AULA_8_BACTERIÓFAGOS

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BIOLOGIA MOLECULAR
ACH5564-2022
Prof. Luiz Paulo Andrioli
AULA_8- BACTERIÓFAGOS
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VÍRUS
• Virion = partícula viral = forma infectante (fora da célula);
• Composição: material genético (DNA ou RNA) + 
 capsídeo (revestimento de proteína);
• Unidade de organização é o capsômero (formado por 1 ou 
mais tipos de proteínas diferentes); 
• Nucleocapsídeo= material genético + capsídeo 
 (vírion sem envelope);
• Os vírus são “nus”, ou possuem um envelope (camada 
lipídica obtida do hospedeiro).
VÍRUS
• Estruturalmente simples: ácido nucleico e uma cápsula 
proteica em torno do material genético (capsídeo). 
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• Entidades biológicas inativas fora de células hospedeiras;
• Entidades que necessitam de células hospedeiras para sua 
reprodução;
• Parasitas intracelulares obrigatórios;
BACTERIÓFAGOS
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• Os bacteriófagos são vírus que utilizam bactérias como células 
hospedeiras;
• São vírus que apresentam características diferentes daquelas 
dos vírus que infectam eucariotos;
• Isso porque as células hospedeiras lidam de forma diferente 
com aspectos, por exemplo, de transcrição e tradução.
BACTERIÓFAGOS
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• Capsídeo dividido em cabeça (onde 
está o DNA) e cauda de onde saem e 
fibras laterais (utilizadas na adesão e 
penetração).
• O bacteriófago T7 é um dos mais 
estudados e melhor conhecido; 
• Seu genoma é uma molécula de DNA 
dupla fita (unifilamentoso) linear;
• Exibe apenas ciclo lítico. 
BACTERIÓFAGOS
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• Fago λ
• DNA dupla fita unifilamentoso 
linear e ciclo lítico e lisogênico
• Fago φχ174
• DNA simples fita
• circular
• Fago M13
• DNA simples fita 
circular
• Fago MS2
• DNA simples fita
• linear
BACTERIÓFAGOS
Às custas de bactérias.
• Longa tradição em pesquisa, desde os anos 40 do
século XX;
• Papel central nos estudos de genética clássica, 
com advento da biologia molecular foram 
transformados em vetores, importantes 
ferramentas moleculares; 
• Isso porque têm genomas pequenos, são
facilmente manipuláveis, reprodução rápida e
geração de grande quantidade de descendentes;
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BACTERIÓFAGOS
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• História evolutiva de 3 bilhões de anos; 
• Quantidade de bacteriófagos estimada na biosfera é de 1031! 
• Os bacteriófagos apresentam grande variedade de formas e “estilos 
de vida” (líticos ou temperados);
• Mesmo quando restritos a uma única espécie como dos bacteriófagos 
que infectam linhagens da bactéria E. coli. 
BACTERIÓFAGOS
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BACTERIÓFAGOS
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• CICLO LÍTICO
VÍRUS
BACTERIÓFAGO T7
• São fagos de DNA dupla fita linear, líticos;
• O genoma do fago T7 é grande, com 40 kbp;
• T7 codifica para 55 proteínas, sendo 11 proteínas 
estruturais;
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• As outras proteínas participam de processos básicos como: 
• Enzimas para replicação e transcrição viral, por exemplo;
• E outras que atuam para controlar esses processos 
(proteínas reguladoras);
• Incluindo proteínas que interferem com o funcionamento 
celular, 
• Anulando suas funções ou subvertendo-as para os 
processos virais. 
BACTERIÓFAGO T7
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• A organização e o funcionamento do genoma viral está em acordo com os 
mecanismos moleculares da bactéria;
• Por exemplo, os genes virais codificam RNAms típicos de bactérias com 
sequência Shine-Delgarno, viabilizando a utilização de todo aparato de 
tradução celular. 
• Genes com funções relacionadas estão agrupados em unidades funcionais 
(policistrônicas);
• No fago T7 os genes estão agrupados em 3 classes;
• Os genes de cada classe são transcritos e traduzidas simultaneamente;
• As classes geram 3 ondas sucessivas de transcrição; 
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BACTERIÓFAGO T7
• A transcrição do genoma viral que é inicialmente realizada pela RNA polimerase 
celular, é simultânea a entrada do genoma no citoplasma; 
• Por isso, a ordem de localização das classes no genoma ou mesmo dos genes em 
cada classe, segue a lógica da necessidade temporal desses produtos no ciclo 
viral;
• Que por sua vez é determinada pela região que vai ingressando no citoplasma 
da célula; 
• A região da classe 1, por exemplo, está numa extremidade do genoma que é a 
primeira região do genoma a ser transcrita ao ingressar no citoplasma; 
• A 1ª onda de expressão é transcrita pela RNA polimerase bacteriana; 
• Genes da 1ª onda codificam para proteínas reguladoras que interferem com o 
genoma hospedeiro e outras que são necessárias para a expressão dos genes da 
2ª onda; 
• Uma das proteínas da classe 1 é a RNA polimerase T7;
• A T7 polimerase transcreve os genes das 2ª e 3ª ondas;
• A 2ª onda inclui proteínas não estruturais necessárias para a replicação viral e 
expressão dos genes da 3ª onda; 
• A 3ª onda é composta por proteínas estruturais, expressas ao mesmo tempo em 
que é realizada a replicação do genoma viral. 
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BACTERIÓFAGO T7
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BACTERIÓFAGO T7
• A 2ª e 3ª classes são transcritas pela 
polimerase do fago que reconhece sequências 
no promotor das duas classes; 
• Os promotores da 1ª classe são transcritos 
pela polimerase da bactéria, e possuem 
sequências otimizada para essa polimerase;
• Os genes da 2ª classe são transcritos antes porque 
essa classe ingressa antes no citoplasma;
• Os genes da 3ª classe são preferencialmente 
transcritos quando disponíveis, porque seus 
promotores têm maior afinidade pela polimerase 
do fago. 
• A DNA polimerase do fago T7 (gp5) é uma 
enzima extremamente eficiente formada 
por uma única subunidade; 
• Assim como a maquinaria de replicação do 
fago T7 é das mais simples conhecidas, 
dependo de 3 proteínas codificadas por ele 
e de outras poucas proteínas da bactéria; 
• A proteína viral gp4, por exemplo, realiza 
funções de helicase e primase;
• Realizadas por várias subunidades celulares 
mesmo em bactérias;
• A gp2.5 é uma proteína ligadora de DNA fita 
simples;
• e a Trx é uma proteína celular cooptada 
utilizada como “clamp” para a DNA 
polimerase. 
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BACTERIÓFAGO T7
• O genoma linear como do fago T7 gera um problema para a 
replicação;
• Extremidades da fita descontínua ficam menores;
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BACTERIÓFAGO T7
• Esse problema no fago T7 é resolvido uma sequência idêntica em cada 
extremidade (repetições diretas) compostas por 160 pbs;
• Essas repetições geram extremidades incompletas/ salientes de cada lado 
do após replicação do genoma linear;
• Que são complementares e possibilitam os genomas se associarem. 
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BACTERIÓFAGO T7
• Por serem complementares, 
• Os genomas se ligam e formam concatâmeros; 
• Que são separados por clivagem antes do empacotamento no 
capsídeo. 20
BACTERIÓFAGO T7
BACTERIÓFAGO λ
• O fago λ (lambda) é maior do que o fago T7 (cauda mais longa);
• Seu genoma tb é maior, em torno de 50 kpb,
• Codifica para 73 proteínas, sendo que para 59 delas se conhece a função;
• Dessas, 14 são proteínas estruturais; 
• Muitas proteínas reguladoras, ciclo mais complexo;
• São fagos temperados, e codificam proteínas necessárias para a integração. 21
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• CICLO DE VIDA
VÍRUS
Fago temperadoFago virulento
BACTERIÓFAGO λ
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• No vírion, o genoma dupla fita está na forma linear;
• Assim que o vírion completa a infecção;
• O genoma é circularizado;
• Isso porque as extremidades são salientes;
• Extremidades protuberantes (simples fita) complementares 
(cos).
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BACTERIÓFAGO λ
• A replicação do fago λ ocorre em duas etapas;
• Inicialmente a replicação é bidirecional a partir de uma 
origem de replicação do genoma circularizado;
• O que origina uma forma θ intermediária, semelhante à 
replicação do DNA bacteriano; 
• O fago subverte basicamente toda maquinaria de replicação da bactéria;
• Mas duas de suas proteínas são fundamentais: proteína O que reconhece sua 
origem de replicação e a proteína P que recruta a helicase e atraca na origem. 
• Após rounds sucessivos da replicação θ, o fago λ muda para o mecanismo 
rolling-circle;
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BACTERIÓFAGO λ
• Que tem início com a quebra de uma cadeia (picote/ nick); 
• A extremidade 3’ livre é 
utilizada como primer e a outra 
fita como molde;
• A extremidade 5’ da cadeiaoriginal é afastada e puxada 
para fora;
• Ela tb passa a ser molde para 
geração da outra cadeia; 
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BACTERIÓFAGO λ
• A titulação de uma proteína bacteriana, DnaA, que reconhece sítios 
no DNA do fago e da bactéria, está implicada na passagem de um 
mecanismo de replicação para o outro. 
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BACTERIÓFAGO λ
• As várias cópias do genoma viral replicadas a partir de uma origem de 
replicação;
• São ligadas e mantidas unidas (concatenadas);
• Até o momento do empacotamento quando são processadas nos 
sítios cos; 
• A geração dos vírions se faz por montagem no citoplasma da bactéria; 
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BACTERIÓFAGO λ
• Outros fagos usam um processo no qual a síntese de DNA é 
utilizada para introduzir o genoma no capsídeo auxiliado por 
proteínas que promovem o empacotamento do genoma. 
• Nos fagos icosaédricos, o genoma é inserido em um procapsídeo icosaédricos 
vazio; 
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BACTERIÓFAGO λ
• No fago λ, um motor de empacotamento utiliza 
ATP para direcionar as alterações 
conformacionais necessárias para introduzir e 
acomodar o DNA no capsídeo;
• Diferentes estratégias para transferir uma única cópia 
do concatâmero;
• O fago λ possui sequências utiliza as sequências cos 
reconhecidas pelo motor e utilizadas para clivadas 
para introdução de uma cópia íntegra do genoma. 
cos
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BACTERIÓFAGO λ
• A eliminação das bactérias ocorre por lise celular;
• Rompendo o envoltório de bactérias Gram 
negativas como E coli formado por;
• Membrana citoplasmática, camada de 
peptidioglicanos e membrana externa;
• São sucessivamente atacadas por 
diferentes enzimas do fago;
• Sintetizadas sucessivamente na 3ª onda de 
expressão. 
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• Alguns vírus causam infecções persistentes;
• Que pode ser do tipo latente, ou seja, o vírus entra em estado 
“inerte”, saindo de um ciclo lítico. 
• A latência do fago λ (ciclo lisogênico);
• Significa sua integração no genoma da bactéria;
• A integração do caso do fago λ;
• Ocorre por uma forma de recombinação homóloga;
• Chamada de recombinação específica porque envolve sítios 
específicos de recombinação. 
BACTERIÓFAGO λ
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BACTERIÓFAGO λ
• A recombinação é feita entre os sítios attP (fago) e attB (da bactéria);
• Cada um desses dois sítios possui três regiões;
• Sendo a região central (O) homóloga entre attP e attB;
• Criando novas combinações de sequências durante a integração e geração do 
profago;
• Não impedindo a reversibilidade da 
reação;
• Ou seja, o fago é integrado e se 
transformado em profago ou 
excisado para entrada no ciclo lítico 
pelo mesmo mecanismo.
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• A integração e excisão são mediadas 
pela recombinase do fago, a 
integrasse;
• Que atua como uma topoisomerase;
• Mas ligando cadeias de moléculas 
diferentes;
• Além da proteína da IHF da bactéria;
• Para a excisão tb é necessária a 
proteína Xis do fago;
• Essas proteínas formam um complexo 
denominado intassomo. 
BACTERIÓFAGO λ
• O fato do fago λ ser capaz de transitar 
entre o ciclo lítico ou o ciclo lisogênico;
• Torna a regulação do ciclo do fago λ mais 
complexa do que a do fago T7;
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BACTERIÓFAGO λ
• Que pode ser melhor compreendida 
focando na região controladora do 
genoma;
• Os genes do fago λ tb estão agrupados 
funcionalmente;
• E tb, três ondas de transcrição acionam o 
genoma no ciclo lítico;
• Constituída pela classe dos genes expressos 
imediatamente cedo (immediate early), 
genes precoces (early) genes tardios (late);
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BACTERIÓFAGO λ
• Diferente do fago T7, o fago λ utiliza exclusivamente a RNA polimerase celular 
para transcrever seu genoma;
• Outra diferença entre os fagos é a de que o fago λ tb utiliza o mecanismo de 
antiterminação na regulação transcricional. 
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BACTERIÓFAGO λ
• A 1ª onda de expressão, immediate early, serve tanto para o ciclo lítico quanto 
para o ciclo lisogênico; 
• A RNA polimerase da bactéria reconhece dois promotores, PL (promotor da 
esquerda);e PR (promotor da direita);
• Iniciando respectivamente a transcrição de dois genes, N e cro;
• O promotor PR’ tb é reconhecido pela polimerase celular, mas a transcrição 
gera um RNA curto que termina em TR4;
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BACTERIÓFAGO λ
• PR transcreve o gene cro que codifica para uma proteína repressora;
• Por ser um fator de transcrição, precisa se ligar no DNA para atuar;
• No entanto, a forma funcional depende de um tetrâmero;
• A geração de 4 unidades a partir de um promotor fraco gera um 
atraso no seu funcionamento em relação ao produto do gene N; 
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BACTERIÓFAGO λ
• O promotor PL transcreve o gene N;
• Que codifica para uma proteína de antiterminação prontamente 
utilizada após sua síntese; 
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BACTERIÓFAGO λ
• A proteína N promove a continuidade da transcrição nos sítios TL1 e 
TR1 dos transcritos sintetizados nos promotores PR e PL;
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BACTERIÓFAGO λ
• A proteína N reconhece sítios nut nas alças de parada da transcrição 
dos RNAms formados nos términos de transcrição TL1 e TR1 e; 
• Recruta proteínas celulares;
• E possibilita a RNA polimerase continuar a transcrição. 
• A extensão dos transcritos sintetizados a partir de PR e PL , marca a entrada na 
2ª onda de expressão; 
• Com genes necessários para a integração do fago (ciclo lisogênico), policistron 
da esquerda;
• Ou genes necessários para a replicação viral (ciclo lítico), policistron da direita 
(genes cII, O, P);
• Até esse momento, existe uma indefinição em favor da entrada no ciclo lítico 
ou no ciclo lisogênico. 
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BACTERIÓFAGO λ
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BACTERIÓFAGO λ
• A ação de N também estende a transcrição em TR2 e um policistron 
incorpora o produto do gene Q;
• Que também codifica para uma proteína antiterminação;
• Embora nesse caso, Q atua de forma diferente de N;
• Ligando-se no DNA antes de interagir com o complexo de 
antiterminação e a RNA polimerase;
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BACTERIÓFAGO λ
• A proteína antiterminação Q também possibilita 
a RNA polimerase continuar a transcrição em TR4 
a partir de PR’;
• E um longo policístron contendo os genes 
estruturais e de lise são transcritos (3ª onda); 
• Havendo comprometimento com o ciclo lítico!
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BACTERIÓFAGO λ
• Paralelamente, o aumento da concentração do fator de transcrição Cro;
• Torna possível sua interação com operadores e a repressão da transcrição de 
CII e CIII respectivamente a partir de PL e PR;
• E tb do promotor PRM, essencial para transcrever o gene cI, que codifica o fator 
de transcrição λ;
• Fundamental para a entrada no ciclo lisogênico. 
• O início do ciclo lisogênico é compartilhado com o início do ciclo lítico;
• Gerado pela transcrição constitutiva da RNA polimerase na 1ª onda de 
expressão; 
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BACTERIÓFAGO λ
• E também pelo início da 2ª onda de expressão desencadeada pelo fator 
antiterminação N; 
• Que continua expressando cro e inicia a expressão de Q; 
• Assim como os produtos dos genes cII e cIII; 
• Que atuam para a lisogenia;
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BACTERIÓFAGO λ
• CII é um fator de transcrição fundamental para a lisogenia;
• Mas instável porque suscetível a uma regulação negativa 
da célula (pelo fator celular Hfr);
• Se não for suficientemente protegido pela proteína CIII do 
fago. 
• O fator de transcrição CII atua como ativador em três promotores;
• No promotor PantiQ que vai gerar um RNA antisenso reconhecedor do RNAm de 
Q;
• E impedir a transcrição dos genes estruturais;
• Vai atuar tb no gene int e xis necessários para integração do fago no genoma 
celular;
• E vai estabelecer a expressão de cI a partir do promotor PRE;
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BACTERIÓFAGO λ
• O promotor PRE (promotor de estabelecimento da expressão de cI);
• Inicia a expressão do fator de transcrição λ;
• Que vai desligar a expressão de PL e PR;
• Ao mesmo tempo vai iniciar o processo de transcrição PRM (promotor de 
manutenção da expressão de cI); 
• Que é o promotor responsável pela sua autorregulação;
• Mantendo o fago no ciclo lisogênico. 
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BACTERIÓFAGO λ
• Um balanço sutil na concentração dos fatores de transcrição 
Cro, CI, CII e λ;
• São, em última instância, os fatores determinantes para a 
entrada no ciclolítico ou no ciclo lisogênico; 
• E o fator CIII, que determina a concentração de CII, é um 
ponto crucial na definição dessa decisão;
• Que por sua vez, depende dos genótipos do fago da bactéria;
• E das condições da infecção. 
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BACTERIÓFAGO λ
• Em condições nutricionais para bom crescimento celular, protease da célula 
degrada CII e o vírus entra no ciclo lítio;
• Em condições de estresse celular, proteína CIII estabiliza CII e o vírus entra no 
ciclo lisogênico. 
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BACTERIÓFAGO λ
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	VÍRUS
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