibilitam a expressão de genes tanto em bactérias como em 
eucariotos. 
 
- Para replicação em bactérias, carregam um replicon (origem de replicação) 
bacteriano e um gene de resistência a antibiótico. 
 
- Para propagação em eucariota, carregam um promotor viral e um “enhancer” 
localizados à 5’ da região codificante do gene a ser clonado e um sítio de 
poliadenilação à 3’ do gene. Alguns também incluem um intron, antes ou depois da 
região codificante. 
 
No primeiro vetor eucariota utilizado, estes elementos foram provenientes do virus 
SV40. 
 
Uma vez inserido na célula, a proteína codificada no plasmídeo passa a ser expressa após 
algumas horas. Neste estágio, a maioria do DNA do plasmídeo inserido na célula é 
extracromossomal. Após vários dias, algumas moléculas de plasmídeo se integram no 
genoma de raras células. 
Vetores de expressão 
Vetores de expressão típicos têm: 
 
• Promotores – que dirigem a síntese de grande quantidade de mRNA do gene 
que se quer expressar 
• Sequências que permitam a replicação autônoma em bactéria (origem de 
replicação) 
• Seqüências que codificam traços genéticos que possibilitam reconhecer as 
células que contêm o vetor 
• Seqüências que aumentam a eficiência da tradução do RNA 
 
Expressão de proteínas recombinantes: 
 
Expressão em E. coli 
 Vantagem: simplicidade e baixo custo 
 
Expressão em células eucariotas 
 Vantagens: quase sempre as proteínas são expressas no 
 compartimento subcelular correto e corretamente processadas. 
 Desvantagem: difícil produzir em larga escala (células de mamíferos, por ex.) 
 Produção em levedura é eficiente 
Expressão da proteína recombinante em procariotas: 
 
Clonar o cDNA a partir de mRNA processado, pois é preciso lembrar que bactérias não 
removem introns. Retirar também as regiões 5’UTR e 3’UTR. 
 
Adicionar a seqüência Shine Dalgarno (AGGAGG, 5 a 12 bases antes do ATG), para 
expressão em procariota. Esta seqüência contribui para localização da metionina 
inicial. 
 
ATG inicial – que codifica uma formil-metionina em bactérias, pode eventualmente ser 
removida, apenas se o segundo amino ácido for um amino ácido com cadeia lateral 
pequena. Leucina deve ser evitada nesta posição. 
 
STOP codon 
 
A seqüência de Shine-Dalgarno é favorece a atividade ótima dos ribossomos 
Expressão em procariota (E. coli) 
Codon usage: 
 
A diferença entre o uso do código (“codon usage”) pode ser um motivo 
para expressão ineficiente em procariotas. Codons que são muito 
raramente usados em E. coli correspondem a poucas moléculas do tRNA 
específico. Isso torna a síntese de uma proteína eucariota muito 
ineficiente em E.coli. 
 
Solução: 
Fazer co-expressão dos tRNAs raros 
Modificar o codon, para um codon mais comum em E.coli, preservando o 
amino ácido. 
Promotor: 
A transcrição do gene alvo em procariotas é controlada por dois sistemas básicos: 
 
• tac promoter, reconhecido pela RNA polimerase de E. coli 
 
• T7 promoter de bacteriofago, reconhecido pela T7 RNA polimerase (este tem a 
vantagem de propiciar uma expressão muito baixa na ausência de indução). 
 
Inicialmente, o vetor com o cDNA a ser expresso é propagado numa bactéria que não tem o 
gene da T7 RNA polimerase. 
O plasmídeo recombinante é em seguida purificado e sequenciado. 
 
Em seguida, o plasmídeo já estabelecido é transferido para uma linhagem bacteriana que 
expresse o gene da T7 RNA polimerase. 
Os sistemas indutíveis são os mais adequados para expressão em E. coli 
porque altos níveis de proteína heteróloga podem ser letais para a 
bactéria. 
 
Os vetores ideais para expressão em E. coli devem ter: 
- Um promotor indutível 
- O sinal de término de transcrição 
- Um “enhancer” – opcional 
- Um stop codon 
- Gene de resistência a antibiótico 
- Origem de replicação que determina o número de cópias do plasmídeo 
na célula. 
 
Sistema de indução em E. coli: 
 
Lac repressor / Análogo da lactose (IPTG) 
Proteínas expressas em E. coli frequentemente formam agregados protéicos, 
denominados corpos de inclusão. 
 
Isso não costuma ser problema se o objetivo final é produzir proteínas para 
produção de anticorpos. No entanto, é problema se o que se deseja é uma análise 
funcional da proteína. 
 
Uma possível solução é expressar a proteína como proteína de fusão. Proteínas de 
fusão costumam ser mais estáveis que as proteínas nativas em E. coli. Além disso, 
é mais fácil purificar uma proteína de fusão. 
 
As fusões mais comuns são com: 
- GST (glutationa S transferase) e 
- segmento polihistidínico (tag de histidina) 
Vetores para expressão de proteínas de fusão 
Fusão com Glutationa S-transferase 
GST 
GST sua proteína 
Clivagem com trombina 
ou fator Xa Controle do Ptac 
26kd 
A proteína de 
fusão é purificada 
em coluna 
contendo 
glutationa. 
A proteína de fusão,sua proteína de 
interesse + GST, pode ser facilmente 
purificada em coluna contendo 
glutationa, o substrato da enzima GST. 
 
GST pode ser separada de sua proteína 
de interesse por digestão enzimática. Na 
região entre uma proteína e outra há 
sítio de clivagem para a trombina ou 
outra protease. 
 
O sistema é muito útil para isolar 
proteínas da célula que interagem com 
sua proteína de interesse. 
 
 
Expressão da proteína nativa em eucariotos: 
 
Para expressão de proteínas em eucariotos, é necessário adicionar 
imediatamente antes da região codificante da proteínas: 
 
• Seqüência Kozac (-- GCCACC ATG G -), para expressão em eucariota 
 
Além disso, deve ser adicionado: 
 
• ATG inicial 
 
• STOP codon 
 
Seqüência de Kozac: a introdução da sequência de Kozac facilita a 
identificação do ATG inicial pelos ribossomas em eucariotas 
Expressão em eucariotas 
Os vetores para expressão em eucariotos, possuem uma origem de replicação 
bacteriana e um gene de resistência a antibiótico para propagação inicial em 
bactérias. 
 
Para propagação em eucarioto, carregam um promotor e um “enhancer” 
localizados à 5’ da região codificante do gene a ser clonado e um sítio de 
poliadenilação à 3’ do gene. Alguns também incluem um intron, antes ou depois 
da região codificante. 
 
Os primeiros vetores para expressão em eucarioto tinham um promotor e um 
enhancer do virus SV40 
 
Muitos vetores têm um promotor do CMV. 
Um plasmídeo para expressão de proteína recombinante em 
eucarioto: 
 
PCMV: “enhancer-promoter” do Cytomegalovirus, que induz 
uma transcrição constitutiva e abundante do gene clonado 
sob seu controle em eucariotos. 
 
BGH pA: Sinal de poliadenilação do gene “Bovine Growth 
Hormone (BGH)” 
 
f1 ori: Origem de replicação para obter fitas únicas, sense. 
 
SV40 ori: Origem para replicação epissomal em célula 
eucariota. 
 
pUC ori: Origem para replicação em bactéria 
 
Resistência a Neomycin ou Zeocin: para seleção de células 
eucariotas. 
 
Resistência a Ampicilina: para seleção de bactérias (E. coli) 
Transfecção de células eucariotas 
 
Métodos de Transfecção: 
 
Transfecção por métodos bioquímicos 
 Precipitação de fosfato de cálcio 
 Lipídeos catiônicos 
 
Transfecção por métodos físicos 
 Microinjeção com partículas de ouro ou tungstênio 
 Eletroporação 
 
Transfecção mediada por infecção viral 
 
Eletroporação 
Lipofecção 
Microinjeção 
 
Indicado para 
células vegetais 
Transfecção transiente e estável: 
Transiente: 
O DNA recombinante é introduzido na linhagem celular receptora com o objetivo de 
obter uma expressão temporária porém elevada do gene de interesse. 
A proteína codificada pelo cDNA transfectado é detectada na célula após algumas 
horas. Neste estágio, a maioria dos plasmídeos recombinantes é extracromossomal, 
mas após vários dias algumas moléculas do vetor se integram no genoma da célula. 
 
Estável: 
Usada para estabelecer linhagens celulares nas quais o gene transfectado está 
inserido no DNA cromossomal, onde ele comanda a síntese de quantidades 
moderadas da proteína alvo. 
O isolamento dos raros transformantes estáveis de um background de células não 
infectadas é facilitado pelo uso de marcadores genéticos para seleção. 
(Resistência a Neomycin, Zeocin, Hygromycin) 
 Retrovirus: o genoma é um RNA fita única. 
 É convertido em DNA dupla fita dentro da célula infectada. 
 O DNA dupla fita se integra no cromossomo da célula hospedeira como genoma proviral. 
 O provirus continua a transcrever seu genoma inteiro, o qual codifica todas as proteínas 
necessárias para fazer novos virions. 
 
LTR LTR genes virais 
 gag pol env 
LTR  tandem long terminal repeats, importantes para mediar a integração do provirus e 
para regular a transcrição. 
 
O retrovirus para expressão de proteínas clonadas não tem seus próprios genes preservados 
As células infectadas não produzem partículas virais Células de empacotamento produzem partículas 
virais com RNA viral contendo o gene de interesse 
Técnica de clonagem para estudo de promotores 
+1 
Vários segmentos do promotor são inseridos em 
vetor com gene repórter 
A transcrição do gene repórter será comandada pelos 
diferentes segmentos do promotor em análise 
A proteína produzida a partir do mRNA é quantificada: 
quanto mais eficiente for o segmento do promotor, maior 
a quantidade de proteína produzida 
São removidos promotor/enhancer que 
controlam a transcrição do gene da Luciferase. 
Obtem-se o vetor abaixo para estudo de 
promotores: 
No sítio de clonagem é introduzido o fragmento de 
DNA correspondente ao promotor do gene que se 
quer estudar. 
 
O vetor recombinante é transfectado para células 
eucariotas que normalmente expressam a proteína 
de interesse. 
Gene que codifica 
Luciferase, que é a proteína 
repórter 
Medida da atividade de luciferase 
Técnica de clonagem para identificação de proteínas que 
interagem umas com as outras no interior da célula: 
 
Two-hybrid system 
Estes experimentos são realizados em leveduras. 
A linhagem de levedura é transformada com o plasmídeo recombinante que produz a proteína-
isca fusionada com o módulo protéico que interage com o DNA na região do promotor. 
É construída uma biblioteca do 
tecido no qual se quer procurar 
proteínas (presa) que interagem 
com a proteína-isca . 
 
Esta biblioteca é construída de 
modo que todos os genes são 
expressos na forma de proteína 
de fusão com o módulo de 
transativação do fator de 
transcrição, cujo módulo de 
interação com o DNA está ligado 
à proteína isca. 
 
Quando isca e presa interagem o 
gene repórter é ativado. 
Um grande número de “ORFs” 
(open reading frames) têm sido 
interrompidas com a finalidade de 
obter informações sobre a função 
das proteínas que codificam. 
Knockout de genes de levedura 
Knockout 
Camundongo “knockout” 
ZFN mRNA targeted 
Detecção das células mutadas 
Camundongo transgênico